一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒

1.本发明涉及一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒及其制备方法和应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.高尔基体是细胞中负责蛋白质修饰、转运和分泌的细胞器，其功能失调与多种病理过程有关，如神经退行性疾病和癌症等。研究表明，在增殖异常迅速的肿瘤细胞中，高尔基体结构膨胀，分泌功能旺盛，参与多种肿瘤和转移相关蛋白的分泌，高尔基体功能蛋白的表达量与癌症转移预后情况密切相关。因此，破坏高尔基体的结构与功能，阻断肿瘤和转移相关调控蛋白的修饰和分泌，就可以对肿瘤进展过程中的多个信号级联产生影响，从而抑制肿瘤的生长和转移。
3.目前，高尔基体结构干扰剂多用于高尔基体结构和功能的研究，其特异性差、毒副作用强、缺乏有效的靶向递送系统，因而很少用于疾病治疗。目前对于高尔基体靶向的研究主要集中在用于疾病诊断的高尔基体特异性荧光探针的开发，例如，专利cn115161021a、cn104987862a公开了以氨基酸为靶向基团的可用于高尔基体成像的荧光碳量子点；专利cn114958363a、cn114032094a、cn112851556a、cn112266351a公开了以苯磺酰胺为靶向基团的高尔基体特异性荧光探针或碳点；专利cn114621172a、cn114507204a公开了以肉豆蔻酰为靶向基团的高尔基体靶向荧光探针；专利cn109280017a、cn108997363a公开了以鞘氨醇为靶向基团的高尔基体定位剂；专利cn111039866a、cn104529893a公开了以喹啉衍生物为靶向基团的高尔基体荧光染料等。用于疾病治疗的高尔基体靶向技术较少，例如，专利cn111317715a公开了一种高尔基体靶向的粘多糖纳米胶束及其制备方法与应用；专利cn115177739a公开了一种组织-细胞-细胞器三级靶向的仿生制剂及其制备方法和应用，利用高尔基体靶向肽(氨基酸序列sxyqrl，其中x代表任意氨基酸)修饰纳米粒；专利cn114456152a公开了一种高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热试剂及其制备方法和应用等。同时，这些高尔基体靶向治疗技术仍存在材料复杂、不易转化、应用范围局限等缺点。因此，开发新型有效的高尔基体靶向治疗策略具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是开发具有靶向并破坏高尔基体能力、肿瘤微环境响应释放、制备工艺简单、应用范围更广的高尔基体靶向干扰剂及相关纳米制剂。
5.本发明的目的之一是提供了一种肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂，包含高尔基体靶向基团吲哚美辛(indomethacin,imc)、中间响应基团和高尔基体干扰剂反式维甲
酸(retinoic acid,ra)，其结构式为：其中
6.本发明的目的之一是提供了一种肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的合成方法，其特征包括下述步骤：
7.(1)2-羟基-5-甲基间苯二甲醇与4-硝基溴化苄或2,4-二硝基苯磺酰氯或4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯反应生成分别对乏氧、谷胱甘肽和活性氧响应的中间体化合物1，中间体化合物1的结构式为：其中其中
8.(2)吲哚美辛与中间体化合物1反应生成中间体化合物2，中间体化合物2的结构式为：其中
9.(3)反式维甲酸与中间体化合物2反应分别生成肿瘤乏氧激活型高尔基体靶向干扰剂(inr)、谷胱甘肽激活型高尔基体靶向干扰剂(igr)和活性氧激活型高尔基体靶向干扰剂(irr)。
10.本发明所述的中间响应基团可分别被肿瘤细胞过表达的硝基还原酶，高浓度的谷胱甘肽，或高浓度的活性氧激活，进一步引发多米诺消除反应，使原型药物吲哚美辛和反式维甲酸得以释放。
