一种工程改造的同向重复序列及其gRNA与应用

一种工程改造的同向重复序列及其grna与应用
技术领域
1.本发明涉及基因编辑领域，涉及一种工程改造的同向重复序列及其grna与应用，具体涉及一种可以提高cas酶活性的工程改造的同向重复序列、grna及其基因编辑系统。


背景技术：

2.crispr/cas是原核生物抵御病毒感染或噬菌体入侵产生的一种适应性免疫系统，其主要通过适应、表达、干扰3个基本阶段来保护细菌免受病毒反复攻击。自被发现以来，研究人员不断对crispr/cas系统进行优化升级，使其成为了分子生物学领域重要的基因编辑工具之一，其主要通过特异位点识别、靶标基因切割和修复3个步骤实现基因编辑。目前crispr/cas9技术已广泛应用于微生物、动植物等诸多物种，crispr/cas9技术突破了传统育种的局限性，可在较短时间内培育出传统育种方法无法育成或难以育成的动物品种，从而加快动物遗传改良进展。crispr/cas系统在基因工程和筛选、哺乳动物基因治疗以及动植物育种等领域发挥着重要的作用。
3.crispr/cas系统由crispr/cas蛋白与向导rna(grna)组成，grna包括重复序列(repeat)和靶向序列(间隔序列，spacer)，靶向序列与目的基因的靶点序列互补，可以靶向目的基因，其中的重复序列会形成茎环结构，该茎环结构可以与cas蛋白相互作用。在grna和cas蛋白的参与下，待编辑的目的基因被精确剪切。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何提高基因编辑的效率。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了rna，所述rna的核苷酸序列可如seq idno.5的第14-36位或seq id no.5所示。
6.所述rna可为用于构成grna的同向重复序列(如seq id no.5)，所述同向重复序列可形成茎环结构，所述茎环结构可与cas蛋白结合。
7.所述rna也可为截断同向重复序列(如seq id no.5的第14-36位)，所述截断同向重复序列是全长同向重复序列转录后被cas12i3修饰剪切掉剩余的部分(即起功能作用的成熟体)，其引导cas12i3蛋白进行基因编辑。
8.本发明还提供了grna，所述grna可包括所述rna和靶向目的基因的靶向序列。
9.所述靶向序列可为与目的基因的靶点序列互补的rna。
10.所述grna从5’到3’端可依次包括所述rna和靶向目的基因的靶向序列。
11.本发明还提供了编码所述rna或所述grna的dna分子。
12.本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
13.b1)含有所述dna分子的表达盒；
14.b2)含有所述dna分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
15.b3)含有所述rna、所述grna或所述dna分子的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；
16.b4)含有所述rna、所述grna或所述dna分子的重组宿主细胞、或含有b1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有b2)所述重组载体的重组宿主细胞。
17.进一步地，b1)所述表达盒、b2)所述重组载体、b3)所述重组微生物和b4)所述重组宿主细胞均可表达所述dna分子。
18.本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)等但不限于此。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(streptomyces sp.)、诺卡菌属(nocardia sp.)、小单孢菌属(micromonospora sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(fucus sp.)、曲壳藻属(achnanthes sp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。
19.本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum)、玉米(zea mays)、水稻(oryza sativa)、小麦(triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk细胞)、小鼠乳腺癌细胞(c127细胞)、人胚胎肾细胞(hek293细胞)、人hela细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、t细胞或nk细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(xenopus laevis)细胞或大鲵(andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如sf21细胞或sf-9细胞)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为绵羊成纤维细胞。
20.本发明还提供了所述rna、所述grna、所述dna分子或所述生物材料的下述任一种应用：
21.a1)在基因编辑中的应用；
22.a2)在制备基因编辑系统中的应用；
23.a3)在制备基因编辑产品中的应用；
24.a4)在提高基因编辑效率中的应用；
25.a5)在提高cas蛋白活性中的应用；
26.a6)在目的基因检测，或在制备用于目的基因检测的产品中的应用。
27.本文所述基因编辑可为针对真核生物或原核生物的基因编辑，或针对真核细胞或原核细胞的基因编辑。所述真核生物可包括动物或植物。
28.本文所述基因编辑产品可包括细胞模型、动物或植物模型、动物或植物新品种等但不限于此。
29.本发明还提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统可包括下述至少任一种：
