一种同时传感ONOO-与pH的BODIPY类荧光探针的制备方法及应用

一种同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针的制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及了一种同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针的制备方法及应用。


背景技术：

2.onoo-作为生物体内很重要的活性氮(rns)之一，在维持生物体内环境稳态具有一定的协调与帮助，但是异常水平的onoo-会导致细胞中的细胞器造成氧化损伤，甚至会导致细胞发生凋亡，因此会进一步引发生物体组织或器官发生病变导致疾病发生。而在细胞凋亡过程中，往往会伴随细胞内环境ph的降低(酸化)，如线粒体内环境的ph值会由稳定状态的ph～8.4降低至ph～6.0。因此设计一种同时传感onoo-与ph的荧光探针有利于认识生物体内两者之间的相互作用关系，研究生物体内复杂的生理和病理变化过程，并且有助提高疾病诊断的准确性。
3.荧光成像技术具有优异的时空采样能力，较高的灵敏度和无创性的优点，受到广泛关注。硼氟二吡咯(bodipy)作为成像技术所需要的荧光染料之一，具有较高的荧光量子产率、较大的摩尔吸光系数、较低的细胞毒性以及良好的化学稳定性等特点。同时bodipy主体结构容易进行功能化修饰，从而优化染料结构并精细调节光谱特性。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针的制备方法及应用。本发明基于bodipy荧光团，引入具有线粒体靶向功能的吲哚盐基团，得到同时传感onoo-与ph的荧光探针。当探针传感onoo-时，会呈现比率型荧光信号；当传感ph时，会呈现荧光强度增强信号。通过该探针不同的荧光信号变化监测动物炎症组织中的onoo-与ph变化，基于炎症组织中onoo-水平的增加以及ph的下降存在高度相关性，对onoo-与ph的检测可以用于炎症疾病的病理性研究和诊断。
5.所述的同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针的结构式如下所示：
[0006][0007]
其中x为oh、cooh或n(ch3)2。
[0008]
所述的同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针的制备方法为：在氮气或惰性气体保护下，将mobdp-cho与吲哚盐化合物按照1:1-1.3的摩尔比溶解于无水乙醇中，78-85℃回流反应6-8h后，冷却至室温，减压蒸发得到粗产物，最后经硅胶柱色谱纯化。
[0009]
所述吲哚盐化合物为1,2,3,3-四甲基-3h-吲哚碘化物、1-乙基-2,3,3-三甲基-3h-吲哚碘化物、1,1,2,3-四甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化物、1,2-二甲基苯并吲哚碘化物中的一种或几种。
[0010]
所述的mobdp-cho的结构式为：
[0011][0012]
上述同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针在制备活细胞中的onoo-与ph的传感试剂或成像试剂的应用。
[0013]
上述同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针在制备监测炎症组织中的onoo-与ph的试剂的应用。
[0014]
本发明的有益效果在于：
[0015]
1)本发明基于bodipy荧光团构建的双目标传感(onoo-与ph)的荧光探针，该荧光团为稳定的共轭平面结构，具有荧光量子产率高、物理化学性质稳定和结构易于修饰等特点，光谱性质可根据对bodipy主体结构的修饰进行调控，光谱范围从可见光至近红外区；
[0016]