11.本发明的目的之一是提供了一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，包含蒽环类抗肿瘤抗生素1份，肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂1～10份；优选地，蒽环类抗肿瘤抗生素1份，肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂2～5份。所述纳米粒在不添加任何载体的情况下即可获得很好的药理活性。
12.本发明所述的蒽环类抗肿瘤抗生素选自阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、阿克拉霉素、氨柔比星、佐柔比星、戊柔比星、伊达比星或米托蒽醌中的一种或多种。
13.本发明所述的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，还可以加入表面活性剂、两亲性聚合物或可吸附于纳米粒表面的负电性物质作为表面修饰材料。
14.本发明的目的之一是提供了一种纳米粒冻干粉针，包含蒽环类抗肿瘤抗生素、肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂、表面修饰材料、冻干保护剂，还可以含有其他药学上
可接受辅料，其中，基于重量份计，所述蒽环类抗肿瘤抗生素1份，肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂1～10份，表面修饰材料0～100份，冻干保护剂0～1000份，其他药学上可接受辅料适量；优选地，蒽环类抗肿瘤抗生素1份，肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂2～5份，表面修饰材料0～10份，冻干保护剂10～200份，其他药学上可接受辅料适量。
15.所述表面修饰材料可选自表面活性剂solutol hs15、吐温、卖泽、苄泽、泊洛沙姆中的一种或多种，两亲性聚合物peg化磷脂、peg-plga、peg-pla、peg-pcl中的一种或多种，可吸附于纳米粒表面的负电性物质硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、低分子肝素、环糊精、岩藻多糖、右旋糖酐、海藻酸盐中的一种或多种；优选的表面修饰材料为mpeg
2000-dspe、solutol hs15、硫酸软骨素中的一种或多种。
16.本发明所述的纳米粒冻干粉针中冻干保护剂选自蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸、右旋糖酐中的一种或多种的混合物；优选的冻干保护剂为蔗糖。
17.本发明所述的其他辅料选自等渗调节剂、抗氧化剂、防腐剂、ph调节剂等药学可接受的辅料。
18.本发明的目的之一是提供了一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒的制备方法，其特征包括下述步骤：
19.(1)取蒽环类抗肿瘤抗生素的药学上可接受的盐，先用碱性物质中和对应酸，再溶于有机溶剂中；或者取蒽环类抗肿瘤抗生素溶于有机溶剂中；
20.(2)取肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂溶于有机溶液中；
21.(3)将(1)和(2)混合，加入去离子水，高压均质或探头超声乳化；
22.(4)旋转蒸发除去有机溶剂，即得。
23.其中，步骤(1)中的碱性物质主要是用于中和蒽环类抗肿瘤抗生素的药学上可接受盐中的酸根，获得药物分子形式游离碱。所述碱性物质选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、三乙胺、氨水中的一种或多种的混合物；步骤(1)所述碱性物质优选为碳酸氢钠，所述碱性物质的加入量可以根据药物性质确定。步骤(1)和(2)中所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮或类似溶剂，可选择以上这些溶剂的一种或多种的混合物；优选氯仿。步骤(4)中旋转蒸发温度范围为20～70℃，优选30-40℃。
24.所述基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒还包含表面修饰材料，所述表面修饰材料可在步骤(2)溶于有机溶剂中和/或在步骤(3)溶于去离子水中，和/或在步骤(4)之后直接加入。
