角豆果荚天然小分子化合物DEMOTT的分离提取并鉴定及其应用的制作方法

角豆果荚天然小分子化合物demott的分离提取并鉴定及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种新角豆果荚天然小分子化合物，具有提高免疫力、抗氧化功效的小分子化合物demott。


背景技术：

2.现代免疫学认为，免疫力是人体识别和排除“异己”的生理反应。它能通过人体免疫系统识别人体内正常与不正常的微生物和细胞，并通过免疫应答排除内外致病微生物和细胞，从而维持机体正常运行。免疫力下降会导致身体各个细胞和器官之间的平衡破坏，致病病毒和细菌侵入人体，致机体生病。因此开发提高免疫力的产品具有重要意义。
3.氧化应激(oxidative stress，os)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。事实上，人体几乎所有的器官都很容易受到氧化应激带来的伤害，症状表现不计其数，如疲倦、全身无力、肌肉和关节痛、消化不良、焦虑、抑郁、皮肤瘙痒、头痛，以及注意力难以集中和感染难以痊愈等。由氧化应激水平升高诱发的最常见疾病有心脏病、癌症、骨关节炎、风湿性关节炎、糖尿病以及神经退化性问题如阿尔兹海默症、帕金森病。因此开发抗氧化功能产品具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种角豆果荚天然小分子化合物的制备方法，本发明另一目的在于提供该角豆果荚天然小分子化合物的应用。
5.具体地，本发明从角豆果荚中分离提纯得到的小分子化合物demott，具有良好的提高免疫力和抗氧化功效。
6.本发明所述角豆果荚天然小分子化合物demott的化学式为c
26h28o16
7.本发明所述角豆果荚天然小分子化合物demott的结构如下：
[0008][0009]
本发明以lc-ms/ms为导向对角豆树果荚中的天然小分子成分进行系统分离、波谱解析和结构鉴别；
[0010]
本发明以角豆树果荚为原材料分离提取得到；具体步骤如下：
[0011]
本发明采用醇提法，将提取液浓缩制得浸膏；用水分散浸膏，进行树脂吸附、洗脱；依次使用石油醚和乙酸乙酯分别萃取洗脱液；
[0012]
本发明所述天然小分子demott是由角豆树果荚分离提纯得到的；
[0013]
本发明采用硅胶柱色谱、ods色谱柱、sephadexlh-20和半制备液相等色谱方法逐级进行分离纯化角豆果荚得到的。
[0014]
以上所述方法中，硅胶柱色谱优先采用200～300硅胶柱；优先采用洗脱程序为先采用石油醚-乙酸乙酯(1:1
→
0:1)梯度洗脱，再用二氯甲烷-甲醇(7:1
→
0:1)梯度洗脱。
[0015]
以上所述方法中，ods色谱柱优先采用ods(40～63μm)；优先采用流动相为甲醇-水溶液。
[0016]
以上所述方法中，sephadexlh-20色谱柱洗脱液采用二氯甲烷-甲醇按45～55:55～45体积比洗脱，优先采用50:50。
[0017]
以上所述方法中，半制备液相分离先采用250
×
20mm的ymc-packods-a色谱柱进行分离，再采用250
×
10mm的ymc-pack ods-a色谱柱进行分离。
[0018]
本发明将得到的单体进行核磁数据(1hnmr、
13
cnmr)和分子量的测定。
[0019]
在本发明一些实施例中，所述角豆树果荚为豆科长豆角属植物角豆树(拉丁学名：ceratoniasiliqualinn.)干燥的果荚。
[0020]
本发明通过实验证明，本发明提供的角豆果荚天然小分子demott具有有助于提高免疫力和有助于抗氧化的功效。
附图说明
[0021]
图1为角豆果荚天然小分子化合物demott高分辨质谱图[m+na]
+
[0022]
图2为角豆果荚天然小分子化合物demott的核磁共振氢谱图1hnmr。
[0023]
图3为角豆果荚天然小分子化合物demott的核磁共振碳谱图
13
cnmr。
[0024]
图4为角豆果荚天然小分子化合物demott的化学结构。
[0025]
图5为实验小鼠胸腺指数变化。
[0026]
图6为实验小鼠脾脏指数变化。
具体实施方式
[0027]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028]