30.e1)所述rna；
31.e2)所述grna；
32.e3)所述dna分子；
33.e4)b2)中所述的重组载体。
34.进一步地，所述基因编辑系统还可包括cas蛋白。
35.所述基因编辑系统可为crispr/cas系统。
36.进一步地，本文所述基因编辑系统可为cas12i3蛋白介导的基因编辑系统(crispr/cas12i3基因编辑系统)。
37.本发明还提供了所述基因编辑系统在基因编辑、制备基因编辑产品、提高基因编辑效率、提高cas蛋白活性或在制备用于目的基因检测的产品中的应用。
38.本文所述目的基因检测的方法可包括将样品与cas蛋白和所述grna接触，或将样品与所述基因编辑系统接触，检测由所述cas蛋白切割目的基因产生的可检测信号，从而检测目的基因。
39.所述可检测信号可通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于荧光信号的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振或荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
40.本发明还提供了一种基因编辑的方法，所述方法可包括利用所述rna、所述grna、所述dna分子、b2)中所述重组载体和/或所述基因编辑系统进行基因编辑的步骤。
41.进一步地，所述基因编辑的方法可包括：使待编辑的样品与所述rna、所述grna、所述dna分子、b2)中所述重组载体和/或所述基因编辑系统接触以进行基因编辑。
42.所述待编辑的样品可包括细胞(如动物细胞或植物细胞)、组织、器官、或其组合。
43.所述样品可来自动物、植物或微生物(包括细菌、病毒等)。
44.本文所述基因编辑包括体外基因编辑、体内基因编辑、或其组合。
45.本文所述基因编辑可包括基因敲除、基因敲入、基因突变、基因片段替换或基因修饰。
46.本发明还提供了一种提高基因编辑效率的方法，所述方法可包括将seq id no.1所示的同向重复序列中第24位的u突变为c，第33位的a突变为g。
47.seq id no.1所示的同向重复序列是基于cas12i3蛋白的全长同向重复序列(full-length direct-repeat，drf)，其可分成5个区段，第一个区段为cucugaccaccug；第二个区段为agagaau；第三个区段为gugug；第四个区段为cauagu；第五个区段为cacac。第一个区段为全长同向重复序列转录后被cas12i3携带的专用rnase功能域修饰剪切的序列。第三区段和第五区段是构成茎环结构的茎区的位置。
48.进一步地，所述方法可为提高cas蛋白基因编辑效率的方法。
49.进一步地，所述提高基因编辑效率的方法还可包括将所述grna的编码dna构建到含有cas蛋白基因的载体中，制备基因编辑载体的步骤。
50.本文所述方法可基于crispr/cas系统。
51.本文所述cas蛋白可包括cas12i3、cas9、cas12a、cas12b、cas13a、cas14蛋白但不限于此。
52.进一步地，本文所述cas蛋白可为cas12i3蛋白。所述cas12i3蛋白的氨基酸序列可为seq id no.21，cas12i3蛋白编码序列的核苷酸序列可为seq id no.22。
53.本文所述grna包括同向重复序列和靶向序列(间隔序列)，其中同向重复序列(drf)名称为drf-4(seq id no.5)。靶向序列(间隔序列)与目的基因的靶点序列互补，靶向目的基因的靶点。
54.在本发明的一个实施方案中，所述目的基因为绵羊内源基因zfx(genbank accessionno.nc_056080.1的第22500545-22537460位(update date 4-nov-2022))。所述目的基因zfx的靶点序列为seq id no.10。针对zfx基因的grna名称为zfx-grna-4，zfx-grna-4的核苷酸序列可为seq id no.11，其编码dna序列可为seq id no.12。
55.在本发明的另一个实施方案中，所述目的基因为tdtomato基因(genbank accessionno.kt878736.1的第2529-3959位(update date 06-oct-2015))。所述目的基因tdtomato的靶点序列为seq id no.18。针对tdtomato基因的grna名称为tdtomato-grna-4，tdtomato-grna-4的核苷酸序列可为seq id no.19，其编码dna序列可为seq id no.20。
56.为提高cas蛋白的基因编辑效率，本发明经过广泛而深入的研究，对野生型的同向重复序列(seq id no.1)进行工程改造，确定改造茎环内碱基配对，由u-a配对改成g-c或者c-g配对。最终筛选出的突变改造方式为：将seq id no.1所示的同向重复序列中第24位的u突变为c，第33位的a突变为g，得到工程改造的同向重复序列drf-4(seq id no.5)。其分为5个区段，第一个区段为cucugaccaccug；第二个区段为agagaau；第三个区段为gugcg；第四个区段为cauagu；第五个区段为cgcac。其中第一个区段在全长同向重复序列转录后被cas12i3携带的专用rnase功能域修饰剪切掉，剩余的部分成为截断同向重复序列(truncated direct-repeat，drt)，命名为drt-4，截断同向重复序列drt-4的核苷酸序列为seq id no.5的第14-36位。drt-4为成熟grna的组成部分，是drf-4在生物体内转录后起功能作用的部分，引导cas12i3蛋白进行基因编辑。
57.实验结果表明，本发明的工程改造的同向重复序列，将u-a配对改造为c-g配对，显著地提高了cas12i3的编辑活性。本发明的同向重复序列drf-4(seq id no.5)及其截断同向重复序列drt-4(seq id no.5的第14-36位)提高了grna茎环结构的稳定性，从而提高cas酶活性，其与靶向序列(与目的基因的靶点序列互补)所构成的grna在cas蛋白的作用下，最终显著提高了cas蛋白的基因编辑效率。该同向重复序列及其grna在加速基因编辑育种、基因编辑等方面有着广泛的应用前景。
