一株蜡样芽孢杆菌MG1及应用的制作方法

一株蜡样芽孢杆菌mg1及应用
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株蜡样芽孢杆菌mg1及应用。


背景技术：

2.随着社会发展和生活水平提高，由不可再生化石资源生产的聚乙烯(pe)等传统塑料已广泛应用于国民生产生活的各个方面，但塑料的大量使用导致了严重的“白色污染”问题。pha是微生物体内的一类3-羟基脂肪酸组成的线性聚酯，其在某些性能上可以媲美传统的热塑性塑料，它还具有一些独特的生物可降解性、生物相容性、光学异构性、提高微生物的抗逆性等性能，被认为是最具发展潜力的“绿色塑料”。在自然界中，许多微生物被证实可合成聚羟基脂肪酸酯(ployhydroxyalkanoates，pha)并储存在体内。虽然pha在生物降解和生物相容性上要比传统塑料具有优势，但是pha的生产成本高于传统塑料，限制了pha的工业化生产和应用。目前，pha的商业化生产价格高达每千克2.2-5.0欧元，而聚丙烯塑料的价格仅为每千克1.0欧元。为了降低pha生产成本，研究人员试图探索新的发酵模式(混合菌发酵、极端微生物发酵)以降低发酵原料和发酵过程的成本。同时，基因工程和代谢工程技术也用于提高细菌的phas合成能力和积累效率以降低生产成本。
3.目前报道的pha合成菌株多为革兰氏阴性菌，以葡萄糖、果糖等为底物，pha积累量可达细胞干重的50％-80％。然而，利用革兰氏阴性菌生产pha也存在着一定的缺陷。革兰氏阴性菌含有脂多糖(lipopolysaccharide,lps)，因而会干扰pha的纯化，增加提取工艺的复杂性和成本；其次，革兰氏阴性菌产生的lps可以诱导人体产生强烈的免疫反应，因而含有lps的pha不能应用于生物医药领域。与此相比，利用以芽孢杆菌为代表的革兰氏阳性菌生产pha具有原料来源广、抗逆性强、提取工艺简单等优势，但是还未见只利用糖渣为营养物质用于生产pha的相关报道，尤其是利用在生产柠檬酸时，由玉米淀粉糖化反应产生的废渣(即糖渣)作为营养物质，用于生产pha未见相关报道。
4.中国专利文献cn102119220a(申请号：200880130671.2)公开了使用柠檬残渣的pha(聚羟基链烷酸酯)的制备，该专利文献中公开的是使用柑橘加工残渣(命名为柠檬残渣)，通过对柠檬残渣进行研磨方法、用氧化钙处理和压榨而获得榨出液和/或柠檬糖蜜；并加入微量元素营养液，然后用于微生物培养生产pha。
5.现有技术中，在生产柠檬酸时，由玉米淀粉糖化反应产生的废渣(即糖渣)，有的用于售卖饲料，有的不做处理任意堆放，由于处理不当，会对环境造成一定的污染、产生资源浪费。因此，也急需将废渣转化为高附加值化合物的相关研究。
6.由于糖渣中含有的营养物质有限，其糖类总含量超过200g/kg，但蛋白质含量低，低于0.05g/kg，因此糖渣的碳氮比远高于微生物细胞自身的碳氮比，只利用糖渣作为营养成分培养微生物菌种，对微生物菌种的生长和代谢影响比较大，有的菌种可能无法正常生长，也影响代谢物质的产生。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供了一株蜡样芽孢杆菌mg1及应用。
8.本发明中所述的糖渣是指双酶法玉米淀粉糖化反应后产生的废渣。
9.本发明的技术方案如下：
10.一株蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1，于2022年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏号cctcc no：m2022620。
11.上述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1的培养方法，包括如下步骤：
12.(1)取蜡样芽孢杆菌mg1接种于固体培养基上，30-37℃活化培养12-14h，制得活化后的菌体；
13.(2)取制得活化后的菌体接种于液体培养基中，30-37℃、180-200rpm培养12-14h，制得种子液；
14.(3)取制得的种子液，按体积百分比1-3％接种于液体培养基中，30-37℃、180-200rpm培养12h-24h，得到蜡样芽孢杆菌mg1菌液。
15.根据本发明优选的，步骤(1)中，37℃活化培养12h。
16.根据本发明优选的，步骤(2)中，37℃、200rpm培养12h。
17.根据本发明优选的，步骤(3)中，37℃、200rpm培养24h。
18.根据本发明优选的，步骤(1)中的固体培养基为lb固体培养基；步骤(2)、步骤(3)中的液体培养基为lb液体培养基。
19.上述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1在生产pha中的应用。
