一种花药特异表达启动子pRsSWEET15.1及其应用

一种花药特异表达启动子prssweet15.1及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程与分子生物学领域，具体涉及一种花药特异表达启动子prssweet15.1及其应用。


背景技术：

2.启动子是能够被rna聚合酶识别、结合进而启动基因转录的一段dna序列，一般位于基因上游。一个典型的启动子包含位于转录起始位点上游几十个碱基处的caat-box和tata-box，在核心启动子上游通常会有顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的表达。根据转录模式可将启动子分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。
3.花椰菜花叶病毒35s启动子(camv35s)是植物基因工程中应用最广泛的组成型启动子之一，在所有组织中均驱动基因的表达而不受外界条件影响，被广泛应用于转基因植物。然而，持续过量地表达目的基因可能会造成植物能量的过度消耗而影响其正常的生长发育(kummari et al.，2020)。诱导型启动子驱动目的基因表达受外界信号的影响，相对于组成型启动子可能带来的不利影响，诱导型启动子可以根据外界刺激调整目的基因的表达水平，不但减少正常条件下植物体内的能量消耗，而且可以避免基因过量表达对植物产生的负面效应。组织特异性启动子调控目的基因在特定的组织或器官中表达，对于研究植物特定组织器官的发育、培育特定组织或器官中表达外源基因的转基因植物均有重要意义，可有效避免使用组成型启动子而对受体植物造成的代谢负担等负面效应。因此，分离和鉴定植物中的诱导型启动子和组织或器官特异性启动子是植物基因工程的研究热点之一。
4.十字花科植物由于花器官较小，杂种一代的生产主要使用不育系及与之配套的保持系和恢复性。近年来，通过基因工程手段调控植物花粉育性、创造植物雄性不育系及其恢复系在一些作物上已获得成功。基因工程技术创造雄性不育材料的主要策略是利用在花粉或花药中特异表达的启动子与外源基因融合，转化植物来阻断花粉、花药的发育、或抑制花药的开裂，从而达到雄性不育的目的；此外，通过对花粉或花药发育特定基因的抑制或过表达，也可恢复不育系的育性。而植物花粉或花药启动子的启动活性与特异性直接决定了上述过程的成败。
5.萝卜是重要的十字花科蔬菜作物，花药与其杂交育种及种子产量形成关系密切。目前虽有已公开的植物花药特异性启动子，如水稻posft1(cn108070595a)、pv4(cn107099531a)、osanth3(cn105671049a)，小麦ptaasg036(cn104975022a)，番茄ps1np(cn110643608a)，大白菜asp2(cn108753777a)、芝麻psicwinv1(cn106906212a)等。但总体来说数目还相对较少，而萝卜花药特异性表达启动子的克隆和功能分析尚未见有研究报道，限制了人们对花药性状的改良进程。因此，分离鉴定萝卜花药特异性启动子对我国萝卜育种具有重要意义。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可以有效驱动外源基因在花药中特异性表达的启动子。
7.本发明还提供了所述启动子prssweet15.1在花药特异表达中的应用。
8.技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种花药特异表达启动子prssweet15.1，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明所述用于体外扩增prssweet15.1启动子的引物，其序列如seq id no.2-3所示。
10.本发明所述的表达启动子prssweet15.1或所述的含有rssweet15.1启动子的重组表达载体的基因试剂盒。
11.本发明所述rssweet15.1启动子的重组表达载体。
12.进一步地，所述的重组表达载体的构建包括如下步骤：
13.(1)使用speedycut hind iii和nco i对pcambia3301质粒进行双酶切，去除载体gus基因前的camv35s启动子，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切后的大片段载体；
14.(2)将胶回收获得的纯化的rssweet15.1启动子片段与线性化的pcambia3301载体进行连接，用rssweet15.1启动子代替pcambia3301载体camv 35s启动子，从而完成重组表达载体prssweet15.1::gus的构建。
15.本发明所述的启动子在花药特异表达中的应用。
16.本发明所述的重组表达载体在花药特异表达中的应用。
17.本发明所述花药特异表达启动子prssweet15.1或所述rssweet15.1启动子的重组表达载体或所述基因试剂盒在制备转基因植物中的应用。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