附图说明
58.图1为t7e1检测不同工程改造的同向重复序列在绵羊成纤维细胞中的编辑效率(转染后48h)。
59.图2为流式分析不同工程改造的同向重复序列导致tdtomato标记的绵羊成纤维细胞的tdtomato平均荧光强度淬灭的比例(转染后48h)。
60.图3为流式分析不同工程改造的同向重复序列导致弱tdtomato标记的绵羊成纤维细胞的弱tdtomato荧光强度(《103)的细胞数比例的变化(转染后48h)。
具体实施方式
61.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术
人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
62.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
63.定义
64.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
65.grna
66.一般而言，向导rna可以包含同向重复序列(direct repeat，dr)和导向序列(guide sequence)，或者基本上由同向重复序列和导向序列(在内源性crispr系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。同向重复序列又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”；引导序列还可以称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”。在某些情况下，导向序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导crispr/cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。
67.cas蛋白
68.表述“cas蛋白”是指crispr蛋白，术语“crispr/cas蛋白”、“cas效应蛋白”、“cas蛋白”、“cas酶”、“单效应核酸酶”可互换地使用。cas蛋白与grna或成熟crrna一旦与待检测特征序列(靶序列)结合形成的核糖核蛋白复合体，其包含杂交到靶序列上并且与cas蛋白结合的导向序列。该核糖核蛋白复合体能够识别并切割能与grna或成熟crrna杂交的多核苷酸。
69.同向重复序列
70.规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats sequences，crispr)是能为细菌和古生菌提供对病毒和质粒的适应性免疫的dna重复序列。crispr基因序列主要由前导序列(leader)、重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)构成。repeat和spacer转录后形成pre-crrna阵列，经rnase消化后形成成熟的crrna。重复序列方向若相同，则称为同向重复序列(direct repeat，dr)。
71.间隔序列
72.crispr阵列中由重复序列和间隔序列组成。间隔序列也称为“spacer”、“靶序列”、“靶点”，spacer决定了crispr/cas的靶向位置。
73.茎环结构
74.茎环(stem-loop)指一种分子内碱基配对方式，可发生于单股dna，但在rna分子中较为常见。当形成的loop较小时，也称为发夹(hairpin)或发夹环。本发明中茎环结构针对于grna中部分同向重复序列形成的分子内碱基配对结构。
75.载体
76.指在基因工程重组dna技术中将dna片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的dna分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增dna片段，主要有
质粒载体、噬菌体载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的dna元件，如启动子和终止子。本文中涉及到的启动子有u6和cbh启动子，u6启动子属于pol iii型启动子，它驱动的序列长度很小，目前常见的利用u6启动子进行表达的有grna和sirna等。u6启动子驱动的序列，在遇到pol(u)时会终止。cbh启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒(the cytomegalovirus，cmv)、早期增强子(early enhancer element)、鸡β-肌动蛋白(chicken beta-actin)启动子和鸡β-肌动蛋白(chickenβ-actin，cba)与鼠细小病毒(minute virus of mice，mmv)内含子的混合序列组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。
77.t7e1酶切法
78.t7e1全称为t7 endonuclease i，是一种比较特殊的dna核酸内切酶，能识别并切割不完全配对的dna、十字型结构dna、holliday结构等。t7e1常用于crispr/cas、talen以及其它编辑工具形成的突变体检测。
79.下述实施例中的绵羊成纤维细胞制备方法如下：取出生2周内的绵羊少许耳组织，放入pbs中。在超净台中，将耳组织放在75％酒精中消毒1min，pbs洗3遍，用无菌的剪子将耳组织剪碎至1mm3大小，加入200μl胎牛血清，移至细胞培养皿中，在37℃、5％co2培养箱中倒置放1h。小心加入完全培养基，添加时注意不要将组织块冲起。培养约1周后，从组织块爬出成纤维细胞。待长满后胰酶消化下来，扩大培养后，冻存备用。
80.下述实施例中的px458载体来源于addgene质粒共享信息库(编号为48138)。
