一种基于4-羧基-4’-(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法及其抗菌应用

一种基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法及其抗菌应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法及其抗菌应用。


背景技术：

2.细菌感染一直以来都是人类健康的重要威胁，由于抗生素使用不规范和滥用导致细菌耐药性问题持续升级。与此同时，细菌生物膜进一步增加了细菌感染的发病率和死亡率，给医疗保健部门带来了沉重的压力。在生物膜状态下，细菌病原体对外部攻击(例如抗生素、化学药品、消毒剂等)具有明显的抵抗力，增加了有效给药治疗的难度。针对细菌感染的严重威胁，开发有效的新型非抗生素类抗菌剂是预防和缓解细菌感染和生物膜发展威胁的有效途径。
3.研究人员对天然来源的抗菌剂产生了极大兴趣。苯甲酸是一种天然来源的有机酸，常存在于动植物及微生物中。苯甲酸已被证实具有抗菌活性，而被应用于食品防腐和日化品等领域。苯甲酸衍生物具有优越的改性价值，通过合理的结构调控和结构修饰，可产生较强的抗菌活性。目前，基于苯甲酸及其衍生物的抗菌应用研究大多缺乏对机理的探索、生物安全性评估和体内抗菌应用，有待进一步深入了解这些化合物的作用机制和体内应用前景，以促进开发类似抗菌机制的新型非抗生素类抗菌剂。


技术实现要素：

4.为克服抗菌剂使用过度和滥用的问题，并有效实现对细菌和生物膜的抗菌应用，本发明提供了一种基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法及其抗菌应用。本发明以4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯为分子结构主干，通过引入抗菌活性基团，实现了调控分子与细菌相互作用的亲和力和抗菌活性的目的，并得出了分子结构-抗菌效果之间的构效关系，探究了分子的潜在抗菌机制。
5.所述的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的结构式如下：
[0006][0007]
所述的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法为：
[0008]
步骤s1：按摩尔比10-25:90-110:1:140-180将三(4-溴苯基)胺、对甲氧羰基苯硼酸、四三苯基膦钯和碳酸钾溶解在1，4-二氧六环和水的混合溶剂中，在氮气或惰性气体保护下，85-95℃回流反应8-12h；冷却至室温后，使用二氯甲烷和/或乙酸乙酯萃取反应液得到粗产物，使用硅胶柱提纯粗产物；
[0009]
步骤s2：将步骤s1的产物溶解于1，4-二氧六环和水的混合溶剂中，然后加入饱和碳酸钾水溶液，90-98℃回流反应44-48h；冷却至室温后，加酸调ph值至2-3；旋干析出固体。
[0010]
所述的1，4-二氧六环和水的混合溶剂中1，4-二氧六环和水的体积比为18-22:1。
[0011]
所述步骤s2中1，4-二氧六环和水的混合溶剂与饱和碳酸钾水溶液的体积比为4-6:1。
[0012]
上述的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物在制备抗菌剂中的应用。
[0013]
本发明的有益效果在于：
[0014]
(1)本发明提供的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法，该方法合成路径简单且适用性强。
[0015]
(2)本发明选取4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯为分子主干，修饰带有抗菌活性的苯甲酸基团，并通过调控取代基的数量，有效平衡了化合物整体的亲疏水性和细胞毒性，实现了对分子物化性质的调控，有效的通过疏水相互作用和氢键相互作用提升了化合物对细菌的亲和力，同时降低了其对哺乳动物细胞及血液的毒性，达到了探究分子结构与抗菌性能构效关系的目的。为后续非抗生素类抗菌剂的开发工作提供了一定的设计思路。
[0016]
(3)本研究提供的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物显示出良好的抵抗金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌及其生物膜的能力，尤其是针对s.aureus。不仅可以杀灭和抑制浮游的s.aureus及其生物膜，还能有效用于小鼠伤口感染模型，抑制小鼠伤口细菌感染的进一步发展，有效促进伤口愈合，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)分别为0.039μg/ml和0.156μg/ml。同时，tpa-3ca还展现良好的s.aureus生物膜的清除能力，并还可有效用于抑制因s.aureus引起的小鼠伤口感染。
[0017]
(4)本研究基于tpa-3ca良好的抗菌效果，初步探究了其内在涉及的抗菌机制。主要包括，抑制重要酶的活性、诱发细菌发生氧化应激、破坏细胞质膜通透性和细菌膜结构的完整性等。
[0018]
(5)本研究提供的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物具有较高的抗菌活性和生物相容性，低细胞毒性和低溶血副作用，具有良好的生物安全性。
