柚皮苷在制备癌细胞钾电流抑制剂中的应用

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及柚皮苷在制备癌细胞钾电流抑制剂中的新应用。


背景技术：

2.肝癌是全世界最常见和最致命的癌症之一。肝细胞癌(hcc)是原发性肝癌中最常见的病理类型，约占病例的75～85％。尽管近几十年来hcc的治疗取得了很大进展，但由于其高侵袭性和转移率，hcc的预后仍然很差。因此，hcc新的预后和治疗靶点值得进一步研究。细胞膜上的离子通道是促进特定离子穿过质膜的特化蛋白质，包括钠、钾、钙等通道，而有些离子通道被发现在肝癌细胞中调节失调。近年研究表明，细胞癌变、侵袭转移和耐药过程中常伴有细胞膜离子通道的结构和功能异常。细胞膜离子通道对肿瘤细胞的信号转导、基因表达等方面亦有十分重要的作用。因此，越来越多的癌症被认为是一种通道病，离子通道也成为治疗癌症的新靶标。
3.kv是与癌症相关的离子通道家族中最具代表性的。有文献报道在肝癌细胞中发现k
+
通道电流。k
+
通道可以影响细胞膜电位与ca
2+
的内流，从而参与调控肿瘤细胞的信号转导；同时肿瘤基因的突变可引起钾通道的表达异常，引起细胞增殖与凋亡的异常。肿瘤最相关的特征之一是细胞增殖的失调。k
+
通道对静息膜电位(vm)的控制起着重要作用，对细胞体积的调节起着重要作用。此外，它们还通过与na
+
/h
+
交换器和na
+
/k
+-atp酶协同作用，促进细胞内ph(phi)的调节。由于vm、细胞体积和phi在细胞周期进程中都有变化，所以k
+
通道在生理和病理增殖中起关键作用也就不足为奇了。不同的k
+
通道，都参与了对肿瘤细胞增殖的控制，虽然其潜在机制不同，但它们的抑制作用可以阻断不受控制的肿瘤细胞生长。近年来，关于k
+
通道与人肝癌的研究取得了显著进展。k
+
通道的异常是人肝癌的一个重要特征，在肝癌细胞中发现k
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通道的表达量显著增加，其活性可能会影响肿瘤细胞的增殖和迁移。
4.柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物，由于a环和b环之间完全没有共轭，所以在282nm有强烈的紫外吸收峰，使柚皮苷显示多种生物学活性和药理作用，如具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗突变、抗过敏、抗溃疡、镇痛、降血压活性，能降血胆固醇、减少血栓的形成，改善局部微循环和营养供给，可用于生产防治心脑血管疾病等。研究表明，柚皮苷能够调节肝脏代谢平衡、降低肝脏氧化损伤、也具有抗肝炎、抑制肝癌细胞增殖迁移、抗肝纤维化等作用。但是在电生理研究方面，钾离子通道与柚皮苷在人肝癌细胞系中药理作用机制的相关性尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种柚皮苷的新用途，具体表现在对癌细胞钾电流的调节作用。
6.本发明通过细胞膜片钳实验，证实了柚皮苷可浓度依赖性的抑制人肝癌细胞smmc-7721的钾离子电流(ik)，故柚皮苷可用于制备成癌细胞钾电流抑制剂。
7.本发明进一步提供了一种肝癌细胞钾电流抑制剂，该抑制剂以柚皮苷为活性成分。
8.采用上述抑制剂处理人肝癌细胞smmc-7721，随着用量增加，不仅能显著降低smmc-7721细胞的迁移能力，还能显著降低smmc-7721细胞活力并抑制其增殖能力。
9.故本发明还提供了上述肝癌细胞钾电流抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。
10.可以理解的是，给药方式为对个体进行有效量的所述药物的给药，所述药物中还可包括药学上可接受的辅料，且所述药物可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂或溶液剂等制剂形式。