81.下述实施例中的cas12i3蛋白的氨基酸序列为seq id no.21，cas12i3蛋白编码序列的核苷酸序列为seq id no.22。
82.实施例1、同向重复序列的优化
83.本发明基于crispr/cas12i3系统的野生型全长同向重复序列(full-length direct-repeat，drf)进行工程改造，野生型(wt)的全长同向重复序列(drf)为5
’‑
cucugaccaccugagagaaugugugcauagucacac-3’(seq id no.1)，其可分成5个区段，第一个区段为cucugaccaccug；第二个区段为agagaau；第三个区段为gugug；第四个区段为cauagu；第五个区段为cacac。其中第一个区段在全长同向重复序列转录后被cas12i3携带的专用rnase功能域修饰剪切掉，剩余的部分成为截断同向重复序列(truncated direct-repeat，drt)，drt-wt的序列为5
’‑
agagaaugugugcauagucacac-3’。其中第三区段和第五区段构成茎环结构的茎区。通过同时在第三和第五区段对应位置改变碱基从而改变了茎环结构中茎区的碱基配对。其中的茎环结构序列为gugug和cacac，通过将其中的u-a配对改变成g-c或者c-g配对，产生了8种工程改造的全长同向重复序列。具体的突变改造方式和突变后的drf如表1所示。
84.表1、8种工程改造的全长同向重复序列
aagaguggaugaau(seq id no.11)，其编码dna序列：ctctgaccacctgagaga atgtgcgcatagtcgcaccagtacagcaagagtggatgaat(seq id no.12)；
96.zfx-grna-13：cucugaccaccugagagaaugggggcauaguccccccaguacag caagaguggaugaau，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgggggcata gtccccccagtacagcaagagtggatgaat；
97.zfx-grna-14：cucugaccaccugagagaaugggcgcauagucgccccaguacag caagaguggaugaau，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgggcgcata gtcgccccagtacagcaagagtggatgaat；
98.zfx-grna-23：cucugaccaccugagagaaugcgggcauagucccgccaguacag caagaguggaugaau，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgcgggcata gtcccgccagtacagcaagagtggatgaat；
99.zfx-grna-24：cucugaccaccugagagaaugcgcgcauagucgcgccaguacag caagaguggaugaau，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgcgcgcata gtcgcgccagtacagcaagagtggatgaat。
100.载体构建如下：
101.用限制性内切酶bbsi(neb(北京)有限公司)和xbai(neb(北京)有限公司)双酶切px458(u6-sgrna-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya)以去除sgrna支架序列。酶切体系：px458 5μg，bbsi 25units，xbai 25units，cutsmart 10μl，ddh2o补至100μl。反应条件：37℃孵育6h。通过回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)回收并检测浓度。合成引物5
’‑
caccactagtt-3’和5
’‑
ctagaactagt-3’退火生成与上述酶切后的线性px458载体互补的dna双链。退火体系：5
’‑
caccactagtt-3’(100μm)2.5μl，5
’‑
ctagaactagt-3’(100μm)2.5μl，t4 ligase buffer 1μl，ddh2o补至10μl。退火程序：金属浴95℃5min，然后打开金属浴盖子，关闭金属浴，待冷却至室温。将回收后的线性px458载体(bbsi和xbai双酶切后)与退火产物通过t4连接酶试剂盒(宝日医生物技术有限公司)连接成u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya。
102.通过限制性内切酶agei(neb(北京)有限公司)和fsei(neb(北京)有限公司)双酶切上述质粒u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya以去除cas9编码序列。酶切体系：上述质粒(u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya)5μg，agei 20units，fsei 20units，cutsmart10μl，ddh2o补至100μl。反应条件：37℃孵育6h。通过回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)回收并检测浓度。将该酶切产物(agei和fsei双酶切质粒u6-cbh-cas9-t2a-egfp-bgh polya)、哺乳动物密码子优化的cas12i3蛋白编码dna(seq id no.22)通过无缝克隆试剂盒进行组装得到的重组载体分别为u6-cbh-cas12i3-t2a-egfp-bgh polya。
103.将上述构建的表达cas12i3的载体(u6-cbh-cas12i3-t2a-egfp-bgh polya)通过kp ni(neb(北京)有限公司)和spei(neb(北京)有限公司)双酶切并回收(u6启动子后有spei和kpni酶切识别位点)。酶切体系：上述质粒5μg，spei 50units，kpni 50units，cutsmart 10μl，ddh2o补至100μl。反应条件：37℃孵育6h。然后加入5μlbeyoap碱性磷酸酶(碧云天生物科技有限公司，货号d7027)，37℃继续孵育10min。通过回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)回收并检测浓度。