20.根据本发明优选的，上述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1利用糖渣在生产pha中的应用。
21.进一步优选的，所述糖渣为双酶法玉米淀粉糖化反应后产生的废渣。
22.本发明的有益效果如下：
23.1.蜡样芽孢杆菌mg1具有易培养、生长迅速、对环境营养要求简单的特点。
24.2.蜡样芽孢杆菌mg1能够利用糖渣生产pha，原料便宜，在糖渣浓度40g/l时可以得到17.5mg/l的pha，在额外使用葡萄糖作为碳源可以得到25.5mg/l的pha，当额外使用甘油作为碳源时可以得到27.5mg/l的pha。
附图说明
25.图1为蜡样芽孢杆菌mg1革兰氏染色图。
26.图2为蜡样芽孢杆菌mg1系统进化树图。
27.图3为不同浓度碳源对pha产量的影响；
28.图中：a为不同浓度的葡萄糖对pha产量的影响；b为不同浓度甘油对pha产量的影响。
29.图4为蜡样芽孢杆菌mg1利用不同碳源发酵得到pha的核磁共振氢谱图；
30.图中：a为蜡样芽孢杆菌mg1利用葡萄糖发酵得到pha的核磁共振氢谱；b为蜡样芽孢杆菌mg1利用甘油发酵得到pha的核磁共振氢谱。
31.图5为蜡样芽孢杆菌mg1在不同盐浓度下pha生产情况图。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护的范围不限于此。
33.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规市售生化试剂。
34.主要材料来源
35.本发明中所用的糖渣来源于日照金禾博源生化有限公司；所用糖渣为生产柠檬酸时，由双酶法玉米淀粉糖化反应后产生的废渣。
36.实施例1
37.本发明提供的蜡样芽孢杆菌mg1筛选自活性污泥中，具体的菌种鉴定如下：
38.(1)革兰氏染色
39.将蜡样芽孢杆菌mg1进行革兰氏染色，结果如图1所示，蜡样芽孢杆菌大小约为1.0-1.4
×
3.0-5.0μm，革兰氏阳性菌，是一种兼性好氧菌，可在体内形成芽孢，菌体细胞呈杆状，两末端方较平整，成短或长链排列。
40.(2)菌种鉴定
41.以蜡样芽孢杆菌mg1提取的基因组作为模板，以27f，核苷酸序列如seq id no.2所示和1492r，核苷酸序列如seq id no3所示；作为引物，利用pcr获得16s rdna序列。pcr反应体系如下(50μl)见表1。
42.agagtttgatcctggctcag seq id no.2；
43.tacggctaccttgttacg actt seq id no.3。
44.表1.pcr反应体系
[0045][0046]
pcr程序参数设定如下所示：
[0047]
[0048]
pcr产物利用omega胶回收试剂盒回收后，连接t载体，送至青岛擎科生物技术有限公司进行测序，其16s rdna序列含有1540bp，核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0049]
将该序列在geenbank数据库进行blast(网址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比对，并构建其系统进化树，如图2所示，结果表明该菌属于bacillus cereus，命名为蜡样芽孢杆菌mg1。
[0050]
蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1，于2022年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏号cctcc no：m2022620。
[0051]
实施例2
[0052]
蜡样芽孢杆菌mg1利用不同浓度糖渣生产pha的能力情况，具体如下：
[0053]
取蜡样芽孢杆菌mg1划线于lb固体培养基上，37℃倒置培养12h，得到活化后的菌株；取制得活化后菌株接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h，制得种子液；取制得的种子液，按照体积分数1％的接种量接种于糖渣培养基中，糖渣浓度分别为20g/l、40g/l、50g/l、100g/l、150g/l，37℃、200rpm发酵24h。发酵结束后，静置5min后取上清，10000rpm离心10min，收集离心后的菌体，将菌体在-80℃冷冻12h以上。
[0054]
lb液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1l，ph自然。
[0055]
lb固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，定容至1l，ph自然。
[0056]
糖渣培养基：不同浓度的糖渣和蒸馏水，糖渣具体的主要成分见表2，ph为6.5。
[0057]