2)本发明设计的bodipy类荧光探针能分别对onoo-与ph进行传感与成像，并呈现不同的荧光信号变化，避免信号串扰，而现有的单目标检测型荧光探针不能满足该要求。由于onoo-与ph两种目标物在生理和病理过程中具有一定的相互联系与动态变化，因此通过该探针达到双目标检测，实时成像反映两者在生理和病理中的联系与变化，实现一举多得
的效果；
[0017]
3)该荧光探针不仅在溶液环境中对onoo-与ph具有良好的传感与成像效果，还可以应用于生物体内的研究，有效地实现细胞内或体内onoo-与ph的传感与实时监测，如细胞凋亡以及多种炎症疾病中onoo-与ph的传感与成像。
附图说明
[0018]
图1为本发明所述探针mobdp-i的合成路线。
[0019]
图2为本发明所述探针mobdp-i在水相环境中的光谱性质。其中，(a)探针mobdp-i传感onoo-的紫外可见吸收光谱变化；(b)探针mobdp-i传感onoo-的荧光光谱变化；(c)探针mobdp-i传感onoo-的比率荧光强度变化线性拟合图；(d)探针mobdp-i传感ph的紫外可见吸收光谱变化；(e)探针mobdp-i传感ph的荧光光谱变化；(f)探针mobdp-i传ph的荧光强度变化线性拟合图。
[0020]
图3为本发明所述探针mobdp-i可逆传感ph的测试。
[0021]
图4为本发明探针mobdp-i的线粒体共定位成像应用。
[0022]
图5为本发明探针mobdp-i对活细胞外源性onoo-成像应用。
[0023]
图6为本发明探针mobdp-i对活细胞内源性onoo-成像应用。
[0024]
图7为本发明探针mobdp-i活细胞内源性ph成像应用。
[0025]
图8a、图8b、图8c为本发明探针mobdp-i对小鼠关节炎的成像应用。
[0026]
图9a、图9b为本发明探针mobdp-i对小鼠腹膜炎的成像应用。
[0027]
图10为本发明探针mobdp-i的氢谱核磁图。
[0028]
图11为本发明探针mobdp-i的碳谱核磁图。
[0029]
图12为本发明探针mobdp-i的高分辨质谱图。
具体实施方式
[0030]
实施例1
[0031]
(1)mobdp的合成：在氮气保护下，将4.42mmol对羟基苯甲醛和9.74mmol的2,4-二甲基吡咯溶解于50ml的四氢呋喃(thf)中加入0.1ml的三氟乙酸(tfa)，所得混合物在室温下搅拌12h。随后将1.0g的2,3-二氯-5,6-二氰基对苯醌(ddq)溶于10ml的thf中并缓慢加入到上述反应液中，继续于室温下反应6h。在冰水浴条件下，向上述反应液中缓慢滴加7.5ml的三乙胺(tea)，30min后滴加等体积的三氟化硼乙醚(bf3
·
oet2)，将所得混合物在室温下搅拌8h。反应结束后，减压除去溶剂，将残余物溶于ch2cl2，用饱和nahco3溶液萃取，将有机层分离并使用无水naso4干燥，减压蒸发得到粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到橙红色晶状固体。
[0032]
(2)mobdp-cho的合成：在氮气保护下，将5ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与5ml的三氯氧磷(pocl3)先后加入100ml的两口瓶中，室温持续搅拌30min。将步骤(1)所得到的mobdp溶解于30ml的1,2-二氯乙烷(dce)中，使用注射器将其加入两口瓶中，于60℃下反应3h。反应结束后，将反应溶液冷却至室温并缓慢转移至0-4℃的饱和nahco3溶液中，搅拌30min进行淬灭。混合溶液用水和ch2cl2洗涤萃取，将有机层分离并使用无水naso4干燥，减压蒸发得到粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到橙黄色固体粉末。
[0033]