104.通过下述引物(表2)扩增表达靶向zfx基因grna的编码dna序列(其中大写字母标
识的为直接重复序列+靶点序列+转录终止信号，小写字母标识的为载体同源序列)。pcr扩增体系：f 1μl，r 1μl，primestar 15μl，ddh2o 13μl。pcr扩增程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸5s(33个循环)；72℃延伸5min。pcr完成后将pcr产物通过产物回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)进行回收并测定浓度。
105.表2、扩增表达grna的dna片段所用引物(靶向zfx基因)
[0106][0107][0108]
通过无缝克隆试剂盒将上述表达grna的dna片段分别与spei和kpni双酶切后载体(u6-cbh-cas12i3-t2a-egfp-bgh polya)同源重组成含不同同向重复序列的grna(靶向zfx)的9种重组载体，即为基因编辑载体。
[0109]
上述构建得到9种用于zfx基因编辑的基因编辑载体，其含有zfx基因编辑靶点和本发明设计改造的grna编码dna、以及cas12i3蛋白基因，在导入受体细胞后，其转录出的grna(向导rna)通过碱基互补配对可以靶向zfx基因，其表达出的cas12i3蛋白使zfx基因靶点上下游的dna双链断裂，从而实现基因编辑功能。
[0110]
2、电穿孔转染绵羊成纤维细胞
[0111]
将状态良好的绵羊成纤维细胞传到10cm培养皿中并培养至细胞汇合度为80％左右。胰酶消化收集细胞至ep管。用100μl电转液(北京英格恩生物科技有限公司，货号98668-20)悬浮并加入7μg质粒(上述构建的9种用于zfx基因编辑的基因编辑载体)，混合均匀。放入lonza amaxa nucleofector 2b细胞核转染仪中，调至程序a-033，电转。电转结束后，立马加入500μl dmem高糖培养基，37℃细胞培养箱静置10min。用含20％ fbs的完全培养基将细胞铺至6孔板中。6h后，换为含15％ fbs的完全培养基。
[0112]
3、t7e1检测编辑效率
[0113]
电转48h后的细胞通过基因组提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d3018-02)提取基因组dna。将提取好的绵羊基因组dna，取100ng作为模板进行pcr扩增。扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μl，使用表3中引物进行扩增，其各种成分分别为：dna模板100ng，10μmol/l上下游引物各1μl，primestar(宝日医生物科技有限公司)25μl，用灭菌去离子水补齐至50μl；pcr反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s(33个循环)；最后72℃延伸5min。pcr完成后将pcr产物通过产物回收试剂盒进行回收并测定浓度。
[0114]
表3、扩增引物
[0115][0116]
取上一步pcr回收产物，配制酶切体系如下：扩增产物500ng，cutsmart 1.1μl，ddh2o补至11.5μl。混合均匀后，按照杂交程序：95℃10min；-2℃/s降至85℃；-0.1℃/s降至25℃。加入0.5μl的t7e1(neb)，37℃酶切15min，立即加入2μl loading buffer，配制2％的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统观察并分析酶切后结果。
[0117]
通过琼脂糖凝胶电泳图(图1)观察到，相比于wt对照组的9.9％，drf-4(seq id no.5)的编辑效率为10.3％，提高了编辑效率。
[0118]
实施例3、流式分析工程改造的全长同向重复序列的编辑效率
[0119]
1、tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞的构建
[0120]
1-1、构建crispr/cas9基因打靶载体
[0121]
1-1-1、酶切px458载体
[0122]
酶切体系：px458载体5μg，bbsi 50units，cutsmart 10μl，ddh2o补齐至100μl。37℃条件下酶切5h。酶切完成后，将酶切产物通过产物纯化试剂盒(广州美基生物科技有限公司)进行纯化，得到纯化的px458 bbsi酶切产物。针对山羊zfy基因序列设计靶点(oligo)，按照表4合成靶点序列。
[0123]
表4、sgrna靶点序列
[0124][0125]
1-1-2、oligo退火
[0126]
设计的oligo按照如下退火体系和退火程序进行退火，退火形成退火产物(双链dna)。
[0127]
退火体系：zfy-sgrna-f(100μm)2.5μl，zfy-sgrna-r(100μm)2.5μl，t4 ligase buffer 1μl，ddh2o补齐至10μl。退火程序：金属浴95℃5min，关闭金属浴，打开盖子，待其温度降至室温后取出。
[0128]
1-1-3、连接
[0129]
将上述退火产物稀释50倍，并按照如下连接体系和连接程序与步骤1-1-1中的px458bbsi酶切产物进行连接。
[0130]
连接体系：px458 bbsi酶切产物90ng，退火产物(稀释后)1μl，t4 ligase 0.5μl，t4 ligase buffer 1μl，ddh2o补齐至10μl。连接程序：25℃反应1h。
[0131]
取上述连接产物10μl用于转化，挑菌测序并质粒大提，构建得到crispr/cas9基因打靶载体(即sgrna表达载体)，命名为px458-zfy-sgrna。