25.作为具体的实施方案之一，上述方法所得基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，可在步骤(4)之后加入冻干保护剂，经过本领域的常规方式冻干成为粉末。
26.所述纳米粒的粒径为1～1000nm，优选10～300nm。
27.本发明的目的之一是提供了一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒在治疗肿瘤及其转移中的应用。
28.发明益处
29.(1)本发明的肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂，可提高高尔基体靶向效率，改善高尔基体靶向治疗效果；
30.(2)本发明的肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂合成步骤简单，可采用各种
不同的递药系统进行递送，也可用于治疗各种不同的高尔基体相关的疾病，应用范围广阔；
31.(3)本发明的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒制备方法简单，原料易得，载药量大，可以在不含任何非活性药物递送载体的情况下发挥作用；
32.(4)本发明的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒能显著提高抗肿瘤和抗肿瘤转移治疗效果，具有良好的应用前景。
附图说明
33.图1.肿瘤乏氧激活型高尔基体靶向干扰剂inr的核磁共振氢谱。
34.图2.纳米粒np和pnp的透射电镜照片。
35.图3.4t1细胞对游离吡柔比星、np和pnp的摄取(n＝4)。****p《0.0001。
36.图4.pnp孵育4t1细胞不同时间后细胞中反式维甲酸的含量(n＝3)。**p《0.01，****p《0.0001。ns，无显著性差异。
37.图5.体外细胞毒性实验结果(n＝5)。
38.图6.游离药物或纳米粒处理4t1细胞后免疫荧光标记高尔基体结构蛋白的共聚焦显微图像。标尺：10μm。
39.图7.划痕实验结果。标尺：100μm。
40.图8.transwell侵袭实验结果。标尺：100μm。
41.图9.体内抗肿瘤效果。(a)各组的肿瘤生长曲线(n＝6)。**p《0.01,****p《0.0001。(b)第22天时的肿瘤重量(n＝6)。**p《0.01。(c)根据肿瘤重量计算的抑瘤率(n＝6)。**p《0.01。(d)第22天拍摄的肿瘤组织照片。(e)不同治疗组的kaplan-meier生存曲线(n＝10)。
42.图10.体内抗转移效果。(a)离体肺组织的生物发光成像(上)和波恩氏固定液固定后的肺组织照片(下，肺转移结节用黑色圆圈圈出)。(b)肺组织生物发光强度的半定量结果和肺转移结节数量(n＝3)。*p《0.05,***p《0.001and****p《0.0001。ns，无显著性差异。
具体实施方式
43.以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是本发明范围的限制。下面参考实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
44.实施例1
45.以肿瘤乏氧激活型高尔基体靶向干扰剂(inr)为例，inr的合成步骤如下：
46.(1)取0.84g 2-羟基-5-甲基间苯二甲醇和2.16g 4-硝基溴化苄溶于50ml丙酮，加入3.45g k2co3，60℃油浴回流4h，然后冷却至室温，60℃旋转蒸发除去丙酮得到粗品，柱层析纯化得黄色粉末，为中间体化合物1；
47.(2)取1.79g吲哚美辛溶于dmf，加入1.44g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，0.92g 4-二甲氨基吡啶，1.94g n,n-二异丙基乙胺和2.27g中间体化合物1，氮气保护下室温搅拌过夜。用油泵抽干dmf得粗产物，柱层析纯化得到黄色固体，为中间体化合物2；
48.(3)取1.2g反式维甲酸溶于二氯甲烷，加入1.15g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳
酰二亚胺盐酸盐，0.73g 4-二甲氨基吡啶，1.55g n,n-二异丙基乙胺和3.09g中间体化合物2，氮气保护下室温搅拌过夜。旋转蒸发除去二氯甲烷得粗产物，柱层析纯化，产物经真空干燥后得黄色固体粉末，为肿瘤乏氧激活型高尔基体靶向干扰剂(inr)。