附图说明
[0019]
图1是实施例1制得的tpa-3ca对s.aureus最小杀菌浓度的平板示意图；
[0020]
图2是实施例1制得的tpa-3ca与二氢叶酸还原酶(dhfr)的分子对接模拟；
[0021]
图3是实施例1制得的tpa-3ca对s.aureus细胞质膜通透性的影响；
[0022]
图4是实施例1制得的tpa-3ca对s.aureus活性氧水平的影响；
[0023]
图5是实施例1制得的tpa-3ca对s.aureus微观形貌影响的扫描电镜图；
[0024]
图6是实施例1制得的不同浓度的tpa-3ca对hela细胞的细胞毒性；
[0025]
图7是实施例1制得的不同浓度的tpa-3ca的溶血情况示意图；
[0026]
图8是实施例1制得的不同浓度的tpa-3ca对生物膜结晶紫(cv)染色的实拍图，图(b)是通过酶标仪对图(a)进行的量化表征；
[0027]
图9是实施例1制得的tpa-3ca对小鼠背部全层伤口感染模型的治疗效果实拍图，图(b)是通过imagej.2.0对图(a)进行的量化表征；
[0028]
图10是实施例1制得的tpa-3ca对小鼠背部全层伤口感染细菌抑制情况的示意图。
具体实施方式
[0029]
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0030]
实施例1
[0031]
tpa-3ca的合成：
[0032]
称取三(4-溴苯基)胺(5.00g，10.37mmol)，对甲氧羰基苯硼酸(8.81g，48.95mmol)，四三苯基膦钯(0.60g，0.52mmol)和碳酸钾(11.45g，82.84mmol)充分溶解于250ml的1，4-二氧六环的水溶液中，在氮气保护下，90℃回流10h。冷却至室温后，使用二氯甲烷萃取反应混合物得到粗产物。粗产物使用硅胶柱提纯，选取石油醚/二氯甲烷＝1:6(v/v)洗脱。得到化合物1，为浅黄色固体(2.31g，产率：46.20％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.12(d,j＝8.5hz,6h),7.68(d,j＝8.5hz,6h),7.60(d,j＝8.7hz,6h),7.28(d,j＝8.7hz,6h),3.97(s,9h).
[0033]
将化合物1(2.31g，3.57mmol)充分溶解于25ml的1，4-二氧六环的水溶液中，加入4.7ml饱和碳酸钾的水溶液，95℃回流48h。冷却至室温后，加入稀盐酸的水溶液酸化。旋干析出的固体，得到tpa-3ca，为橙黄色固体(1.83g，产率：79.22％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.94(s,3h),8.01(d,j＝8.4hz,6h),7.79(dd,j＝19.1,8.6hz,12h),7.23(d,j＝8.7hz,6h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ167.59,147.26,144.03,134.14,130.46,129.65,128.69,126.73,124.80.hrms(esi)m/z:calcd for c
39h27
no6:604.176223,found 604.17622.
[0034][0035]
对比例1
[0036]
tpa-2ca的合成：
[0037]
称取4，4'-二溴三苯胺(1.00g，2.48mmol)，对甲氧羰基苯硼酸(1.33g，7.44mmol)，四三苯基膦钯(0.28g，0.25mmol)和碳酸钾(3.43g，24.81mmol)充分溶解于25ml的1，4-二氧六环的水溶液中，在氮气保护下，90℃回流10h。冷却至室温后，使用二氯甲烷萃取反应混合物得到粗产物。粗产物使用硅胶柱提纯，选取石油醚/二氯甲烷＝1:4(v/v)洗脱。得到化合物2，为浅黄色固体(0.31g，产率：31.00％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.02(d,j＝8.5hz,4h),7.82(d,j＝8.5hz,4h),7.73(d,j＝8.7hz,4h),7.42
–
7.36(m,2h),7.15(d,j＝8.5,6.1hz,7h),3.88(s,6h)。
[0038]
将化合物2(1.00g，2.07mmol)充分溶解于25ml的1，4-二氧六环的水溶液中，加入5.01ml饱和碳酸钾的水溶液，95℃回流24h。冷却至室温后，加入稀盐酸的水溶液酸化。旋干析出的固体，得到tpa-2ca，为黄色固体(0.84g，产率：84.00％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.88(s,2h),8.00(d,j＝8.5hz,4h),7.78(d,j＝8.5hz,4h),7.71(d,j＝8.7hz,4h),7.42
–
7.35(m,2h),7.18
–
7.11(m,7h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ167.61,147.59,147.00,144.09,133.54,130.44,130.29,129.55,128.53,126.63,125.54,124.08.hrms(esi)m/z:calcd for c
32h22
no4:484.455432,found 484.155523.