[0132]
1-2、构建供体质粒
[0133]
本实验室保存有pcbh-tdtomato-sv40 polya质粒，该质粒的构建过程：首先通过spei和xbai双酶切prosa26-promoter(addgene 21710)，得到酶切后的prosa26-promoter，将(seq id no.13)(tdtomato-sv40 polya序列)所示的dna分子，通过无缝克隆组装技术与酶切后的prosa26-promoter连接，得到prosa26-tdtomato-sv40 polya。再用kpni和agei双酶切px458获得cbh启动子，以prosa26-tdtomato-sv40 polya为模板，以引物f(5
’‑
tttttttcaggttggaccggtgccaccatggactagtatggtgagcaagggcga-3’)和引物r(5
’‑
taccgtaagttatgtaacggggtacccagcttttgttccctttagt-3’)扩增除rosa26启动子以外的序列，将该序列与cbh启动子序列通过无缝克隆组装技术，构建得到pcbh-tdtomato-sv40polya。
[0134]
该质粒能够在原代山羊成纤维细胞中，正常表达红色荧光。以zfy靶点核酸酶切割的位置(pam上游3-4bp处)两边的序列作为同源臂(左同源臂(ha-l)为925bp，核苷酸序列为seq id no.14，右同源臂(ha-r)为958bp，核苷酸序列为seq id no.15)。按照表5引物通过pcr扩增左右同源臂后，通过pcr产物回收试剂盒(美基生物科技有限公司)回收。
[0135]
酶切质粒pcbh-tdtomato-sv40 polya，通过无缝克隆组装技术将zfy靶点的左右同源臂对应克隆至pcbh-tdtomato-sv40 polya的两端，构建成质粒ha-l-cbh-tdtomato-sv40polya-ha-r。紧接着在左右同源臂的外侧加入zfy靶点的识别序列，构建hmej(同源臂介导的末端连接，homology-mediated end joining)所需要的供体质粒类型。另外，构建的供体质粒上左右同源臂尽管来源于山羊，但与绵羊的对应位点有极高的同源性，通过ncbi blast，对比显示左同源臂的的同源性为96.11％，右同源臂的为同源性为97.66％。其中绵羊左同源臂的核苷酸序列为seq id no.16，绵羊右同源臂的核苷酸序列为seq id no.17。
[0136]
表5、zfy左右同源臂引物
[0137][0138]
1-3、构建tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞
[0139]
利用本实施例中构建的crispr/cas9基因打靶载体px458-zfy-sgrna和供体质粒ha-l-cbh-tdtomato-sv40polya-ha-r(携带外源基因tdtomato基因，尽管同源臂来源于山羊，但与绵羊对应的同源臂有很高的同源性，因此预计可用于绵羊)将外源基因(tdtomato
基因)通过hmej方法介导的重组定点整合到zfy基因的打靶位点中，构建在zfy基因中定点整合外源基因的绵羊成纤维细胞系。具体步骤如下：
[0140]
1-3-1、基因编辑质粒和供体质粒共转染绵羊成纤维细胞
[0141]
取构建好的供体质粒ha-l-cbh-tdtomato-sv40 polya-ha-r 5000ng和携带zfy靶点的基因打靶载体px458(px458-zfy-sgrna)9536ng(摩尔比1:1.5)通过电转(电转步骤同实施例2中步骤2的电转步骤，仅添加的质粒不同)至原代绵羊成纤维细胞，24h后通过流式分选tdtomato和egfp阳性的原代绵羊成纤维细胞，并以约每皿500个细胞铺到细胞培养10cm细胞培养皿中。培养2周后，通过克隆环将细胞培养皿中的细胞单克隆消化至96孔板中培养。
[0142]
1-3-2、定点整合tdtomato的绵羊成纤维细胞筛选
[0143]
待96孔板的细胞克隆长满后，消化细胞，留一半原孔培养，另取一半细胞至1.5ml离心管中。12000rpm，离心3min，弃去上清，加入50μl的细胞鉴定裂解液(细胞鉴定裂解液配制：tris-hcl(1m，ph＝8.0)2ml，triton x-100 0.45ml，np-40 0.45ml，蛋白酶k 0.02g，加入去离子水溶解并定容至50ml，0.22μm滤器过滤)，充分悬浮细胞，按以下程序裂解：65℃，30min；95℃，15min；16℃，∞。获得的裂解液作为dna模版。按照表6设计引物并进行pcr鉴定。
[0144]
表6、定点整合鉴定引物
[0145][0146]
扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μl，其各种成分分别为：dna模板1μl，10μmol/l上下游引物各1μl，primestar(宝日医生物科技有限公司)10μl，用灭菌去离子水补齐至20μl。pcr反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，62℃退火15s，72℃延伸50s(33个循环)；最后72℃延伸5min。pcr结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0147]
结果显示，裂解了16个细胞单克隆，通过pcr鉴定到3个克隆为zfy定点整合的细胞单克隆。同时通过荧光显微镜观察，三个克隆均发出红色的荧光。说明外源基因(tdtomato基因)在打靶位点处发生了定点整合，成功构建了tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞。
[0148]
2、设计靶点序列、grna序列及基因编辑载体的构建
[0149]
本实施例选择上述步骤1构建的zfy定点整合tdtomato的细胞克隆作为流式分析评估工程改造的全长同向重复序列的编辑效率的细胞株。本实施例针对tdtomato编码序列(ge nbank accession no.kt878736.1的第2529-3959位(update date 06-oct-2015))设计靶向tdtomato的grna(grna2)，靶点序列为5