49.肿瘤谷胱甘肽激活型高尔基体靶向干扰剂(igr)和肿瘤活性氧激活型高尔基体靶向干扰剂(irr)的合成步骤同上。
50.实施例2
51.取3mg吡喃阿霉素(thp)和7.5mg inr溶于0.3ml氯仿，加入6ml去离子水，探头超声8min(功率200w，超声5s，停歇5s)，然后37℃旋转蒸发除去氯仿，即得纳米粒np。
52.实施例3
53.取3mg thp、7.5mg inr和2.1mg mpeg
2000-dspe溶于0.3ml氯仿，加入6ml去离子水，探头超声8min(功率200w，超声5s，停歇5s)，然后37℃旋转蒸发除去氯仿，即得纳米粒pnp。
54.实施例4
55.取1.5mg thp和3mg inr溶于0.2ml氯仿，加入3ml去离子水，探头超声8min(功率200w，超声5s，停歇5s)，然后37℃旋转蒸发除去氯仿得到纳米粒，在搅拌条件下将所得纳米粒缓慢滴加到0.45ml硫酸软骨素溶液(10mg/ml)中，继续搅拌30min，即得。
56.实施例5
57.取盐酸阿霉素5mg，溶解于1ml水中，加入50mg/ml的nahco3溶液20μl，涡旋一分钟，离心得阿霉素。将阿霉素和15mg inr溶于1ml氯仿，加入10ml去离子水，探头超声10min(功率150w，超声4s，停歇6s)，然后37℃旋转蒸发除去氯仿，即得。
58.实施例6
59.取2mg thp、5mg inr和2.1mg solutol hs15溶于0.25ml氯仿，加入4ml去离子水，探头超声10min(功率200w，超声5s，停歇5s)，然后40℃旋转蒸发除去氯仿，即得。
60.实施例7
61.取4mg阿克拉霉素、8mg inr溶于0.4ml氯仿，取4.8mg mpeg
3400-dspe溶于8ml去离子水，二者混合后高压均质5min，然后45℃旋转蒸发除去氯仿，即得。
62.实施例8
63.取3mg thp、7.5mg inr和2.1mg mpeg
2000-dspe溶于0.3ml氯仿，加入6ml去离子水，探头超声8min(功率200w，超声5s，停歇5s)，然后37℃旋转蒸发除去氯仿，加入300mg蔗糖充分溶解后进行冷冻干燥，即得冻干粉针。
64.实施例9
65.取3mg thp和6mg igr溶于0.3ml二氯甲烷，加入6ml去离子水，探头超声10min(功率150w，超声5s，停歇5s)，然后37℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得。
66.实施例10
67.取盐酸表阿霉素5mg，溶解于1ml水中，加入50mg/ml的nahco3溶液20μl，涡旋一分钟，离心得表阿霉素。将表阿霉素和12mg irr溶于0.5ml氯仿，加入10ml去离子水，探头超声8min(功率200w，超声5s，停歇5s)，然后37℃旋转蒸发除去氯仿，即得。
68.实验例1
69.将实施例1合成的肿瘤乏氧激活型高尔基体靶向干扰剂inr溶于氘代氯仿中，用于核磁共振氢谱分析，结果参见图1。图1表明肿瘤乏氧激活型高尔基体靶向干扰剂inr成功合
成。
70.实验例2
71.将实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6所得纳米粒用去离子水稀释至适宜浓度后，用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径和电位。
72.实验结果如表1所示，肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂可以与蒽环类抗肿瘤抗生素形成纳米粒，不加入表面修饰材料时纳米粒具有较强的正电荷(实施例2、5)，加入表面修饰材料可以显著改变纳米粒的电位(实施例3、4、6、7)。
73.表1纳米粒的理化性质
[0074][0075]
实验例3
[0076]
取实施例2制备的纳米粒(np)和实施例3制备的纳米粒(pnp)稀释至适宜浓度后滴加于铜网上，用2％磷钨酸染液室温负染1min，滤纸吸干多余的染液，在透射电镜下观察纳米粒的形态。
[0077]
如图2所示，np和pnp形态为均类球形，np的粒径较小，pnp的粒径相对较大，但np的大小不如pnp均匀。
[0078]
实验例4
[0079]