(3)mobdp-i的合成：氮气保护下，将mobdp-cho(150mg，0.41mmol)，1,2,3,3-四甲基-3h-吲哚碘化物(147mg，0.49mmol)溶解于无水乙醇(etoh，20ml)中并加入到100ml的两口烧瓶中，于85℃反应回流8h。反应结束后，将反应自然冷却至室温，减压蒸发，收集粗产物。使用硅胶柱色谱法进行纯化。(vdcm/vmeoh＝50:1～10:1)，得到紫绿色固体晶状物(120mg)，产率78％。
[0034]
1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.02(s,1h),δ8.06(d,1h,j＝16.3hz),δ7.88-7.82(m,2h),δ7.63-7.55(m,2h),δ7.22(d,j＝8.5hz,2h),δ7.00(d,2h,j＝8.5hz),δ6.94(d,1h,j＝16.3hz),δ6.49(d,1h,j＝1.2hz),δ4.00(s,3h),δ2.82(s,3h),δ2.57(s,3h),δ1.73(s,9h),δ1.53(s,3h)。
[0035]
13c nmr(101mhz,dmso-d6)δ182.47,162.19,159.18,157.35,155.55,148.02,144.87,144.05,143.43,142.33,140.52,134.53,134.51,131.43,129.75,129.41,129.24,125.69,125.62,125.06,123.96,123.30,116.77,115.16,111.51,55.40,52.89,40.63,40.42,40.21,40.01,39.80,39.59,39.38,34.45,26.85,15.31,14.28,13.62。
[0036]
质谱结果：计算值524.27(m/z)，实测值524.5。
[0037]
氢谱核磁图，核磁碳谱图和高分辨质谱图见图10，图11和图12。
[0038]
mobdp-i的结构式为：
[0039][0040]
探针mobdp-i的光谱性质：
[0041]
将探针mobdp-i溶解在二甲基亚砜(dmso)中制成储备溶液(1mm)，然后分别溶解在pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4，0.1m)中形成工作溶液(10μm)。为了探究探针mobdp-i对onoo-的传感能力，随后测试了在mobdp-i的pbs工作液中加入onoo-前后的紫外可见吸收光谱的变化，结果如图2(a)所示。未加入onoo-的mobdp-i溶液的紫外可见吸收光谱在550nm处出现最大吸收峰。随着加入的onoo-的浓度的升高(0-10μm)，onoo-的强氧化性使探针结构中的c＝c键断裂，导致mobdp-i在溶液中的浓度降低，550nm处的最大吸收峰值也随之降低，溶液颜色变浅(图2(b)插图)。
[0042]
进一步对探针mobdp-i进行了荧光滴定测试。将不同浓度的onoo-(0-10μm)滴加到mobdp-i的pbs工作溶液中，测试其发射光谱的变化，结果如图2(b)所示。未加入onoo-前，mobdp-i在510nm处具有较低的发射峰，而在596nm具有较高的发射峰。加入不同浓度的onoo-后，发射波长596nm处的最高峰值降低，同时发射波长510nm处的最高峰值逐渐增加。在onoo-的存在下，探针结构中bodipy骨架与吲哚盐基团相连的c＝c键被氧化并断裂。荧光光谱测试结果显示mobdp-i在510nm处的荧光增强了20倍，而在596nm处的荧光几乎消失，并伴随着荧光比率信号(i510/i596)高达10倍的增强。结果表明，探针mobdp-i可以对onoo-进行传感，并产生比率荧光信号变化。探针mobdp-i的比率荧光变化与onoo-的浓度在0-1当量范围内具有良好的线性拟合关系，线性方程y＝7.4006x+0.2601，线性回归系数r2＝0.9907(图2c)。由lod＝3σ/s计算探针mobdp-i对onoo-的检测限(lod)为9.6nm，其中σ为无onoo-时
探针荧光强度的标准偏差，s为线性方程斜率。结果均表明探针mobdp-i对onoo-传感灵敏度较高。