’‑
aagaccatctacatggccaagaa-3’(seq id no.18)。
[0150]
针对tdtomato基因设计的grna及其编码dna序列如下：
[0151]
tdtomato-grna-wt：cucugaccaccugagagaaugugugcauagucacacaaga ccaucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgtgtg catagtcacacaagaccatctacatggccaagaa；
[0152]
tdtomato-grna-1：cucugaccaccugagagaaugggugcauagucacccaagacc aucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgggtgca tagtcacccaagaccatctacatggccaagaa；
[0153]
tdtomato-grna-2：cucugaccaccugagagaaugcgugcauagucacgcaagacc aucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgcgtgca tagtcacgcaagaccatctacatggccaagaa；
[0154]
tdtomato-grna-3：cucugaccaccugagagaaugugggcauagucccacaagacc aucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgtgggca tagtcccacaagaccatctacatggccaagaa；
[0155]
tdtomato-grna-4：cucugaccaccugagagaaugugcgcauagucgcacaagacc aucuacauggccaagaa(seq id no.19)，其编码dna序列：ctctgaccacctgag agaatgtgcgcatagtcgcacaagaccatctacatggccaagaa(seq id no.20)；
[0156]
tdtomato-grna-13：cucugaccaccugagagaaugggggcauagucccccaagac caucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgggggc atagtcccccaagaccatctacatggccaagaa；
[0157]
tdtomato-grna-14：cucugaccaccugagagaaugggcgcauagucgcccaagac caucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgggcgc atagtcgcccaagaccatctacatggccaagaa；
[0158]
tdtomato-grna-23：cucugaccaccugagagaaugcgggcauagucccgcaagac caucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgcgggc atagtcccgcaagaccatctacatggccaagaa；
[0159]
tdtomato-grna-24：cucugaccaccugagagaaugcgcgcauagucgcgcaagac caucuacauggccaagaa，其编码dna序列：ctctgaccacctgagagaatgcgcgc atagtcgcgcaagaccatctacatggccaagaa。
[0160]
通过下述引物(表7)扩增表达靶向tdtomato基因grna的编码dna序列(其中大写字母标识的为直接重复序列+靶点序列+转录终止信号，小写字母标识的为载体同源序列)。pcr扩增体系：f 1μl，r 1μl，primestar 15μl，ddh2o 13μl。pcr扩增程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸5s(33个循环)；72℃延伸5mi n。pcr完成后将pcr产物通过产物回收试剂盒(广州美基生物科技有限公司，货号d2111-02)进行回收并测定浓度。
[0161]
表7、扩增表达grna的dna片段所用引物(靶向tdtomato基因)
[0162][0163]
通过无缝克隆试剂盒将上述表达grna的dna片段分别与实施例2中spei和kpni双酶切后载体(u6-cbh-cas12i3-t2a-egfp-bgh polya)同源重组成含不同同向重复序列的grna(靶向tdtomato)的9种重组载体，即为基因编辑载体。
[0164]
上述构建得到9种用于tdtomato基因编辑的基因编辑载体，其含有tdtomato基因编辑靶点和本发明设计改造的grna编码dna、以及cas12i3蛋白基因，在导入受体细胞后，其转录出的grna(向导rna)通过碱基互补配对可以靶向tdtomato基因，其表达出的cas12i3蛋白使tdtomato基因靶点上下游的dna双链断裂，从而实现基因编辑功能。
[0165]
3、流式细胞术分析tdtomato荧光变化
[0166]
将上述不同质粒(用于tdtomato基因编辑的基因编辑载体)分别转染到本实施例步骤1中构建的tdtomato红色荧光标记的绵羊成纤维细胞中。电转步骤同实施例2中的电转步骤。48h后，通过流式细胞仪分析wt型(对照组)和不同工程改造的同向重复序列的egfp阳性细胞(只看egfp阳性细胞是因为上述对照载体和8种基因编辑载体上均携带有egfp表达序列，该序列是来源px458载体，egfp阳性细胞代表该细胞是成功转染质粒的细胞，有助减少细胞转染导致的误差)的tdtomato红色荧光强度的变化，具体为计算tdtomato平均荧光强度消失的比例以及荧光强度较弱(egfp阳性细胞中tdtomato荧光强度小于103)的细胞数的占比。
[0167]