[0039][0040]
对比例2
[0041]
tpa-1ca的合成：
[0042]
称取4-溴三苯胺(1.00g，3.08mmol)，对甲氧羰基苯硼酸(1.11g，6.17mmol)，四三苯基膦钯(0.36g，0.31mmol)和碳酸钾(4.26g，30.82mmol)充分溶解于25ml的1，4-二氧六环的水溶液中，在氮气保护下，90℃回流10h。冷却至室温后，使用二氯甲烷萃取反应混合物得到粗产物。粗产物使用硅胶柱提纯，选取石油醚/二氯甲烷＝1:3(v/v)洗脱。得到化合物3，为浅黄色固体(0.23g，产率：23.00％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.01(d,j＝8.5hz,2h),7.79(d,j＝8.5hz,2h),7.68(d,j＝8.7hz,2h),7.35(dd,j＝8.4,7.3hz,4h),7.12
–
7.02(m,8h),3.87(s,3h).
[0043]
将化合物3(0.23g，0.61mmol)充分溶解于10ml的1，4-二氧六环的水溶液中，加入1ml饱和碳酸钾的水溶液，95℃回流12h。冷却至室温后，加入稀盐酸的水溶液酸化。旋干析出的固体，得到tpa-1ca，为黄色固体(0.17g，产率：75.13％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.90(s,1h),7.99(d,j＝8.4hz,2h),7.76(d,j＝8.3hz,2h),7.67(d,j＝8.7hz,2h),7.36(d,j＝7.9hz,4h),7.13
–
7.03(m,8h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ167.61,148.02,147.31,144.17,132.82,130.43,130.12,129.42,128.38,126.52,124.95,124.02,123.18.hrms(esi)m/z:calcd for c
25h19
no2:364.134302,found 364.13417.
[0044][0045]
对浮游细菌的抑制作用评价：
[0046]
化合物对浮游细菌的抑制作用通过进行最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)进行表征。选取4种细菌，分别是s.aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，mrsa)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis，s.epidermidis)和e.coli。
[0047]
稀释菌液至1
×
104cfu/ml，加入不同浓度的衍生物，37℃孵育24h。使用酶标仪测定细菌不再生长的最低化合物浓度，该浓度即为对应化合物的最小抑菌浓度。以典型的多肽类抗生素万古霉素(vancomycin，van)为对照组评价其体外抗菌活性。实验结果如下表1所示。
[0048]
表1tpa-3ca对s.aureus、mrsa、s.epidermidis和e.coli的mic(单位：μg/ml)
[0049][0050][0051]
选取浓度为0、mic、2mic、4mic和8mic的tpa-3ca分别与s.aureus孵育，孵育后将细菌涂板，24h后进行细菌菌落计数，相较于对照组可减少99.9％的细菌菌落的最小化合物浓度即为其最小杀菌浓度。实验结果参见附图1，tpa-3ca对s.aureus的mbc为0.156μg/ml。
[0052]
tpa-3ca与二氢叶酸还原酶(dhfr)之间的分子对接模拟：
[0053]
通过分子对接模拟预测tpa-3ca与二氢叶酸还原酶(dhfr，pdb:3drc)的结合模式，
使用autodock4.2.6实现ntc和dhfr之间的分子对接模拟，并利用pymol对分子间的相互作用进行可视化。参见附图2，tpa-3ca可与dhfr的两种氨基酸(arg57和glu90)可发生氢键相互作用，距离分别为和这为tpa-3ca良好的体外抗菌性能提供了一定的理论支持。
[0054]
tpa-3ca对细胞质膜通透性的影响：
[0055]
通过s.aureus摄取pi的实验以评价tpa-3ca对细胞质膜通透性的影响。s.aureus悬液用pbs洗涤并稀释至终浓度为1
×
107cfu/ml，分别加入1、2、4、6和8
×
mic的tpa-3ca溶液，对照组加入等量pbs，体系分别于37℃下孵育12h。孵育结束后，离心得到细菌沉淀。在避光条件下，使用pi染料(10μl，30μm)对各组细菌染色30min。再次洗涤以去除过量的pi染料，最后重旋于pbs溶液中，利用酶标仪监测各组的荧光强度(λ
ex
＝535nm，λ
em
＝617nm)。参见附图3，pi的荧光强度呈现出明显的剂量依赖性，随孵育浓度的增大，荧光强度随之增强。当tpa-3ca孵育浓度增至8
×
mic时，荧光强度可增至对照组的15.5倍。tpa-3ca可使生物膜量减少约21.68％，具有可观的抗生物膜活性效果。综上所述，tpa-3ca可有效增大细菌质膜通透性。
[0056]
tpa-3ca对胞内活性氧水平的影响：
[0057]