[0043]
作为具有双目标传感能力的探针，上述测试证明了探针mobdp-i对onoo-具有较好的传感能力以及低检测限(9.6nm)。随后为了探究探针mobdp-i对ph的传感能力，测试了探针mobdp-i在不同ph缓冲液中的紫外可见吸收光谱的变化，结果如图2(d)所示。随着ph值的增加，探针mobdp-i在不同ph缓冲溶液中的紫外可见吸收最大峰值在550nm处逐渐降低。
[0044]
探针mobdp-i在碱性环境中紫外可见吸收值逐步降低，随后为了探究探针mobdp-i在不同ph缓冲液中的荧光光谱的变化，结果如图2(e)所示。由于羟基在碱性环境中转变为氧负离子，成为强电子供体，使探针结构产生ict效应。当ph值从12.0降至2.0时，mobdp-i在596nm处的荧光强度增加了13倍。随着ph值的升高，探针mobdp-i位于596nm处的发射强度逐渐降低，并且溶液的颜色逐渐变浅(图2(e)插图)，表明探针mobdp-i具有传感ph的能力。探针mobdp-i的浓度与ph呈良好的线性拟合关系，线性方程y＝-348.89x+3841.83，线性回归系数r2＝0.9870(图2(f))。表明探针mobdp-i对ph传感灵敏度高。
[0045]
探针mobdp-i可逆传感ph的测试：
[0046]
为了进一步探究探针mobdp-i具备可逆传感ph能力的可能性，分别测试了探针mobdp-i在ph＝2.0～12.0和ph＝6.0～8.0范围内的荧光强度变化。图3(a)为归一化后，探针mobdp-i在596nm处的荧光随ph变化曲线。为了保证结果的准确性，该实验测试了5个循环。探针mobdp-i在发射波长为596nm、ph＝2.0时具有较强的荧光强度，而在发射波长为596nm、ph＝12.0时几乎不发射荧光。在细胞凋亡过程中，细胞器线粒体的ph降低。在组织处于炎症状态时，组织环境也会逐渐酸化。因此，为了模拟细胞内ph环境，随后调整该实验的ph范围，将ph范围从2.0～12.0调整为6.0～8.0。结果如图3(b)所示，与ph＝2.0～12.0相似，探针mobdp-i在发射波长为596nm、ph＝6.0时具有较强的荧光，在596nm、ph＝8.0时的荧光强度减弱。以上结果表明，5个循环后，探针mobdp-i仍具有可逆传感ph的能力。
[0047]
探针mobdp-i的线粒体共定位成像应用：
[0048]
探针mobdp-i结构中有带正电荷的吲哚季铵盐基团，由于细胞线粒体内膜带负电荷，因此可能对线粒体具有靶向能力。为探究荧光探针mobdp-i是否具有线粒体靶向能力，进行了线粒体共定位成像实验。选用hela细胞为研究对象，将商用线粒体共定位荧光探针rh 123与探针mobdp-i进行共孵育后进行共聚焦荧光成像，结果如图4所示。rh 123将hela细胞的线粒体染色为绿色，mobdp-i将hela细胞的线粒体染色为红色，通过las af lite软件和imagej win64软件进行分析并得出皮尔森共定位相关系数r＝0.96，二者具有良好的重叠效果。线粒体的共定位结果表明探针mobdp-i具有靶向细胞内线粒体的能力，可在亚细胞水平上对线粒体内的目标物的波动进行传感与成像。
[0049]
探针mobdp-i对活细胞外源性onoo-成像应用：
[0050]
为了探究探针mobdp-i在细胞内传感onoo-的能力，构建了活细胞外源性onoo-模型。前述光谱测试结果表明，探针mobdp-i在与onoo-相互作用后，会产生比率荧光信号，即发射波长位于596nm的荧光信号减弱而发射波长位于510nm处的荧光信号增强。为了在细胞水平验证探针mobdp-i对外源性onoo-的传感能力，选择hela细胞对其进行研究。因此，该细胞实验分为6组进行。以未加入外源性onoo-的hela细胞作为对照组；以加入不同当量onoo-共孵育的hela细胞作为实验组，研究探针mobdp-i对onoo-比率传感与成像的能力。在加入