11.相对于现有技术，本发明的有益效果：本发明首次发现柚皮苷对人肝癌细胞smmc-7721ik电流具有抑制作用，阐明柚皮苷可能通过抑制钾离子通道实现对肝癌细胞迁移能力和肝癌细胞增殖能力的抑制，进而发挥抗肿瘤作用。因此，本发明不仅为柚皮苷治疗肝癌细胞提供药物靶点，而且为柚皮苷用于治疗肝癌以及新型药物的开发提供依据和理论基础。
附图说明
12.图1为实施例1中柚皮苷和钾通道抑制剂氯化钡对人肝癌细胞smmc-7721电流-电压曲线的影响对比图，其中a为不同浓度柚皮苷作用于ik的iv曲线，b为不同浓度氯化钡作用于柚皮苷所记录的iv电流，c为不同浓度柚皮苷与人肝癌细胞smmc-7721钾通道电流抑制率的曲线图。
具体实施方式
13.为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
14.下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
15.实施例1
16.本例通过对人肝癌细胞smmc-7721的全细胞膜片钳实验，研究了柚皮苷和钾通道抑制剂氯化钡(bacl2)对人肝癌细胞钾电流-电压(iv)曲线的影响，具体过程如下：
17.(1)材料和仪器。
18.材料：人肝癌细胞株smmc-7721来自武汉华尔纳公司，rpmi 1640细胞培养基和cck-8购自美仑生物技术有限公司，柚皮苷购自sigma公司，血清购自excell bio公司，dmso购自bd公司。
19.主要仪器：epc10膜片钳放大器(德国heka electronic公司)，三维微操纵仪(美国sutter公司)，光倒置显微镜(日本nikon公司)，两步玻璃微电极拉制仪(日本narishige公司)。
20.(2)细胞培养。
21.smmc-7721细胞接入含10％胎牛血清和1％青霉素、链霉素的rpmi 1640培养基中，在含5％co2、37℃的培养箱中培养，每隔48h换一次液，实验采用对数生长期的细胞。
22.(3)溶液制备。
23.①
ik灌流液(mmol/l)：nacl为140、kcl为4、cacl2为2、mgcl2为1、hepes为10、葡萄糖为11，naoh调ph至7.4。
24.②
ik电极内液(mmol/l)：kcl为130、nacl为15、cacl2为0.37、mgcl2为1、egta为10、mg-atp为1，koh调ph至7.2；
25.③
柚皮苷用dmso配制母液浓度20mmol/l,分别稀释至5、10、20、40μmol/l。
26.④
配制bacl2母液浓度10mmol/l，分别稀释至200、400和600μmol/l。
27.(4)全细胞膜片钳实验
28.实验前取对数生长期的smmc-7721细胞悬液滴入细胞池中并置于荧光倒置显微镜的工作台上，待细胞沉降贴壁后用配置好的灌流液灌流，置换掉其中的培养基，而后进行全细胞膜片钳实验，所有实验均在室温(20-22℃)下进行。玻璃电极拉制后，充灌电极内液，电极电阻为3-5mω，细胞钳制于-40mv，先给予持续时间300ms、范围-80mv-+80mv的去极化刺激电压，步幅为10mv，间隔时间为3s，然后给予持续100ms的-40mv的刺激，刺激频率为1hz，电信号经ag/agcl电极引导，由膜片钳放大器放大和滤波后储存在计算机硬盘中。
29.分别使用浓度为5、10、20、40μmol/l的柚皮苷作用于钾离子电流(ik)的iv曲线结果显示：随着柚皮苷浓度的升高，对ik的抑制作用逐渐增强，表明柚皮苷可浓度依赖性的抑制ik(图1中a、c)。使用200、400、600μmol/l的钾通道抑制剂bacl2作用于所记录的iv电流，证明为ik(图1中b)；通过hill方程拟合浓度效应曲线计算得出，ik的ic
50
值为7.44μmol/l。
30.表1柚皮苷和氯化钡对smmc-7721细胞ik的抑制率
[0031][0032][0033]
实施例2
[0034]
本例通过划痕实验检测了柚皮苷和钾通道抑制剂氯化钡对肝癌细胞smmc-7721迁移作用的影响。