体外细胞摄取实验。取生长状态良好的小鼠4t1乳腺癌细胞，经胰酶消化后离心收集细胞，用完全培养基重悬后以合适的密度接种到12孔细胞培养板中，于37℃、5％co2的恒湿培养箱中培养，24h后弃去培养基并用pbs淌洗细胞，然后每孔分别加入1ml经无血无抗培养基稀释的游离thp溶液、实施例2制备的纳米粒(np)和实施例3制备的纳米粒(pnp)，给药浓度按thp剂量计算为5μg/ml，每组设置4个复孔，加药后孵育2h，然后吸弃药液，用pbs淌洗三次，胰酶消化后2000rpm离心3min收集细胞，弃掉上清液后再用pbs洗涤细胞3次，最后将细胞重悬于300μl pbs中，使用流式细胞仪通过thp的荧光检测细胞摄取量。
[0080]
实验结果见图3，4t1细胞对np和pnp的摄取量分别为游离药物的1.70倍和1.96倍，说明前药纳米粒能够显著增加4t1细胞对药物的摄取量。
[0081]
实验例5
[0082]
前药的乏氧响应性验证。取处于对数生长期的4t1细胞接种于6孔板中孵育过夜，弃培养基后用无菌pbs轻轻洗涤细胞3次，加入实施例3制备的纳米粒(pnp)分别于0.1％、6～12％、20％(正常培养条件)o2浓度培养条件下孵育不同时间后取出，用pbs洗涤细胞三遍，胰酶消化并收集、洗涤细胞，然后反复冻融裂解。取100μl细胞裂解液于2ml离心管中，加
入1ml乙酸乙酯，涡旋10min，3000rpm离心10min，定量吸取上层乙酸乙酯层，通氮气挥掉乙酸乙酯，再向离心管中加入100μl甲醇溶解残余物，涡旋1min，10000rpm离心5min，取上清液用hplc测定原型药物ra的含量。
[0083]
如图4所示，在6～12％的o2浓度下，短时间内原型药物ra的释放与正常o2浓度相比差异较小，孵育12h后ra的含量与正常o2浓度拉开了差距。而在0.1％的o2浓度下，原型药物ra的释放明显增多，在各个时间点均显著高于正常o2浓度，说明乏氧环境确实能够有效地促进前药转化为原型药物。此外，正常o2浓度下细胞中也能够检测到ra，说明正常o2浓度下培养的4t1细胞也会表达一定量的硝基还原酶，促使前药转化为原型药物。
[0084]
实验例6
[0085]
细胞毒性试验。选取状态良好且处于对数生长期的4t1细胞接种于96孔板中，在37℃、5％co2培养箱中培养24h后弃掉上层培养基，加入用无血无抗培养基稀释成一系列浓度梯度的各组药物或制剂：free thp、free thp+imc+ra、free thp+inr、实施例2制备的纳米粒(np)、实施例3制备的纳米粒(pnp)，每个浓度设置5个复孔，再设置一组空白对照孔加入空白培养基。加药后分别于正常o2浓度的培养箱和o2浓度为0.1％的密闭培养盒中孵育24h，温度均为37℃，之后吸弃药液，每孔加入100μl mtt溶液(0.5mg/ml)，37℃继续孵育4h后取出，用注射器吸出孔内上清液，加入dmso(每孔150μl)，用摇板器振摇10min使生成的甲臢结晶充分溶解，然后使用酶联免疫检测仪测定490nm的吸光值，记录结果，计算细胞存活率。
[0086]
根据图5所示，无论是常氧还是乏氧环境，联合用药组的细胞毒性都显著高于单一药物治疗的free thp组，且两种条件下pnp对4t1细胞的毒性作用都是最强的，这是由于其良好的稳定性及较高的细胞摄取量。对于free thp、free thp+ra+imc组和np组，乏氧环境下的细胞存活率要显著高于常氧条件下的细胞存活率，这说明乏氧环境下的细胞可能具有更顽强的生存能力，药物作用减弱。pnp组在乏氧和常氧条件下的细胞毒性无显著性差异，基于乏氧条件下pnp中前药能够更多地转化为原型药物，即使细胞生存能力增强，pnp依然能够有效地发挥细胞毒性作用。
[0087]
实验例7
[0088]
高尔基体结构表征。将生长状态良好的4t1细胞接种于玻底培养皿中，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养过夜后用pbs淌洗细胞3次，然后分别加入pbs、free thp+imc、free thp+imc+ra、free thp+inr、实施例2制备的纳米粒(np)、实施例3制备的纳米粒(pnp)，给药浓度按thp计算为100ng/ml，于细胞培养箱中孵育12h后弃去药液，用pbs洗涤3次，4％多聚甲醛室温固定细胞10min，pbs淌洗细胞3次，加入0.1％的triton x-100室温孵育5min，再用pbs洗涤3次，加入5％bsa于37℃孵育1h，经pbs洗涤3次后加入gm130抗体4℃孵育过夜，然后再用pbs淌洗3次，加入coralite594标记的二抗室温孵育1h，pbs洗涤3次，最后用dapi室温染色细胞核10min，pbs洗涤3次后于激光共聚焦显微镜下观察荧光分布情况。