使用活性氧(ros)敏感型染料dcfh-da测定细菌胞内ros的水平。以pbs为对照组，利用荧光分光光度计检测经tpa-3ca(1、0.5、1、2、3和4
×
mic)孵育后细菌内dcfh-da的荧光信号。(λ
ex
＝488nm，λ
em
＝522nm)。参见附图4，tpa-3ca的浓度从0.5
×
mic增至4
×
mic时，dcfh-da的荧光信号随之逐步增强，经4
×
mic的tpa-3ca孵育后荧光信号可增强为对照组的2.6倍，说明tpa-3ca可有效诱导细菌发生氧化应激过程。
[0058]
tpa-3ca对细菌微观形貌的影响：
[0059]
将处于对数生长期的s.aureus离心、洗涤并稀释至1.0
×
109cfu/ml，将细菌悬液与0、1、2和4
×
mic的tpa-3ca恒温孵育12h。孵育结束后，以8000rpm离心3min，并用pbs多次洗涤菌液。在4℃下，用2.5％的戊二醛水溶液固定细菌12h，再次用pbs洗涤，接着利用乙醇的水溶液梯度脱水。随后，将10μl脱水的菌液转滴到硅片上，干燥并喷金，在扫描电子显微镜下观察细菌微观形貌。参见附图5，细菌膜损伤程度呈现出明显的剂量依赖性。经(4
×
mic)的tpa-3ca孵育后，细菌密度显著降低且大部分细菌的膜结构出现了凹陷和破损。tpa-3ca可通过破坏s.aureus的细胞膜结构以发挥抗菌活性。
[0060]
tpa-3ca的细胞毒性及溶血性：
[0061]
使用mtt分析法测定tpa-3ca的细胞毒性。如附图6所示，向hela细胞中加入不同浓度的tpa-3ca后，细胞仍表现出较高的存活率。表明tpa-3ca具有较低的细胞毒性。
[0062]
溶血是指红细胞膜破裂或出现小孔使得血红蛋白逸出。红细胞游离液随着溶血的同时透明度增加，呈深红色，且在540nm处有紫外吸收。故可以通过tpa-3ca与红细胞孵育后细胞的破裂情况来评估材料的生物相容性。如附图7所示，在浓度为20μg/ml浓度及以下时，tpa-3ca不会造成红细胞破裂，上清液澄清透明，且溶血率低至5％以下。表明tpa-3ca具有良好的生物相容性。
[0063]
tpa-3ca的抗生物膜活性：
[0064]
使用cv染色法评估tpa-3ca的抗生物膜活性。如附图8(a)所示，随着tpa-3ca给药浓度从的增大，微孔中cv染料颜色明显由深紫色变为淡紫色。接着利用酶标仪进行了定量，
结果如图8(b)所示，低浓度的tpa-3ca对生物膜几乎无明显抑制效果，但在8
×
mic的孵育浓度下，生物膜量可减少约21.68％。表明tpa-3ca具有一定的抗s.aureus生物膜活性。
[0065]
tpa-3ca的体内抗菌应用：
[0066]
利用s.aureus诱导细菌背部全层伤口感染模型，并利用tpa-3ca、tpa-2ca和pbs组分别给药治疗，给药浓度为0.156μg/ml，每天给药两次并记录伤口恢复情况和细菌定殖程度。如附图9(a)所示，tpa-3ca可有效加速伤口面积收缩进程，缓解伤口组织的脓性分泌物，有效缩短治疗周期。附图9(b)为利用imagej.2.0软件处理的伤口面积变化情况，可知经tpa-3ca为期14天的给药治疗可实现伤口100％的上皮化。附图10反映了各组小鼠伤口创面组织的细菌定殖情况，经tpa-3ca给药治疗后，伤口部位的细菌菌落数降低至对照组的9.06％，优于tpa-2ca给药治疗组(36.4％)。表明tpa-3ca具有良好的体内抗菌效果。
[0067]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物，其特征在于，所述的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的结构式如下：2.根据权利要求1所述的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的具体步骤为：步骤s1：按摩尔比10-25:90-110:1:140-180将三(4-溴苯基)胺、对甲氧羰基苯硼酸、四三苯基膦钯和碳酸钾溶解在1，4-二氧六环和水的混合溶剂中，在氮气或惰性气体保护下，85-95℃回流反应8-12h；冷却至室温后，使用二氯甲烷和/或乙酸乙酯萃取反应液得到粗产物，使用硅胶柱提纯粗产物；步骤s2：将步骤s1的产物溶解于1，4-二氧六环和水的混合溶剂中，然后加入饱和碳酸钾水溶液，90-98℃回流反应44-48h；冷却至室温后，加酸调ph值至2-3；旋干析出固体。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的1，4-二氧六环和水的混合溶剂中1，4-二氧六环和水的体积比为18-22:1。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中1，4-二氧六环和水的混合溶剂与饱和碳酸钾水溶液的体积比为4-6:1。5.根据权利要求1所述的基于4-羧基-4
’‑
(二苯氨基)联苯的苯甲酸衍生物在制备抗菌剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于4-羧基-4


技术研发人员：王卓 彭杨涵
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2023.05.07
技术公布日：2023/8/14