[0035]
取对数生长期的smmc-7721细胞接种到6孔板中，每孔2ml，观察细胞呈单层融合状态时即可进行划痕。在皿底部划一条直线，在皿中用200μl枪头划3条平行的划痕，选择合适的位置拍照并进行标记。每孔加入不同浓度的柚皮苷(5、10、20、40μmol/l)和钾通道抑制剂bacl2(200、400、600μmol/l)处理48h后，对相同位置进行拍照观察划痕愈合程度。
[0036]
柚皮苷和氯化钡对smmc-7721细胞迁移作用的影响如表2所示：相比于bacl2，柚皮苷能抑制smmc-7721细胞的迁移，且随着浓度的增加，细胞迁移能力逐渐降低；同时经钾通道抑制剂200、400、600μmol/l的氯化钡处理后，smmc-7721细胞的迁移率也明显受到抑制，证明柚皮苷对smmc-7721细胞的抑制作用有可能是通过对钾通道蛋白的抑制来实现的。
[0037]
表2柚皮苷和氯化钡对smmc-7721细胞迁移作用的影响
[0038][0039]
实施例3
[0040]
本例以钾通道抑制剂氯化钡为对照，通过cck-8法检测了柚皮苷对smmc-7721细胞活力的影响。
[0041]
将smmc-7721细胞接种在96孔板中(5
×
103/孔)，在37℃、含5％co2的培养箱中孵育过夜，并加入不同浓度的柚皮苷或钾通道抑制剂bacl2处理24、48h。同批细胞经含0.1％dmso(经预实验证实其对细胞生长无明显影响)的培养液处理后作为对照组。随后，向每个孔中加入10μl cck-8溶液继续培养3h，使用酶标仪在450nm处测量光密度值(od)，并设定对照组细胞存活率为100％，按照以下公式计算抑制率。
[0042]
抑制率＝[1-(od实验组-od空白组)/(od对照组-od空白组)]
×
100％。
[0043]
结果如表3所示：不同浓度的柚皮苷能以浓度依赖的方式抑制smmc-7721细胞的增殖能力，通过用不同浓度的钾通道抑制剂的氯化钡作用于smmc-7721细胞，经过48h的处理后，细胞活力也有明显下降，说明柚皮苷有可能是通过抑制钾通道导致细胞活力下降的。
[0044]
表3柚皮苷和氯化钡对smmc-7721细胞活力的影响
[0045][0046]
综上所述，本发明验证了柚皮苷对人肝癌细胞smmc-7721ik具有抑制作用，并进一步阐明柚皮苷可能通过抑制钾通道实现对癌细胞迁移能力和癌细胞增殖能力的抑制，进而发挥抗肿瘤作用，为柚皮苷在肝癌中离子通道方面的治疗提供新的思路及理论基础。
[0047]
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.柚皮苷在制备癌细胞钾电流抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为人肝癌细胞。3.一种癌细胞钾电流抑制剂，其特征在于，所述抑制剂以柚皮苷为活性成分。4.根据权利要求3所述的癌细胞钾电流抑制剂，其特征在于，所述抑制剂能降低癌细胞的迁移能力。5.根据权利要求3所述的癌细胞钾电流抑制剂，其特征在于，所述抑制剂能降低癌细胞活力。6.根据权利要求3所述的癌细胞钾电流抑制剂，其特征在于，所述抑制剂中还包括药学上可接受的辅料。7.根据权利要求3所述的癌细胞钾电流抑制剂，其特征在于，所述癌细胞为肝癌细胞。8.如权利要求3～7任一权利要求所述的癌细胞钾电流抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，对个体进行有效量的所述药物的给药。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂或溶液剂。

技术总结
本发明公开了柚皮苷在制备癌细胞钾电流抑制剂中的应用，本发明通过试验首次揭示了柚皮苷对人肝癌细胞SMMC-7721K


技术研发人员：马季骅 刘汗峰
受保护的技术使用者：武汉科技大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/14