19.本发明筛选到一种全新的启动子(rssweet15.1启动子)可以有效驱动外源基因在花药中特异性表达的表达水平，为后续对萝卜花药基因编辑的相关研究奠定了基础。
附图说明
20.图1为
‘
心里美’萝卜叶片dna提取(m：dna marker(dl2000)，1-3：萝卜dna)；
21.图2为rssweet15.1基因启动子克隆，m：dna marker(dl2000)，1-2：rssweet15.1基因启动子克隆条带；
22.图3为rssweet15.1基因启动子克隆胶回收检测，m：dna marker(dl2000)1-2：rssweet15.1基因启动子胶回收条带；
23.图4为pcambia3301质粒双酶切检测；
24.图5为pcambia3301质粒胶回收；
25.图6为prssweet15.1::gus重组表达载体菌液pcr检测，m：dna marker(dl2000)；
26.图7为prssweet15.1::gus重组表达载体农杆菌菌液pcr检测，m：dna marker(dl2000)；
27.图8为basta筛选拟南芥转基因植株；
28.图9为转基因拟南芥的pcr鉴定，m：dna marker(dl2000)1：阴性对照；2-14：转基因拟南芥株系；
29.图10为gus基因的组织化学染色结果，其中：a代表7d苗龄拟南芥植株；b代表叶片；c代表花序；d代表雄蕊；e代表角果。
具体实施方式
30.以下结合实施例对本发明作进一步说明。
31.大肠杆菌感受态细胞dh5αchemically competent cell和农杆菌感受态细胞gv3101均购自上海唯地生物技术有限公司，植物双元表达载体pcambia3301可以商业购买，由申请人导入大肠杆菌中保藏。
32.质粒小提中量试剂盒、大量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒和植物基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，ii one step cloning kit、2
×
taq master mix(dye plus)和dl2000 dna marker(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、kod-plus-neo高保真酶(toyobo)、限制性内切酶speedycut hind iii和nco i、卡那霉素、利福平、草铵膦和琼脂糖(生工生物工程(上海)股份有限公司)，gus染色试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。
33.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
34.实施例1
35.植物材料
36.本研究使用的植物材料为
‘
心里美’萝卜高代自交系
‘
cchx17-6-12’(liu et al.，transcriptome analyses reveal key genes involved in skin color changes of
ꢀ‘
xinlimei’radish taproot,plant physiology and biochemistry,2019,139:528-539)由金陵科技学院提供，取其幼嫩叶片，洗净擦干后经液氮速冻后放入-80℃冰箱保存，用于后续dna的提取。以哥伦比亚型拟南芥(arabidopsis thaliana)作为受体材料，用于prssweet15::gus表达载体的遗传转化，使用人工光照培养箱进行拟南芥材料的培养。
37.实施例2
38.dna提取
39.使用植物基因组dna提取试剂盒进行
‘
心里美’萝卜高代自交系
‘
cchx17-6-12’基因组dna的提取，对dna质量进行了电泳检测并观察结果，电泳结果如图1所示，图中可以看到1-3泳道为本次所提取的dna，条带清晰，可用于启动子的克隆。
40.rssweet15.1启动子特异性引物设计
41.使用tbtools软件提取
‘
xin-li-mei’萝卜参考基因组中rssweet15.1的启动子序列，设计特异性引物，并在上下游引物上加与载体酶切位点两侧重叠的接头序列，用于rssweet15.1启动子序列的克隆和大肠杆菌的菌液pcr。引物序列如下：
42.rssweet15.1-prof：5
′‑
gacctgcaggcatgcaagctttgaagtttggtgttgtggttg-3
′
(seq id no.2)
43.rssweet15.1-pror：5
′‑
ttaccctcagatctaccatggaaagctctcgctctccctct-3
′
(seq id no.3)
44.此外，设计引物用于农杆菌的菌液pcr和转基因拟南芥的检测。设计的引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：