[0089]
如图6所示，thp和imc对高尔基体的结构基本没有影响，而加入ra后，高尔基体从核周聚集的状态变为散在分布于整个细胞中。free thp+inr组的高尔基体碎片数量显著多于free thp+ra+imc，这说明前药具有更强的破坏高尔基体的作用，由于前药能够靶向高尔基体，使ra更多地到达高尔基体发挥作用。此外，pnp稳定性好且能够被细胞更多地摄取，对高尔基体的破坏作用最强。
[0090]
实验例8
[0091]
细胞迁移实验。取生长状态良好的4t1细胞接种于12孔细胞培养板中培养24h至细胞密度达到80％后弃掉培养基，用10μl无菌移液枪头在培养孔中央沿着直径方向划出一道伤痕，并用无菌pbs洗涤细胞3次以除去多余的细胞残渣，然后分别加入1ml无血无抗培养基稀释的free thp、free thp+imc+ra、free thp+inr、实施例2制备的纳米粒(np)、实施例3制备的纳米粒(pnp)，给药剂量按thp计算为100ng/ml，以无血无抗培养基为对照组，每组设置3个复孔，在37℃、5％co2培养箱中孵育24h，然后弃去药液，经pbs淌洗细胞后用4％多聚甲醛将细胞固定。使用倒置荧光显微镜采集0h和24h的图片。
[0092]
肿瘤细胞迁移是肿瘤转移过程中一个重要的步骤，如图7所示，thp基本不能抑制细胞的迁移，ra和imc抑制细胞迁移的效果显著，而前药的游离和纳米粒组均表现出相当的抗迁移能力，特别是pnp组效果最优。
[0093]
实验例9
[0094]
transwell侵袭实验。用4℃预冷的无血清培养基将matrigel基质胶按1:8的比例稀释，在冰浴条件下向每个transwell小室中加入100μl稀释后的matrigel基质胶，37℃孵育4h使基质胶凝固。将离心收集的4t1细胞用无血无抗培养基重悬，按照1
×
106/ml的浓度接种100μl至transwell小室中，然后分别加入100μl的空白无血无抗培养基、free thp、free thp+imc+ra、free thp+inr、实施例2制备的np、实施例3制备的pnp(均用无血无抗培养基稀释)，给药剂量按thp计算为200ng/ml，另外在下室中加入含10％胎牛血清的dmem高糖完全培养基600μl，于37℃、5％co2恒湿培养箱中继续孵育24h后，吸弃transwell小室中的液体，用棉签擦除小室筛网上层未穿过基质胶和筛网的细胞，并用pbs清洗后用4％多聚甲醛室温固定穿过基质胶后留在筛网另一侧的细胞10min，pbs洗涤3次，再将小室放在甲醇中室温透化细胞20min，pbs洗涤3次，之后放入0.1％结晶紫溶液中，室温染色30min，最后用pbs轻轻洗涤小室，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
[0095]
肿瘤细胞侵袭也是肿瘤转移过程中的一个关键步骤，图8实验结果显示，pnp对于细胞侵袭的抑制作用最强。
[0096]
实验例10
[0097]
体内抗肿瘤药效学研究。收集生长状态良好并处于对数生长期的4t1细胞，用pbs重悬并调整细胞浓度为1
×
107个/ml，用注射器吸取0.1ml细胞悬液注射至小鼠右侧腋下乳腺脂肪垫的位置，建立荷4t1乳腺癌小鼠模型。接种4t1细胞后第6天将建模成功的荷瘤小鼠随机分为6组，每组16只，分别尾静脉注射生理盐水、free thp、free thp+imc+ra、free thp+inr、实施例2制备的np、实施例3制备的pnp，给药剂量为thp 4mg/kg，inr 10mg/kg，每3天给药一次，连续给药4次，从第一次给药开始用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径和短径，每两天测量一次，计算肿瘤体积。在接瘤后第22天每组取6只小鼠，断颈处死，解剖取出肿瘤组织，用生理盐水洗干净后用滤纸吸干水分，拍照并称重，计算抑瘤率，其余小鼠用于生存期记录。
[0098]
