一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用。


背景技术：

2.随着材料科学的发展，各种软骨修复材料应运而生，其可分为金属材料或非金属材料，金属材料中又以镁合金材料比较常用。镁离子是机体中不可缺少的必须元素，参与多种新陈代谢过程，镁合金降解后产生的镁离子可补充机体的镁元素，促进新陈代谢加速，同时加速血管生成和软骨修复，加之镁合金具有一定的机械强度，无细胞毒性，并具有良好的降解性、生物相容性及生物安全性，能够作为软骨缺损处的材料填充物质，促进软骨缺损修复。
3.传统的中医药成分在骨科疾病中应用已久，淫羊藿苷作为淫羊藿的主要成分，可用于软骨缺损、骨缺损、周围神经缺损的修复。作为软骨形成的促进剂，淫羊藿苷具有抗炎、抗衰老、免疫调节等作用，其生理活性广泛，具有较高的药用和保健价值。
4.软骨缺损是临床治疗难点，主要由创伤、炎症等造成，由于与循环系统分离，使其受损后难以自我修复。临床上通常通过取自体软骨对软骨缺损进行修复，但限于供体来源不足、二次手术导致患者痛苦较大、手术操作复杂并且费用较高、供区可导致感染等并发症等，使其疗效往往不佳。研发新方法修复软骨缺损迫在眉睫。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种合金材料，包括多孔镁合金，所述多孔镁合金上携载有淫羊藿苷。
8.一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备，包括以下步骤：
9.将钛颗粒烧结成多孔模板，再使用渗流铸造制备成镁合金加钛颗粒的复合材料，最后再用氢氟酸溶解掉钛填充颗粒，获得多孔镁合金；
10.将10μmol/l的淫羊藿苷溶解于无水乙醇中，将多孔镁合金浸泡于淫羊藿苷溶液中，后取出干燥，将淫羊藿苷吸附于多孔镁合金上得到携载淫羊藿苷的多孔镁合金。
11.进一步的，所述通过烧结的方式将钛颗粒制备成多孔模板。
12.进一步的，所述圆柱形材料直径2mm，高度2mm。
13.进一步的，所述将多孔镁合金浸泡于淫羊藿苷溶液的时间为1天。
14.一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金在制备软骨缺损修复药物中的应用。
15.本发明的有益效果：
16.本发明提供了携载淫羊藿苷的多孔镁合金在软骨缺损修复中的初步应用，所获得的携载淫羊藿苷的多孔镁合金能够为缺损处软骨组织提供随支架降解而释放的淫羊藿苷
及镁离子，多孔镁合金可作为软骨缺损处的填充材料，并为新生软骨细胞、血管等提供攀附材料及孔隙，释放的淫羊藿苷及镁离子可作为刺激物质作用于周围的骨髓间充质干细胞(bmscs)及软骨细胞，使前者不断分化为软骨细胞并使后者不断增殖，最终由下而上完成软骨缺损的修复，从而减少了取自体软骨进行缺损处修复的二次手术带来的供体不足、患者痛苦、复杂操作、费用增加等。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1是本发明大鼠造模，在大鼠膝关节股骨髁中间非负重区钻出直径2mm的软骨缺损，后植入多孔镁合金材料；
19.图2是本发明多孔镁合金支架宏观观察图；
20.图3是本发明支架扫描电镜图。a图为单纯多孔镁合金的扫描电镜图；b图为淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架的扫描电镜图(sem mag：10.0kx)；
21.图4是本发明淫羊藿苷的释放曲线；
22.图5是本发明膝关节软骨缺损修复的宏观观察。图a/e为a组：淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架组，b/f为b组：单纯多孔镁合金组，c/g为c组：无支架组，d/h为d组：假手术组。a-d为大体标本图；e-h为micro-ct图；
23.图6是本发明micro-ct分析各组软骨缺损修复情况数据图。a为淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架组，b为单纯多孔镁合金组，c为无支架组，d为假手术组。bv/tv为相对骨体积，tb.n为骨小梁数量，tb.sp为骨小梁分离度，tb.th为骨小梁厚度。*p《0.05；