通过计算egfp阳性细胞的tdtomato平均荧光强度淬灭的比例显示(图2)，与drf-wt对照组相比，经过工程改造得到的drf-4(seq id no.5)显著地提高了tdtomato平均荧光强度淬灭的比例，表明drf-4在tdtomato基因上具有较高的编辑效率，造成较多细胞中tdtomato蛋白功能失活，最终导致较多细胞红色荧光减弱甚至淬灭，使整体的细胞
tdtomato荧光强度降低，即tdtomato平均荧光强度淬灭的比例较大。同样的，通过计算egfp阳性细胞中的弱tdtomato荧光强度的(《103)的细胞数占比显示，与drf-wt对照组相比，经过工程改造得到的drf-4显著地提高了弱tdtomato荧光强度(《103)的细胞数占比(图3)。
[0168]
本发明工程改造的全长同向重复序列drf-4的核苷酸序列为：
[0169]5’‑
cucugaccaccugagagaaugugcgcauagucgcac-3’(seq id no.5)。其分为5个区段，第一个区段为cucugaccaccug；第二个区段为agagaau；第三个区段为gugcg；第四个区段为cauagu；第五个区段为cgcac。其中第一个区段在全长同向重复序列转录后被cas12i3携带的专用rnase功能域修饰剪切掉，剩余的部分成为截断同向重复序列(truncated direct-repeat，drt)，命名为drt-4，截断同向重复序列drt-4的核苷酸序列为seq id no.5的第14-36位。drt-4为成熟grna的组成部分，是drf-4在生物体内转录后起功能作用的部分，引导cas12i3蛋白进行基因编辑。
[0170]
seq id no.5的第24位核苷酸“胞嘧啶(c)”由“尿嘧啶(u)”突变而来，第33位核苷酸“鸟嘌呤(g)”由“腺嘌呤(a)”突变而来，即将u-a配对改造为c-g配对，经突变改造后，提高了grna茎环结构的稳定性，从而提高cas酶活性，最终提高基因编辑效率。
[0171]
本发明通过碱基突变改变茎环结构的碱基配对，通过t7e1酶切法和流式分析法检测发现其中drf-4相对于drf-wt显著地提高了cas12i3的编辑活性。该同向重复序列工程改造体drf-4与靶向序列(间隔序列，与目的基因的靶点序列互补)所构成的grna在cas蛋白的作用下，可以显著提高基因编辑效率，在加速基因编辑育种、基因编辑等方面有着广泛的应用前景。
[0172]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.rna，其特征在于，所述rna的核苷酸序列如seq id no.5的第14-36位或seq id no.5所示。2.grna，其特征在于，所述grna包括权利要求1所述的rna和靶向目的基因的靶向序列。3.编码权利要求1所述rna或权利要求2所述grna的dna分子。4.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：b1)含有权利要求3所述dna分子的表达盒；b2)含有权利要求3所述dna分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；b3)含有权利要求1所述rna、权利要求2所述grna或权利要求3所述dna分子的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；b4)含有权利要求1所述rna、权利要求2所述grna或权利要求3所述dna分子的重组宿主细胞、或含有b1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有b2)所述重组载体的重组宿主细胞。5.权利要求1所述rna、权利要求2所述grna、权利要求3所述dna分子或权利要求4所述生物材料的下述任一种应用：a1)在基因编辑中的应用；a2)在制备基因编辑系统中的应用；a3)在制备基因编辑产品中的应用；a4)在提高基因编辑效率中的应用；a5)在提高cas蛋白活性中的应用；a6)在目的基因检测或诊断，或在制备用于目的基因检测或诊断的产品中的应用。6.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括下述至少任一种：e1)权利要求1所述的rna；e2)权利要求2所述的grna；e3)权利要求3所述的dna分子；e4)权利要求4中所述的重组载体。7.根据权利要求6所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统还包括cas蛋白。8.权利要求6或7所述的基因编辑系统在基因编辑、制备基因编辑产品、提高基因编辑效率、提高cas蛋白活性或在制备用于目的基因检测或诊断的产品中的应用。9.一种基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的rna、权利要求2所述的grna、权利要求3所述的dna分子、权利要求4中所述的重组载体和/或权利要求6或7所述的基因编辑系统进行基因编辑的步骤。10.一种提高基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法包括将seq id no.1所示的同向重复序列中第24位的u突变为c，第33位的a突变为g。

技术总结
本发明公开了一种工程改造的同向重复序列及其gRNA与应用。具体地公开了核苷酸序列为SEQ ID No.5的第14-36位或SEQ ID No.5的RNA。本发明还公开了包括所述RNA和靶向目的基因的靶向序列的gRNA、基因编辑系统及其应用，以及提高基因编辑效率的方法。本发明对野生型同向重复序列进行工程改造，得到同向重复序列DRf-4。结果表明，本发明同向重复序列DRf-4提高了gRNA茎环结构的稳定性，显著地提高了Cas蛋白的编辑活性，其与靶向序列所构成的gRNA在Cas蛋白的作用下，显著提高了Cas蛋白的基因编辑效率。该同向重复序列及其gRNA在基因编辑领域有着广泛的应用前景。有着广泛的应用前景。


技术研发人员：韩红兵 汪林丽 艾越
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/14