以下角豆树果荚为豆科长豆角属植物角豆树(拉丁学名：ceratoniasiliqualinn.)干燥的果荚，由深圳市艾民医药科技有限公司提供。
[0029]
实施例1角豆果荚天然小分子化合物的制备
[0030]
(1)角豆果荚天然小分子化合物的分离纯化
[0031]
取出种子的角豆果荚粉碎至粒径2mm以下，称取粗粉20.0kg，用7倍重量的95％乙醇溶液回流3次(每次1.5h)，再加入8倍重量的70％乙醇溶液回流提取1.5个小时，合并提取液，减压浓缩，回收得到醇提物。将醇提物分散在10倍重量份的水中，经大孔吸附树脂d101进行吸附，用蒸馏水洗脱三个柱体积除去糖类等杂质，再用95％乙醇洗脱3个柱体积，减压浓缩后得到非糖类小分子部位。
[0032]
将得到的非糖类小分子部位用1l50％甲醇溶液分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯分别萃取5次，回收溶剂后分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。经hplc分析(色谱柱为ace5c18柱(4.6x250mm,5μm)；流动相系统为水(a)-甲醇(b)；流速1.0ml/min；柱温30℃，进样量10μl，检测波长254nm；梯度洗脱)发现，非糖类小分子化合物主要集中在乙酸乙酯部位。
[0033]
将干燥的乙酸乙酯部位提取物依次采用200～300目硅胶柱色谱梯度洗脱，洗脱液为石油醚-乙酸乙酯(1:1、1:3、1:5、0:1)、二氯甲烷-甲醇(7:1、5:1、3:1、0:1)，等份接样，经tlc薄层检测，合并相似流份，产生10个组分(a～j)。i组分为石油醚-乙酸乙酯0:1-二氯甲烷-甲醇7:1部分流份。
[0034]
将硅胶柱色谱分离得到的组分i用40～63μmods色谱柱采用15％～100％的甲醇溶液梯度洗脱，经tlc薄层检测，合并相似流份，得到5个亚组份(i1～i5)，组份i4用凝胶色谱sephadexlh-20柱以50:50二氯甲烷-甲醇为流动相分离，流速为0.8ml/min，吸光度为214nm，得到3个组份i4a～i4c，组份i4a用半制备液相(柱ⅰ：ymc-packods-a，250
×
20mm，5μm)以45％甲醇-水溶液为流动相，271nm波长进行分离纯化，再用半制备液相(柱ⅱ：ymc-packods-a，250
×
10mm，5μm)以39％甲醇-水溶液为流动相，271nm波长进行分离纯化得到角豆荚天然小分子化合物demott。
[0035]
(2)角豆果荚天然小分子化合物的结构鉴定
[0036]
将上述制备得到的天然小分子化合物demott进行结构分析。分别采用核磁数据(1hnmr、
13
cnmr)和hr-esi-ms(高分辨率质谱)分子量的测定。1hnmr采用cd3od,600mhz；
13
cnmr采用(cd3od,150mhz)；
[0037]
小分子化合物demott检测结果：
[0038]
小分子化合物demott为白色粉末，hr-esi-ms结果如图1所示，m/z619[m+na]+推断该化合物的分子式c
26h28o16
,不饱和度为12。如图2所示，在1hnmr中观察到2个芳香质子信号[δh7.01(2h,m,h-2"',6"'),6.95(2h,m,h-2",6")。如图3所示，13cnmr谱显示化合物b含有26个碳信号，其中包括12个芳香碳信号(δc146.4、146.3、140.1、139.9、121.1、120.8、110.3、101.2)，3个酯基碳信号(δc172.7、167.8、167.3)，1个甲基碳信号(δc21.5)。以上nmr数据与1,2,6-三-o-没食子酰基-β-d-葡萄糖结构相似。综合以上分析，及结合该化合物的分子式c
26h28o16
，结构鉴定为如图4所示。
[0039]
经调查文献，未发现与小分子化合物demott相同结构的化合物，因此角豆果荚天然小分子化合物demott为新的化合物。实验例2角豆果荚天然小分子化合物demott提高免疫力效果实验9周龄小鼠(雄性，spf级)50只，24
±