如图9所示，接种4t1肿瘤细胞后，生理盐水组小鼠的肿瘤体积不断增长，游离thp溶液在一定程度上抑制了肿瘤的生长，但联合给药组的小鼠肿瘤生长速率显著降低，特别是pnp组小鼠肿瘤体积的增长得到了最为显著的抑制。在对肿瘤组织进行称重后计算得到free thp、free thp+ra+imc、free thp+inr、np、pnp组的抑瘤率分别为37.39
±
10.65％、76.59
±
7.33％、75.80
±
6.44％、73.38
±
9.48％、89.19
±
4.88％，说明pnp发挥了最强的肿
瘤抑制效果。此外，各组的中位生存期分别为：35(saline)、35.5(free thp)、43(free thp+ra+imc)、44.5(free thp+inr)、40.5(np)、49(pnp)天，pnp显著延长了小鼠的生存期，并且有20％的小鼠肿瘤完全消失且没有复发，3个月后仍然存活，证明了pnp良好的治疗效果。
[0099]
实验例11
[0100]
纳米粒治疗原位乳腺癌肺转移的效果研究。收集生长状态良好并处于对数生长期的4t1-luc细胞，用pbs重悬并调整细胞浓度为1
×
107个/ml，用注射器吸取0.1ml细胞悬液注射至小鼠右侧腋下乳腺脂肪垫的位置。接种4t1-luc细胞后第6天，将建模成功的荷瘤小鼠随机分为6组，每组3只，分别尾静脉注射生理盐水、free thp、free thp+imc+ra、free thp+inr、np、pnp，给药剂量为thp 4mg/kg，inr 10mg/kg，每3天给药一次，连续给药4次。接瘤后第36天，对小鼠腹腔注射荧光素酶的底物d-荧光素钾盐(15mg/ml，10μl/g)，注射10min后断颈处死小鼠，剖出肺组织，用生理盐水清洗干净后立刻用活体成像仪采集生物发光图像，记录荧光强度。随后用bouin’s固定液将肺组织固定24h，观察并记录肺组织上的肿瘤转移结节数。
[0101]
实验结果如图10所示，未给药组小鼠肺部有大面积的生物发光产生，即大量的肿瘤转移灶，游离thp溶液抑制肺转移的效果较差，而联合给药组则能够发挥较强的抗转移作用，特别是pnp组肺部检测不到生物发光。将肺组织用波恩氏固定液固定后，正常肺组织呈现黄褐色，而肺转移结节则呈现亮黄色，能够与正常组织区分开来，便于对转移结节进行计数。生理盐水组平均肺转移结节数量达到了36，free thp、free thp+imc+ra、free thp+inr和np组分别为27、12、10和9，而pnp组的肺组织上观察不到肺转移结节。上述结果表明pnp能够有效地抑制原位乳腺癌的肺转移。

技术特征：
1.一种肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂，其特征在于，包含高尔基体靶向基团吲哚美辛、中间响应基团和高尔基体干扰剂反式维甲酸，其结构式为：其中2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的合成方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)2-羟基-5-甲基间苯二甲醇与4-硝基溴化苄或2,4-二硝基苯磺酰氯或4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯反应生成对乏氧、谷胱甘肽和活性氧响应的中间体化合物1，中间体化合物1的结构式为：其中(2)吲哚美辛与中间体化合物1反应生成中间体化合物2，中间体化合物2的结构式为：其中(3)反式维甲酸与中间体化合物2反应生成肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂。3.一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，其特征在于，基于重量份计，包含蒽环类抗肿瘤抗生素1份，权利要求1所述的肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂1～10份；优选为蒽环类抗肿瘤抗生素1份，所述肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂2～5份。4.根据权利要求3所述的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，其特征在于，所述蒽环类抗肿瘤抗生素选自阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、阿克拉霉素、氨柔比星、佐柔比星、戊柔比星、伊达比星或米托蒽醌中的一种或多种。