onoo-前，首先使用探针mobdp-i(10μm)对hela细胞进行孵育30min。随后向hela细胞中加入含不同当量onoo-(0μm、2μm、4μm、6μm、8μm、10μm)的dmem培养基并孵育30min后进行共聚焦成像。如图5(a)所示，第一行是在596nm发射波长下的成像结果，第二行是在510nm发射波长下的成像结果，第三行是第一、二行对应图像的通道合并结果。每一列为对应onoo-当量的不同通道的成像结果。细胞成像结果表明，空白对照组的绿色通道(i510)下的hela细胞几乎没有荧光，而红色通道(i596)具有明显的荧光(第一列)。随着不同当量的onoo-的加入，绿色通道的荧光逐渐增强，而红色通道的荧光逐渐减弱，这与溶液中传感onoo-的结果(图2(b))一致，表明探针mobdp-i对onoo-具有良好的传感能力，可以对活细胞外源性onoo-进行比率传感与成像。为了量化图5(a)的成像效果，使用imagej win64软件对成像图片的荧光强度进行提取计算，并使用originpro 2016 64bit软件绘制荧光强度曲线。如图5(b)所示，随着onoo-的增加，i510逐渐增强而i596逐渐减弱，在onoo-当量约为0.5时，两个通道的荧光强度几乎相等，随后，i510的强度始终大于i596的强度。将i510和i596进行比值处理后(i510/i596)，随着onoo-的当量的增加，i510/i596逐渐升高；当onoo-的当量为1.0时，i510/i596和对照组相比增强了约9倍(图5(c))。
[0051]
探针mobdp-i对活细胞内源性onoo-成像应用：
[0052]
上述的实验结果验证了探针mobdp-i可在活细胞中传感外源性onoo-，为了进一步探究探针mobdp-i在细胞层面传感onoo-的能力，构建了活细胞内源性onoo-模型，用于测试探针mobdp-i对内源性onoo-的传感与成像能力。巨噬细胞(raw264.7)是一种炎症组织中的白细胞，负责杀灭坏死、凋亡的细胞。使用脂多糖(lps)刺激raw264.7细胞，可以诱导raw264.7细胞产生过量的内源性onoo-。因此，本实验使用lps刺激raw264.7细胞产生内源性onoo-，以构建细胞内内源性onoo-模型。本实验分为4组进行。以未经lps刺激的raw264.7细胞为阴性对照组，以外源性onoo-模型为阳性对照组，以lps刺激的raw264.7细胞为实验组。如图6所示，阴性对照组中的红色通道的荧光强度明显强于绿色通道；在外源性onoo-模型中，绿色通道明显强于红色通道。经lps刺激的raw264.7细胞与探针孵育3h时，绿色通道的荧光强度要强于红色通道，而在lps与minocyclin(一种onoo-清除剂)共孵育3h后，绿色通道仅有微弱的荧光现象，而红色通道的荧光强度仅次于阴性对照组。综合细胞成像实验结果表明，探针mobdp-i可以对活细胞外源性和内源性onoo-进行比率传感与成像，避免了单一通道造成的背景干扰导致的假阳性结果。
[0053]
探针mobdp-i活细胞内源性ph成像应用：
[0054]
在生理条件下，线粒体基质的ph约为8.2左右。线粒体基质ph的改变是异常细胞的关键特征，比如线粒体功能的抑制导致线粒体去极化，质子(h+)进入线粒体加速，导致线粒体内环境酸化(ph～6.0)。线粒体内环境ph的异常与多种疾病病理密切相关。因此，在细胞凋亡过程中，对线粒体内ph变化的传感对揭示生理和病理条件下线粒体功能的核心特征具有重要意义。
[0055]
前述实验已经证实探针mobdp-i具有靶向线粒体的能力，并且探针mobdp-i在ph＝6.0时的i596相比在ph＝8.0时具有较强的荧光。为了研究探针mobdp-i传感线粒体内ph，尤其在细胞凋亡过程中的ph变化。因此我们使用羰基氰化氯苯腙(cccp)诱导细胞线粒体内环境酸化，导致细胞凋亡。如图7(a)所示，研究了不同浓度的cccp(0μm、10μm、30μm、50μm)诱导细胞凋亡后的细胞内ph变化。hela细胞在不同浓度的cccp的诱导下，表现出了不同的凋亡