45.gus-f：5
′‑
caacgaactgaactggcaga-3
′
(seq id no.4)
46.gus-r：5
′‑
ctgtaagtgcgctggctgag-3
′
(seq id no.5)
47.rssweet15.1启动子目的片段的克隆
48.以提取的萝卜
‘
cchx17-6-12’dna为模板，以rssweet15.1-prof(seq id no.2)为上游引物，rssweet15.1-pror(seq id no.3)为下游引物，进行启动子目的片段的pcr扩增，pcr条件为94℃预变性2min；98℃变性10sec，60℃退火30sec,68℃延伸1min，35个循环，反应体系如下：
[0049][0050][0051]
pcr反应完成后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示。扩增产物约1870bp，扩增得到萝卜rssweet15.1基因启动子序列，如seq id no.1所示。
[0052]
seq id no.1:
[0053]
tgaagtttggtgttgtggttgaagaagaactctttttagtgctaaaattacactaaaataatgtggttttgaaacaaaaatagtgttatggattggagatgctcttagaaaagtttaggaccaagagagatagctagggggacaaacaaaaataacgaataagaacaagaatgatctaacaaacccatgatcattgttatcattcgcctatcacgtcactcctactttgtccatttcttcccacttttaaatatctgttttactttgccctcgaaaaacgcagaattgttttgtattttctcctaccttttttccaaaatattctgattcctttcatcatacatattgaaacaagtaaaacaagaaatcgtatattcaaattttcaacaaaaaaaaatgtatattcaatcagtcgttgaatacgtactgatgaatattaatacattggacatttaccaaaaatgatagatacatgcatcctcatttaaaaaaataactctggagttactgaaatcagatgttttaaccgttaaatttttctttgttacaaaattaaatatgagaaaatgatgggagtcctgaaaatggggattaaaacaggagaagaagagcagaaacagaatccataccgaagacacgaaagcatacagaagagagtgcccagtaggtatctgatgacgtggcatttagctctcgcgtgtctctctatcgtttggagaggtcacgtgatttcacaagattttcccttttcatgctattagtaataattacgcctctctcgtaacgcatcatcctttctgtttcattaattaactttagtcaattaatcattctcacgcgcaacgttcccttcgacgggtggagttttgcctaaaatgtgcatgatttaatctcttcttttgttacaaggcaaaaaaacgtgcgagtctatatacagagtactctgatcaggagatgtgaatggctttttcgactttggttaatcatagaaaataccataagtttaaagaaaacggcgtccattttctgcgtagagatgctttttactatgaattccgtaggttaacctaatcatcatctacaaatttctagctgttttagatctatactgattaatttcacctagactccttcacatatactaattcacaaaaaatatcactaattcattgtaagcaaatttgaaagtgtttagccaatgattagtcctgaaattctatgtttatattctaaactaggtcaatatttattgtatgattgtatccattaaatatataggtggatatgttggatcgtccaactcatatcatatgtgaactagaacatgaaaagatgaaaaaaaaaatattaatcgcattgtattctagtgatgatttcctgatttcctctatgttggttgattgttgggtagactcttaagtcaccatgaaattcatcaatcgtgtataaagtgtaaatttactatggttttaattttttttttgaaacttggttttaattgatttttgaaagctagtttaagaagatggcgtgaagaaaatgaagttgtggaagaaaaggagaagagtttagtgaatgataattgctacgctactgactaatttctccacttgtcatgcaaccaggctgagttcgttttcccttttcgattcttttttttttttcgattcttttttattttgtttt