24.图7是本发明膝关节软骨缺损修复的微观观察。从上到下依次为he染色、番红o-固绿染色、甲苯胺蓝染色，从左到右依次为淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架组、单纯多孔镁合金组、无支架组、假手术组；
25.图8是本发明改良mankin评分评估膝关节软骨缺损修复情况。若缺损处评分较高，则软骨缺损修复较差。a、b、c、d依次为淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架组、单纯多孔镁合金组、无支架组、假手术组。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；
26.图9是本发明免疫组化染色检测相关因子蛋白的表达情况(
×
200)。从上到下依次为aggrecan、collagenⅱ、sox9、β-catenin、wnt5a、wnt1、sfrp1蛋白，从左到右依次为淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架组、单纯多孔镁合金组、无支架组、假手术组；
27.图10是本发明相关因子蛋白的表达情况。a、b、c、d依次为淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架组、单纯多孔镁合金组、无支架组、假手术组。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它
实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例一
30.1、淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架的构建
31.1.1、淫羊藿苷/多孔镁合金的制造
32.所需要的材料主要由上海交通大学轻合金精密成型国家工程研究中心提供(参照cn105039771a所述的多孔镁基材料)，以镁元素为主，主要成分为mg-3.1nd-0.2zn-0.4zr，融入少量的nd、zn、zr元素合金化，采用钛颗粒烧结成多孔模板，再使用渗流铸造制备成镁合金+钛颗粒的复合材料，最后再用氢氟酸溶解掉钛填充颗粒，获得多孔镁合金，将多孔镁合金加工成直径2mm、高度2mm圆柱形材料。将10μmol/l的ica溶解于无水乙醇中，将多孔镁合金浸泡于ica溶液中1d，后取出放入真空干燥箱中干燥，使用物理吸附的方式将ica吸附于多孔镁合金上。
33.1.2、淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架形态表征评估
34.使用相机拍照观察多孔镁合金和淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架的表面形态。将干燥的多孔镁合金和淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架喷金固定，使用场发射扫描电子显微镜(sem,tescan,mira3 xmh)观察其微观结构，加速电压为5kv。
35.1.3、淫羊藿苷标准曲线与释放曲线
36.使用高效液相色谱仪(hplc)测定相关数据并制作标准淫羊藿苷浓度曲线。将不同浓度的淫羊藿苷溶解于pbs中，制备0mg/l、2.5mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l溶液。使用紫外光检测器(uv230ⅱ)在波长270nm处监测吸光度，流速：1ml/min。最后将吸光度与浓度作图比对作图从而获得标准曲线。使用三份独立制作的淫羊藿苷溶液进行实验。将具有生物活性的淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架材料称重至180mg，并在37℃下浸入20ml pbs溶液中从而释放淫羊藿苷。在每个时间点，取出100μl的pbs溶液，并检测他们在吸收波长为270nm的紫外吸收光谱，与制作的标准曲线进行比对，由此确定pbs中淫羊藿苷的浓度。使用三份独立的样本材料进行测量。
37.2、实验动物
38.3只雌性10周龄sprague dawley(sd)大鼠(体重220-240g)和24只雌性6周龄的sd大鼠(体重250-350g)购自广东省实验动物中心。实验所使用的sd大鼠饲养在北京大学深圳医院实验动物中心的特定无病原体(spf)屏障区域的环境控制室中，12h光照/12h黑暗循环，相对湿度为50％-55％，室温为24℃