5.根据权利要求3所述的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒加入表面活性剂、两亲性聚合物或可吸附于纳米粒表面的负电性物质作为表面修饰材料，基于重量份计，表面修饰材料用量为0～100份，优选0～10份；所述表面活性剂选自solutolhs15、吐温、卖泽、苄泽、泊洛沙姆中的一种或多种；所述两亲性聚合物选自peg化磷脂、peg-plga、peg-pla、peg-pcl中的一种或多种；所述可吸附于纳米粒表面的负电性物质选自硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、低分子肝素、环糊精、岩藻多糖、右旋糖酐、海藻酸盐中的一种或多种；优选的表面修饰材料为mpeg
2000-dspe、solutol hs15、硫酸软骨
素中的一种或多种。6.根据权利要求3所述的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒还包含冻干保护剂制成冻干粉针，所述冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、甘氨酸、右旋糖酐中的一种或多种的混合物，优选的冻干保护剂为蔗糖，基于重量份计，冻干保护剂用量为0～1000份，优选10～200份。7.根据权利要求3所述的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒还含有其它辅料制成药学上可接受的制剂，所述其他辅料选自等渗调节剂、抗氧化剂、防腐剂、ph调节剂中的一种或多种。8.一种权利要求3-7任一所述的基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取蒽环类抗肿瘤抗生素的药学上可接受的盐，先用碱性物质中和对应酸，再溶于有机溶剂中；或者取蒽环类抗肿瘤抗生素溶于有机溶剂中；(2)取肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂溶于有机溶液中；(3)将(1)和(2)混合，加入去离子水，高压均质或探头超声乳化；(4)旋转蒸发除去有机溶剂，即得。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述碱性物质选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、三乙胺、氨水中的一种或多种，优选碳酸氢钠；所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮中的一种或多种的混合物，优选氯仿；所述旋转蒸发温度范围为20～70℃，优选30-40℃，表面修饰材料在步骤(2)溶于有机溶剂中和/或在步骤(3)溶于去离子水中，和/或在步骤(4)之后直接加入。10.权利要求1所述肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂、权利要求3-7任一项所述纳米粒或权利要求2制备获得的干扰剂或权利要求8-9任一项所述的制备方法制备得到的纳米粒在制备治疗肿瘤或肿瘤转移的药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂的纳米粒及其制备方法，该纳米粒主要包含蒽环类抗肿瘤抗生素和肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂，还可以加入其他表面修饰材料。本发明合成的肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂能够靶向破坏高尔基体的结构和功能，大大提高了高尔基体干扰剂的作用效果，且适用于各种不同的递药系统和疾病模型。基于肿瘤微环境激活型高尔基体靶向干扰剂制得的纳米粒，制备工艺简单，载药量高，能够有效治疗肿瘤及其转移，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。


技术研发人员：龚涛 郭晨琦 董鉴霞 肖培宏 吴梦滢 张荣萍 张志荣
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/14