表2.糖渣具体的主要成分
[0058][0059]
冷冻干燥菌体，称重研磨，各取0.05g于酯化管中，加入2ml氯仿、850μl甲醇、150μl硫酸，油浴1h，冷却后加入1ml蒸馏水，静置分层后，用注射器吸取下层过滤收集。酯化后的样品用气相色谱仪测定pha的产量，结果如表3所示。
[0060]
表3.不同浓度的糖渣对蜡样芽孢杆菌mg1生产pha的影响
[0061][0062]
根据以上实验结果表明，蜡样芽孢杆菌mg1能够利用糖渣生产pha，通过测定不同浓度的糖渣对pha产量得影响发现当糖渣浓度为40g/l时，蜡样芽孢杆菌mg1生产pha的能力是最强的，这为后续提高pha产量奠定了基础。
[0063]
实施例3
[0064]
蜡样芽孢杆菌mg1在添加不同浓度碳源生产pha的能力情况
[0065]
挑取将蜡样芽孢杆菌mg1单菌落接种到lb液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，制得活化后菌液；取制得活化后的菌液，按照体积分数1％的接种量接种于40g/l的糖渣培养基中，并分别添加不同浓度的葡萄糖(10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l)，不同浓度的甘油(25.2g/l、50.4g/l、75.6g/l、100.8g/l、126g/l、151.2g/l)，37℃、200rpm摇床发酵培养，发酵时间为24h。比较这两种碳源对蜡样芽孢杆菌mg1生产pha的影响。发酵结束后，静置5min后取上清10000rpm离心10min，收集离心后的菌体，将菌体在-80℃冷冻12h以上。
[0066]
糖渣培养基：不同浓度的糖渣和蒸馏水混匀，每瓶分装100ml。
[0067]
葡萄糖培养基：糖渣培养基灭菌后，添加不同浓度的葡萄糖。
[0068]
甘油培养基：糖渣培养基灭菌后，添加不同浓度的葡萄糖。
[0069]
冷冻干燥菌体，称重研磨，各取0.05g于酯化管中，加入2ml氯仿、850μl甲醇、150μl硫酸，油浴1h，冷却后加入1ml蒸馏水，静置分层后，用注射器吸取下层过滤收集。酯化后的样品用气相色谱仪测定pha的产量，结果如图3所示。
[0070]
根据以上实验结果表明，当培养基中添加葡萄糖或甘油作为碳源能够显著提高pha的产量。分别设置了不同浓度梯度的葡萄糖和甘油，发现当葡萄糖浓度为30g/l时，蜡样芽孢杆菌mg1发酵得到的pha产量是最高的(27.2mg/l)；当培养基中添加25.2g/l甘油时，发酵液中的pha达到最高值(25.5mg/l)，当继续提高甘油浓度时，pha的产量变化不是特别明显。
[0071]
实施例4
[0072]
核磁共振氢谱测pha的结构
[0073]
本实验主要通过核磁共振氢谱(1h-nmr)来测定聚合物的结构，利用特定频率的电磁波，使得氢原子发生能级跃迁，即发生核共振，产生的磁频率信号经过转换放大在谱图上以峰的形式体现。首先通过有机溶剂提取pha，称取5mg的pha加入1ml的氘代氯仿溶解后，加入到核磁管中。1h-nmr谱图中在7.26ppm处有参考溶剂信号cdcl3，如图4，其中在0.89ppm，1.26-1.28ppm处的峰分别代表3hv及3hb的甲基(数字9和4)，在1.56ppm附近出现一个3hv的
亚甲基峰(数字8)，2.46-2.49ppm、2.59-2.62ppm处的非对映质子表现出的两个双峰信号分别对应3hv和3hb的亚甲基(数字2和6)，3hv和3hb的次甲基(-ch，数字3和7)在5.13-5.18ppm和5.23-5.28ppm处显示去屏蔽度最高的多重峰，这证明了实施例3中蜡样芽孢杆菌mg1利用葡萄糖或者甘油发酵所产生的共聚物是一样的结构，均为phbv。
[0074][0075]
实施例5
[0076]
蜡样芽孢杆菌mg1在无机盐培养基中生产pha的情况
[0077]
挑取蜡样芽孢杆菌mg1的单菌落接种到lb培养基中，37℃、200rpm过夜培养12h，制得种子液；将种子液按照体积比为3％接种到无机盐培养基中发酵培养，37℃、200rpm发酵时间为3天。最终可以得到19.56mg/l的pha。
[0078]
无机盐培养基成分：na2hpo
4 9g/l，kh2po
4 1.5g/l，nh4cl 1g/l，mgso
4 0.2g/l，cacl
2 0.02g/l，枸橼酸铁铵0.0012g/l，20g/l葡萄糖，添加微量元素溶液100μl。
[0079]
微量元素溶液成分：znso
4 1g/l，mncl
2 0.3g/l，h3bo
3 3g/l，cocl
2 2g/l，cucl
2 0.1g/l，nicl
2 0.2g/l，namoo
4 0.3g/l。
[0080]
实施例6
[0081]
蜡样芽孢杆菌mg1在不同盐浓度下生产pha的情况
[0082]