±
2℃。所有大鼠均可自由获取食物及无菌水。本研究通过北京大学深圳医院伦理委员会和动物研究委员会批准。所有实验程序和治疗均在国家卫生研究院“实验动物关爱和使用指南”相关规定下进行。
39.3、淫羊藿苷/镁合金新型支架材料的生物学特性评价
40.人工支架小块按照1g：100ml的比例完全浸没至一定体积的生理盐水并在室温下静置48h，制得生理盐水浸提液。取sd大鼠3只，麻醉后剔去背毛，于脊柱两侧各选取1个注射点，分别用无菌注射器注射浸提液和0.9％生理盐水形成皮丘，注射后放置于相同条件下培养，分别在1h、12h、24h、48h观察注射位点及周边皮肤有无充血、肿胀等皮下刺激反应发生。
41.4、大鼠的造模与分组
42.使用戊巴比妥钠腹腔注射对sd大鼠进行麻醉(麻醉剂量按30mg/kg计算)。待大鼠处于麻醉状态后，对其右膝关节处进行皮肤备皮，后使用0.5％碘伏对右膝关节皮肤消毒3
次，于右膝关节髌韧带内侧缘处切开，从髌韧带内侧进入，弯曲膝关节使髌骨脱位，从而使股骨滑车处暴露，使用带有2mm直径克氏针的电钻在右侧膝关节股骨髁中间非负重区钻孔，钻孔深达软骨及软骨下骨全层，直至骨髓腔中血液渗入到关节软骨缺损处，以提供骨髓腔内的bmscs。将sd大鼠随机分为4组：a组：携载10μmol/l淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架置入膝关节软骨缺损处(n＝8)；b组：单纯多孔镁合金支架材料置入膝关节软骨缺损处(空白组)(n＝8)；c组：膝关节软骨缺损处不置入生物材料(n＝8)；d组：每只大鼠对侧仅切开关节囊而不做处理的关节软骨作为正常对照(n＝24)。
43.5、关节软骨大体标本观察
44.正常饲喂大鼠至术后12周，使用颈椎脱臼法将各组sd大鼠处死，根据原来的手术切口，依次切开膝关节皮肤、肌肉以及关节囊，观察膝关节软骨缺损修复情况，观察膝关节有无关节积液和滑膜肿胀等滑膜炎表现，将大鼠双侧股骨远端完整取出，浸泡入准备好的组织固定用多聚甲醛中。
45.6、micro-ct宏观观察大鼠膝关节软骨修复情况
46.使用micro-ct扫描处死的大鼠双侧的股骨远端标本，观察修复处软骨下骨表面及内部结构，x射线管电压为80kv，电流为450μa。视图数为400，曝光时间为400ms，并选择镜头扫描技术。有效像素大小为0.046mm。
47.7、常规及特殊染色观察大鼠膝关节软骨修复情况
48.组织标本使用4％多聚甲醛固定、脱钙并包埋在石蜡中，并使用石蜡切片机进行切片，厚度为5-6μm。用于he染色的组织切片先置于苏木素染色液中2min，后放入流水中冲洗反蓝；随后置于伊红染色液中2min，后再次水洗。用于番红o固绿染色的组织切片置于weigert染液染色5min，用酸性分化液分化5s，随后置入固绿染色液中20min，弱酸洗涤切片5s后将切片置入番红染色液中30min，最后用水冲洗多余浮色。用于甲苯胺蓝染色的组织切片置于甲苯胺蓝染色液中5min，后置于95％乙醇中1min，最后水洗切片。
49.8、改良mankin评分评估大鼠膝关节软骨修复情况
50.我们根据改良mankin评分标准，通过软骨结构、软骨细胞数量及分布、基质染色及潮线完整性四方面对软骨缺损修复情况进行评分并统计分析。
51.9、免疫组化染色检测wnt/β-catenin信号通路相关因子及成软骨分化相关因子的蛋白表达情况
52.组织标本使用4％多聚甲醛固定、脱钙并包埋在石蜡中，并使用石蜡切片机进行切片，厚度为5-6μm。将组织切片进行脱蜡及流水冲洗，使用胃蛋白酶进行抗原修复，pbs溶液洗涤，使用内源性过氧化物酶阻断剂处理，用pbs溶液洗涤，再使用非特异染色阻断剂处理后pbs洗涤，切片与sox9、collagenⅱ、aggrecan、β-catenin、wnt1、wnt5a、sfrp1抗体(稀释度1：400；bioss，北京，中国)孵育。随后使用pbs溶液洗涤，用二抗孵育，使用新鲜配置的dab溶液处理。在显微镜下观察发现sox9、collagenⅱ、aggrecan、β-catenin、wnt1、wnt5a、sfrp1蛋白高表达的部位被染成棕色。使用正置荧光显微镜对阳性区域进行拍摄，并截取相同大小的区域。使用image pro 6.0计算棕色区域的具体数值。