2g，适应性饲养5天后随机分成5组，正常对照组，模型组，高、中、低剂量组，每组10只，正常对照组灌胃生理盐水，其余组注射地塞米松建立免疫力低下模型，3天后停止。正常对照组和模型组灌胃生理盐水，高、中、低剂量组灌胃含化合物demott(实施例1制备)的水溶液(给药剂量如表2所示)，连续灌胃21天后颈椎脱臼法处死小鼠，称小鼠体重，取胸腺和脾脏称重，计算胸腺和脾脏指数。结果如表2、图5、图6所示。
[0040]
胸腺(脾脏)指数＝胸腺(脾脏)质量mg/小鼠体重g。
[0041]
表2小鼠免疫器官胸腺、脾脏指数变化
[0042]
组别给药剂量mg/kg胸腺指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)
正常对照组-2.163
±
0.2272.841
±
0.326免疫力低下模型-0.0.322
±
0.054&0.526
±
0.094&高剂量组4000.957
±
0.186*1.144
±
0.073*中剂量组2000.846
±
0.114*0.936
±
0.128*低剂量组1000.335
±
0.0900.572
±
0.110
[0043]
注：&p＜0.001与正常对照组相比，*p＜0.001与模型组相比。
[0044]
结果显示，模型组胸腺、脾脏指数均显著降低，说明造模成功。与模型组相比，中、高剂量组的胸腺、脾脏指数均显著提高(p＜0.001)。表明角豆果荚小分子demott能够提高免疫低下小鼠的胸腺及脾脏指数。说明角豆果荚小分子demott具有有助于提高免疫力的功效。实验例3角豆果荚天然小分子化合物demott抗氧化效果实验
[0045]
选用10月龄spf级雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分为正常对照组，高、中、低剂量组。正常对照组灌胃生理盐水，高(0.8g/kg)、中(0.4g/kg)、低(0.2g/kg)剂量组连续灌胃不同浓度的含角豆果荚天然小分子demott水溶液，连续灌胃30天，一天一次。实验结束时禁食16小时，然后一次性灌胃50％乙醇12ml/kgbw,6小时后处死小鼠，测血清中丙二醛(mda)含量、肝组织中谷胱氨肽过氧化物酶(gsh-px)活力及超氧化物歧化酶(sod)活力。测量方法参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中抗氧化功能检验方法与操作规程进行。
[0046]
表3
[0047][0048][0049]
注：与正常对照组相比*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
[0050]
结果显示，灌胃角豆果荚小分子demott组mda含量均明显降低，gsh-px活力均明显提高，高剂量组sod活力明显提高。说明角豆果荚天然小分子demott具有有助于抗氧化的功效。
[0051]
综上所述，本发明提供的角豆果荚天然小分子demott具有有助于提高免疫力和有助于抗氧化的功效，可用于食品、药物或化妆品的开发。
[0052]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种角豆果荚天然小分子化合物，其化学式为c
26
h
28
o
16
。2.根据权利要求1所述角豆果荚天然小分子化合物，其结构如下：3.上述权利要求1～2角豆果荚天然小分子化合物制备方法，其特征在于，包括采用硅胶柱色谱分离、ods色谱柱分离、sephadex lh-20分离和半制备hplc分离等方法逐级进行分离纯化角豆果荚得到的。4.权利要求1～3所述化合物具有有助于提高免疫力的功效，制备用于食品、药品、保健品领域的应用。5.权利要求1～3所述化合物具有有助于抗氧化的功效，制备用于食品、药品、保健品领域的应用。

技术总结
本发明涉及一种从角豆果荚中分离到新的天然小分子化合物的分离提取方法及应用。通过核磁数据和分子量测定阐明化学结构。角豆果荚天然小分子化合物DEMOTT有助于提高免疫力和有助于抗氧化。有助于抗氧化。有助于抗氧化。


技术研发人员：吴成 李泽恩 李太娟 全小红 迪丽胡玛尔
受保护的技术使用者：融致丰生制药有限公司
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/8/14