attatactactaaacacgttacgcgattcaaataactttaaaaaatttaaatcaaaataatttgacaataatggttaccttggagctataaatacaccacctgagactcattagtttccaccatgaaataaaaagaagcatcttatagagagagagggagagggagagggagagcgagagcttt
[0054]
然后对目的条带进行胶回收，胶回收的电泳检测结果如图3所示，从图中可以看出成功回收目的片段，浓度较高、完整性好，可以用于后续载体构建。根据大量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(天根生化科技有限公司)的说明书进行目的片段的胶回收。胶回收的具体步骤如下：
[0055]
1)将500μl平衡液bl加入吸附柱中，12,000rpm离心1min，弃废液，完成柱平衡；
[0056]
2)从琼脂糖凝胶中切割目标dna条带，置于干净离心管中，称重；
[0057]
3)将等倍体积pn溶液(按凝胶重0.1g＝100μl计算)加入上述离心管，
[0058]
50℃水浴，在此过程中，不停地将离心管上下翻动，以保证胶块完全溶解；
[0059]
4)将所得溶液加入到吸附柱中，室温放置2min后12,000rpm离心30-60
[0060]
sec，倒弃废液；
[0061]
5)加600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30-60sec，弃废液；
[0062]
6)重复步骤5；
[0063]
7)12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。室温放置晾干。
[0064]
将吸附柱放入一个干净离心管中，将50μl洗脱缓冲液eb滴加到吸附膜上，室温放置2min后12,000rpm离心2min，收集dna溶液。
[0065]
rssweet15.1启动子表达载体的构建
[0066]
使用质粒小提中量试剂盒于含有植物双元表达载体pcambia3301的dh5α大肠杆菌中提取pcambia3301质粒，使用speedycut hind iii和nco i对其进行双酶切线性化处理，去除载体gus基因前的camv35s启动子，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图4所示。
[0067]
对回收酶切后的质粒大片段进行胶回收，胶回收的电泳检测结果如图5所示，从图中可以看出成功回收质粒片段，完整性好，可用于下一步载体的构建。
[0068]
根据ii one step cloning kit(诺唯赞生物公司)的操作说明，将胶回收获得的纯化的rssweet15.1启动子片段与线性化的pcambia3301载体进行连接，用rssweet15.1启动子代替pcambia3301载体camv 35s启动子，从而完成重组表达载体prssweet15.1::gus的构建。
[0069]
将重组表达载体转化大肠杆菌dh5α，于含有50mg/l卡那霉素的lb固体培养基中进行筛选，使用rssweet15.1-prof(seq id no.2)和rssweet15.1-pror(seq id no.3)引物进行菌液pcr、电泳检测，检测结果如图6所示。根据电泳结果筛选阳性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行sanger测序。测序正确后，根据质粒小提中量试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书进行重组质粒的提取。
[0070]
prssweet15.1::gus重组表达载体转化农杆菌
[0071]
为进一步研究rssweet15.1基因在植物体内的时空表达特性，我们将构建完成的重组表达载体prssweet15.1::gus采用冻融法转化农杆菌感受态细胞gv3101，挑取单克隆菌落摇菌，然后以菌液为模板，使用gus-f(seq id no.4)、gus-r(seq id no.5)为引物进行pcr，pcr反应液上样，进行凝胶电泳检测并观察结果，如图7所示，可以观察到清晰明亮的条
带，表明重组质粒已成功转化农杆菌gv3101。加甘油至终浓度15％，于-80℃冰箱保存，用于后续拟南芥的遗传转化。
[0072]
农杆菌介导的拟南芥遗传转化
[0073]
野生型拟南芥于光照培养箱22℃、16h(白天)/20℃、8h(黑夜)条件下培养至抽薹开花，采用花序浸染法进行拟南芥的遗传转化(clough et al.，1998)，操作步骤如下：
[0074]
1)在含有50mg/l卡那霉素和20mg/l利福平的液体培养基中，将含有目的质粒的农杆菌在28℃摇床中摇至od
600
＝0.8，于6000rpm离心8min收集菌体。
[0075]
2)用5％蔗糖溶液重悬菌体，调整od
600
至0.8左右。
[0076]