53.10、统计分析
54.所有计量资料采用平均值
±
标准差(mean
±
sd)表示，使用spss 26.0软件进行独立样本t检验与单因素方差分析(anova)。p《0.05表示组间差异具有统计学意义。
55.实验结果
56.1、多孔镁合金支架形态及表征
57.如图2、图3所示，我们构建了直径2mm、高度2mm的多孔镁合金，宏观观察可显示其表面微孔结构。扫描电镜观察进一步显示单纯多孔镁合金与淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架表面均具有微孔结构，且载药支架表面较单纯多孔镁合金支架粗糙，为负载于支架上的ica。
58.2、淫羊藿苷/多孔镁合金生物支架的药物释放情况
59.如图4所示，淫羊藿苷从淫羊藿苷/多孔镁合金生物支架材料中释放时，在前7天释放浓度较高，并且在第5天时达到峰值，为23.730μmol/l，之后在第7-14天期间药物释放浓度逐渐降低，在第21-28天时仍有少量淫羊藿苷释放。淫羊藿苷/多孔镁合金生物材料可以缓慢释放淫羊藿苷。
60.3、淫羊藿苷/多孔镁合金支架的生物安全性
61.将淫羊藿苷/多孔镁合金生物支架浸出液和0.9％生理盐水注入脊柱两侧皮肤后，48小时内两侧皮肤均未见充血肿胀，皮肤隆起消失。皮下刺激试验为阴性，证明淫羊藿苷/多孔镁合金支架的体外生物安全性较好，适用于进行后续实验。
62.4、造模后大鼠观察
63.所有组别sd大鼠在术后12周均存活。在观察期内，我们发现所有大鼠状态良好，余进食量、毛发情况、大小便等一般生命体征未见明显差异，手术伤口均愈合良好，无伤口破损、渗血渗液、感染流脓等情况。
64.5、膝关节软骨缺损修复的宏观观察
65.如图5所示，大体标本观察发现a组软骨缺损修复情况在三组之中最好，软骨缺损被乳白色类软骨组织填充，软骨表面光滑，基本恢复髁间窝的完整性，颜色与其周围软骨组织相同，整体软骨形态更为接近d组；而b组次之，其缺损处亦被类软骨组织填充，但修复组织表面光滑程度及完整性都不及a组；c组软骨缺损修复较差，缺损面积较大，表面存在明显的凹陷，且缺损处被大量类似纤维组织填充。
66.如图6和表1所示，在平扫和重建的3d图像中，a组在缺损区出现了与天然骨组织相类似的软骨下骨修复，形态上更为接近d组；b组软骨下骨缺损较为明显，但优于c组，仍有部分骨修复；c组中软骨下骨缺损面积最大，存在明显凹陷，表明大鼠自身固有修复能力有限。我们计算分析了各组缺损修复位点的相对骨体积(bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)、骨小梁分离度(tb.sp)及骨小梁厚度(tb.th)。发现与a、b两组相比，c组tb.n数值最小，且差异具有统计学意义(p＜0.005)。而bv/tv、tb.sp及tb.th数值经分析各组差异均无统计学意义。
67.表1microct检测各组软骨缺损修复骨量数值
68.[0069][0070]
注：a,a组和b组有差异；b,b组和c组有差异；
[0071]
6、膝关节软骨缺损修复的微观观察
[0072]
如图7所示，我们对各组标本进行脱钙处理，组织切片后进行了常规与特殊染色。通过常规he染色用于观察大鼠股骨软骨组织的各层结构及细胞变化，番红o固绿染色及甲苯胺蓝染色用于观察软骨缺损修复及潮线变化情况。我们发现a组中软骨缺损基本修复，软骨的各层结构清晰，表面较为光滑，软骨细胞正常分布，软骨下骨排列紧密且规则。番红o及甲苯胺蓝染色深且均匀，潮线完整且无血管通过，组织形态及染色程度更接近d组；b组中软骨缺损未完全修复，软骨下骨仍存留部分纤维组织，软骨表面略粗糙，软骨细胞减少且紊乱，软骨下骨相对规则，部分生长在缺损处，可见番红o及甲苯胺蓝染色深但分布不均，缺损中间处染色浅，关节表面不平整，潮线中断不连续；c组中软骨缺损明显，表面凹凸不平，形态不均，软骨的各层结构无法区分，缺损部分主要被大量的纤维组织覆盖，软骨细胞少且成簇分布，软骨下骨几乎没有长入缺损处，番红o及甲苯胺蓝染色在四组中最浅，软骨细胞数量明显减少，在四组中软骨缺损修复水平最低。d组中各层软骨结构清晰，软骨表面光滑，软骨细胞均匀分布。番红o及甲苯胺蓝染色深且均匀，潮汐线整齐且完整。
[0073]
如图8所示a、b、c、d组四组膝关节改良mankin评分结果分别为2.400