取0.1ml蜡样芽孢杆菌mg1接种到lb培养基中，37℃、200rpm培养12h，制得活化后的菌液；取制得的活化后菌液，按照体积百分比1％接种至不同的lb液体培养基中。盐度按质量百分数计分别为1％、3％、5％、7％，37℃、200rpm摇床培养24h。收集菌体测pha的含量，如图5所示。蜡样芽孢杆菌mg1在盐浓度为1％-5％之间时pha的产量随着盐浓度的增加而增加，当盐浓度为7％时，不再生长，说明mg1具有一定的耐盐特性。
[0083]
实施例7
[0084]
蜡样芽孢杆菌mg1在lb培养基中生产pha的情况
[0085]
取0.1ml蜡样芽孢杆菌mg1接种到lb培养基中，37℃、200rpm培养12h，制得活化后的菌液；取制得的活化后菌液，按照体积百分比1％接种至不同的lb液体培养基中，即lb液体培养基中加入了葡萄糖终浓度为40g/l，37℃、200rpm摇床培养24h。收集菌体测pha的含量，可以得到0.7g/l的pha。
[0086]
对比例1
[0087]
同时比对了枯草芽孢杆菌168在实施例2相同的条件下，利用不同浓度的糖渣生产pha，结果如表4所示。通过结果可得到，枯草芽孢杆菌168利用不同浓度的糖渣得到的pha产量明显低于蜡样芽孢杆菌mg1。
[0088]
表4.不同浓度的糖渣对枯草芽孢杆菌168生产pha的影响
[0089][0090]
由上述实验数据可以看出，本发明提供的蜡样芽孢杆菌mg1能够只以糖渣为营养物质生产pha，并且在糖渣浓度为40g/l时，pha产量最高，同时本发明提供的蜡样芽孢杆菌mg1具有一定的耐盐性，在盐浓度达到5％时，pha产量最高。本发明提供的蜡样芽孢杆菌mg1生产的共聚物为phbv；根据蜡样芽孢杆菌mg1的菌种特性，可以处理一些含盐量高的工业废弃物，比如糖渣等，用于生产高附加值化合物pha，避免工业废弃物因处理不当造成资源浪费和环境污染。

技术特征：
1.一株蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1，于2022年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏号cctcc no：m2022620。2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取蜡样芽孢杆菌mg1接种于固体培养基上，30-37℃活化培养12-14h，制得活化后的菌体；(2)取制得活化后的菌体接种于液体培养基中，30-37℃、180-200rpm培养12-14h，制得种子液；(3)取制得的种子液，按体积百分比1-3％接种于液体培养基中，30-37℃、180-200rpm培养12h-24h，得到蜡样芽孢杆菌mg1菌液。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，37℃活化培养12h。4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，37℃、200rpm培养12h。5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，37℃、200rpm培养24h。6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中的固体培养基为lb固体培养基；步骤(2)、步骤(3)中的液体培养基为lb液体培养基。7.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1在生产pha中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)mg1利用糖渣在生产pha中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述糖渣为双酶法玉米淀粉糖化反应后产生的废渣。

技术总结
本发明提供了一株蜡样芽孢杆菌MG1及应用，属于微生物应用技术领域，具体提供了一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)MG1，于2022年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏号CCTCC NO：M 2022620；本发明提供的蜡样芽孢杆菌MG1能够只以糖渣为营养物质生产PHA，具有一定的耐盐性，可以处理一些含盐量高的工业废弃物，比如糖渣等，用于生产高附加值化合物PHA，避免工业废弃物因处理不当造成资源浪费和环境污染。源浪费和环境污染。源浪费和环境污染。


技术研发人员：古鹏飞 马倩倩 徐晓美 高晓彤 周昊 潘月富 连明科
受保护的技术使用者：日照金禾博源生化有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/14