程度。随着cccp浓度的升高，细胞的i596荧光强度逐渐增强，说明线粒体内ph逐渐降低。由于cccp诱导细胞凋亡过程中不涉及onoo-的产生，探针mobdp-i的绿色通道(i480)仅发射微弱的荧光。随后使用imagej win64软件对图像的荧光强度量化处理，结果如图7(b)所示。hela细胞在10μm的cccp的孵育下，探针mobdp-i在596nm处荧光强度明显增强，大约是对照组的3倍。随着cccp浓度的升高，i596的荧光强度逐渐增强趋于饱和。以上结果表明，探针mobdp-i可以传感cccp诱导的细胞凋亡内ph的变化。
[0056]
探针mobdp-i对小鼠关节炎的成像应用：
[0057]
小鼠关节炎作为炎症模型之一，被科研人员广泛用于测试荧光探针对炎症病理过程中的生物标志物的研究。首先对关节炎模型的构建以及探针mobdp-i是否具有效果进行预实验。如图8a所示，随着被注射的λ-卡拉胶(λ-carr)浓度增加，相比于空白对照组的健康小鼠，实验组的小鼠关节处绿色通道(λex＝460nm，λem＝510-550nm)的荧光强度增加，而红色通道(λex＝570nm，λem＝650-700nm)的荧光强度减弱。结果表明，我们成功构建小鼠关节炎模型，并且通过使用探针mobdp-i在小鼠炎症关节中检测到onoo-。因此，为了在对炎症病理的进一步对炎症疾病中的onoo-与ph变化进行研究，将小鼠关节炎成像实验分为两部分来体现探针mobdp-i在活体中同时传感onoo-与ph的能力。第一部分，在炎症组织中对恒定的ph和变化的onoo-进行体内荧光成像；第二部分，在小鼠关节炎中中对恒定的onoo-和变化的ph进行体内荧光成像。
[0058]
第一部分，在炎症组织中对恒定的ph和变化的onoo-下进行体内的荧光成像。将c57bl/6小鼠分为两组，每只小鼠的左肢作为对照组，分别原位注射pbs缓冲液(50μl，ph＝7.4)。而后我们在的右肢关节原位注射λ-carr(50μl，5mg/ml)，诱发小鼠关节处产生关节炎。8h后，将nac(50μl，30mg/kg，onoo-清除剂)原位注射到其中一只小鼠的右肢关节中。经过1h后，将探针mobdp-i(20μm，50μl，vdmso/vsaline＝1:9)原位注射到每只小鼠的后肢关节中，并对小鼠进行麻醉，进行体内荧光成像。通过living image 64bit软件对成像图片的荧光强度进行量化。如图8b所示，空白对照组的小鼠关节处的红色通道有明显的荧光，而绿色通道几乎没有荧光。相反，实验组的红色通道荧光强度减弱，而绿色通道的荧光强度明显增强，两个通道的荧光强度比增加了6倍。为了证实这一现象是由onoo-的产生引起的，在实验组中加入nac(30mg/ml，50μl，一种onoo-清除剂)，却不影响ph的变化，保持实验组中的ph相对一致。红色通道的荧光强度恢复，绿色通道几乎无荧光。因此，第一部分实验结果表明，当小鼠炎症组织内ph保持相对一致时，探针mobdp-i对小鼠关节炎疾病中的onoo-能进行灵敏传感与成像。
[0059]
第二部分，在小鼠关节炎中对恒定的onoo-和变化的ph进行体内的荧光成像。将c57bl/6小鼠分为两组，每只小鼠的左肢作为空白对照组，分别原位注射pbs缓冲液(50μl，ph＝7.4)。而后对小鼠右肢关节原位注射等浓度λ-carr(50μl，5mg/ml)，诱发小鼠关节处产生关节炎。8h后，对小鼠的右肢分别原位注射pbs缓冲液(50μl，ph＝6.0和50μl，ph＝7.4)。接下来1h后，将探针mobdp-i(20μm，50μl，vdmso/vsaline＝1:9)原位注射到每只小鼠的后肢关节中，并对小鼠进行麻醉，进行体内荧光成像。通过living image 64bit软件对成像图片的荧光强度进行量化。如图8c所示，实验组的绿色通道的荧光强度比对照组强。双通道的荧光强度在ph＝6.0条件下的都比ph＝7.4条件下的强，但两个荧光通道的荧光强度之比几乎相似。因此，第二部分实验结果表明，当炎症组织内onoo-水平保持相对一致时，探针
mobdp-i对小鼠关节炎疾病中的ph能进行灵敏传感与成像。