±
0.548、5.375
±
1.109、10.750
±
0.957、0.750
±
0.500，经过统计分析，发现a组与b、c组mankin评分相比，差异具有统计学意义(p＜0.0001)。b组相较于c组，mankin评分差异显著(p＜0.0001)。由此说明淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架软骨缺损修复情况最好，单纯多孔镁合金组次之。
[0074]
7、免疫组化染色检测膝关节软骨缺损修复的机制
[0075]
如图9图、10所示，在aggrecan、collagenⅱ以及sox9成软骨相关因子的免疫组化结果中，a组与b、c组相比三种蛋白表达量均上调，差异有统计学意义(p＜0.05)，a组与b组相比三种蛋白表达量均上调，差异有统计学意义(p＜0.05)；在wnt/β-catenin信号通路相
关因子β-catenin、wnt5a、wnt1的免疫组化结果中，a组与b、c组相比三种蛋白表达量均上调，差异有统计学意义(p＜0.05)，a组与b组相比三种蛋白表达量均上调，差异有统计学意义(p＜0.05)。表明淫羊藿苷/多孔镁合金新型支架可能是通过激活wnt/β-catenin通路中的相关因子实现软骨缺损修复的。
[0076]
表2大鼠膝关节各组中各蛋白免疫组化染色积分
[0077][0078][0079]
注：a,a组和b组有差异；b,a组和c组有差异；c,a组和d组有差异；d,b组和c组有差异；e,b组和d组有差异；f,c组和d组有差异。
[0080]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0081]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本
发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

技术特征：
1.一种合金材料，其特征在于，包括多孔镁合金，所述多孔镁合金上携载有淫羊藿苷。2.一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备，其特征在于，包括以下步骤：将钛颗粒制成多孔模板，再使用渗流铸造制备成镁合金加钛颗粒的复合材料，最后再用氢氟酸溶解掉钛填充颗粒，获得多孔镁合金；将10μmol/l的淫羊藿苷溶解于无水乙醇中，将多孔镁合金浸泡于淫羊藿苷溶液中，后取出干燥，将淫羊藿苷吸附于多孔镁合金上得到携载淫羊藿苷的多孔镁合金。3.根据权利要求2所述的一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用，其特征在于，所述通过烧结的方式将钛颗粒制多孔模板。4.根据权利要求2所述的一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用，其特征在于，所述圆柱形材料直径2mm，高度2mm。5.根据权利要求2所述的一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用，其特征在于，所述将多孔镁合金浸泡于淫羊藿苷溶液的时间为1天。6.权利要求1所述的一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金在制备软骨缺损修复药物中的应用。

技术总结
本发明公开一种携载淫羊藿苷的多孔镁合金的制备及其应用，属于生物医学技术领域，包括以下步骤：采用钛颗粒烧结成多孔模板，再使用渗流铸造制备成镁合金+钛颗粒的复合材料，最后再用氢氟酸溶解掉钛填充颗粒，获得多孔镁合金。将10μmol/L的淫羊藿苷溶解于无水乙醇中，将多孔镁合金浸泡于淫羊藿苷溶液中，后取出干燥，将淫羊藿苷吸附于多孔镁合金上得到携载淫羊藿苷的多孔镁合金，本发明将淫羊藿苷负载于镁合金之上，能够随镁合金降解为软骨缺损处提供长久的淫羊藿苷刺激，并与释放的镁离子起到协同作用，共同加速软骨缺损的修复。共同加速软骨缺损的修复。共同加速软骨缺损的修复。


技术研发人员：于斐 曾晖 张孟伟 翁鉴 袁广银 郑铭
受保护的技术使用者：北京大学深圳医院
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/14