3)加入表面活性剂silwet l-77至终浓度300μl/l，即为侵染液。
[0077]
4)将浸染液置于烧杯中，使拟南芥植株的花序完全浸入浸染液中浸染1min。
[0078]
5)取出植株并用保鲜膜进行包裹，然后放入培养箱22℃暗培养，24h后揭去保鲜膜于光照条件下正常培养。
[0079]
6)为提高转化效率，第一次侵染后1周再侵染一次。
[0080]
7)3周之后待角果成熟后收取t0代种子。
[0081]
转基因植株的筛选和鉴定
[0082]
将t0代转基因拟南芥种子4℃春化3d后播种于育苗基质(草炭﹕蛭石＝2﹕1)，待子叶展开后，叶片喷施浓度为0.1mg/l basta进行筛选后成功获得13株阳性basta抗性植株，如图8所示，非转基因逐渐黄化，转基因植株正常生长。
[0083]
为了进一步明确rssweet15.1启动子是否成功转入拟南芥基因组中，将这13株生长正常的绿色幼苗移栽至基质中栽培，待筛选出的植株移栽并生长20d后，取植株幼嫩叶片，采用改良ctab法提取基因组dna，并使用gus-f(seq id no.4)、gus-r(seq id no.5)为引物进行pcr检测，以明确重组表达载体prssweet15.1::gus是否已经插入拟南芥基因组中，如图9所示，电泳检测结果显示获得9株转基因拟南芥。然后对这9株转基因植株进行自交纯化、筛选，获得t3代纯合株系。
[0084]
转基因植株的筛选和鉴定
[0085]
通过gus染色试剂盒分别对阳性转rssweet15.1启动子的t3代拟南芥植株不同组织进行gus组织化学染色。具体操作步骤为：随机选取3个阳性转rssweet15.1启动子的t3代拟南芥植株的不同组织置于2ml离心管中，加入gus染色液浸没组织块，37℃保温过夜；染色结束后，将染色组织置于70％乙醇漂洗脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色；最后在显微镜下观察染色处理过的组织块或组织块的切片，染成蓝色即表明gus基因在该组织表达。结果表明，如图10所示，仅在花序的花药中变蓝，gus基因只在转rssweet15.1基因启动子拟南芥的花药中特异性表达，而在根、叶、角果、蕾、花瓣等其他组织中均不表达。说明本发明的启动子rssweet15.1可用于启动目的基因在花药中特异性表达。

技术特征：
1.一种花药特异表达启动子prssweet15.1，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种用于体外扩增如权利要求1中所述启动子的引物，其序列如seq id no.2-3所示。3.一种含有权利要求1所述的rssweet15.1启动子的重组表达载体。4.一种含有权利要求1所述的表达启动子prssweet15.1或权利要求3所述的含有rssweet15.1启动子的重组表达载体的基因试剂盒。5.根据权利要求3所述的rssweet15.1启动子的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体的构建包括如下步骤：(1)使用speedycut hind iii和nco i对pcambia3301质粒进行双酶切，去除载体gus基因前的camv35s启动子，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切后的大片段载体；(2)将胶回收获得的纯化的rssweet15.1启动子片段与线性化的pcambia3301载体进行连接，用rssweet15.1启动子代替pcambia3301载体camv 35s启动子，从而完成重组表达载体prssweet15.1::gus的构建。6.一种权利要求1中所述的启动子在花药特异表达中的应用。7.一种权利要求3中所述的重组表达载体在花药特异表达中的应用。8.一种权利要求1所述花药特异表达启动子prssweet15.1或权利要求3所述rssweet15.1启动子的重组表达载体或权利要求4所述基因试剂盒在制备转基因植物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种花药特异表达启动子pRsSWEET15.1及其应用，其启动子pRsSWEET15.1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；用于体外扩增所述启动子的引物，其序列如SEQ ID NO.2-3所示；所述的RsSWEET15.1启动子的重组表达载体以及所述的表达启动子pRsSWEET15.1或所述的含有RsSWEET15.1启动子的重组表达载体的基因试剂盒。本发明筛选到一种全新的启动子(RsSWEET15.1启动子)可以有效驱动外源基因在花药中特异性表达的表达水平精准。花药中特异性表达的表达水平精准。


技术研发人员：刘同金 崔群香 班秋妍 周露 袁颖辉
受保护的技术使用者：金陵科技学院
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/14