[0060]
探针mobdp-i对小鼠腹膜炎的成像应用：
[0061]
上述成像实验表明探针mobdp-i能对小鼠关节炎中的onoo-与ph变化进行传感与成像。为了验证探针mobdp-i在多种炎症疾病的适用性。随后构建小鼠腹膜炎模型，测试探针mobdp-i的应用能力。同样将小鼠腹膜炎成像实验分为类似于关节炎成像实验的两部分。
[0062]
第一部分，在小鼠腹膜炎中对恒定的onoo-和变化的ph进行体内荧光成像。成像结果以及荧光强度的量化分析如图9a所示，空白对照组小鼠腹部的红色通道有明显的荧光，而绿色通道的荧光强度较弱。相反，实验组小鼠腹部的红色通道荧光强度减弱，而绿色通道的荧光强度明显增强。同样为了证实这一现象是由onoo-的产生引起的，在实验组的一只小鼠腹部原位注射nac(30mg/ml，50μl)，却不影响ph的变化，保持实验组中的ph相对一致。红色通道的荧光强度恢复，绿色通道几乎无荧光。因此，第一部分实验结果表明，当炎症组织内ph保持相对一致时，探针mobdp-i对小鼠腹膜炎疾病中的onoo-能进行灵敏传感与成像。
[0063]
第二部分，在小鼠腹膜炎中对恒定的onoo-和变化的ph进行体内的荧光成像。成像结果如图9b所示，实验组(ph＝6.0)小鼠腹部的绿色通道的荧光强度比实验组(ph＝7.4)的稍强，与探针mobdp-i在关节炎成像实验的结果相似。
[0064]
两种炎症模型的结果均显示，探针mobdp-i可以灵敏的传感炎症组织中的onoo-与ph变化，呈现的荧光信号变化与光谱测试中的结果相符。
[0065]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的结构式如下所示：其中x为oh、cooh或n(ch3)2。2.根据权利要求1所述的同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的具体操作为：在氮气或惰性气体保护下，将mobdp-cho与吲哚盐化合物按照1:1-1.3的摩尔比溶解于无水乙醇中，78-85℃回流反应6-8h后，冷却至室温，减压蒸发得到粗产物，最后经硅胶柱色谱纯化。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吲哚盐化合物为1,2,3,3-四甲基-3h-吲哚碘化物、1-乙基-2,3,3-三甲基-3h-吲哚碘化物、1,1,2,3-四甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化物、1,2-二甲基苯并吲哚碘化物中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的mobdp-cho的结构式为：5.根据权利要求1所述的同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针在制备活细胞中的onoo-与ph的传感试剂或成像试剂的应用。6.根据权利要求1所述的同时传感onoo-与ph的bodipy类荧光探针在制备监测炎症组织中的onoo-与ph的试剂的应用。

技术总结
本发明公开了一种同时传感ONOO-与pH的BODIPY类荧光探针的制备方法及应用。本发明基于BODIPY荧光团，引入具有线粒体靶向功能的吲哚盐基团，得到同时传感ONOO-与pH的荧光探针。当探针传感ONOO-时，会呈现比率型荧光信号；当传感pH时，会呈现荧光强度增强信号。通过该探针不同的荧光信号变化监测动物炎症组织中的ONOO-与pH变化，基于炎症组织中ONOO-水平的增加以及pH的下降存在高度相关性，对ONOO-与pH的检测可以用于炎症疾病的病理性研究和诊断。的检测可以用于炎症疾病的病理性研究和诊断。的检测可以用于炎症疾病的病理性研究和诊断。


技术研发人员：王卓 胡子威
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2023.05.07
技术公布日：2023/8/14