一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法及最佳工艺

1.本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种基于hplc-dad及响应面法优化红车轴草异黄酮提取工艺的方法。
技术背景
2.红车轴草(trifoliumpretensel.)为豆科(legum inosae)车轴草属(trifoliuml.)植物，又名红三叶或红花苜蓿，广泛分布于我国贵州、云南、安徽和浙江等地，是一种优秀的饲用牧草，同时也是一种广泛使用的中药材。红车轴草中含有丰富的异黄酮、黄酮、皂苷及挥发油类物质，其中红车轴草异黄酮(trifoliumpratenseisoflavones)是红车轴草属植物中异黄酮类化合物的总称，主要包括染料木素、大豆苷元和鹰嘴豆芽素a等，可从根、茎、花和种子中分离得到，是红车轴草发挥生物活性的主要物质之一。现有研究表明红车轴草异黄酮具有广泛的药理活性，不仅具有抗炎和抗氧化作用，还对癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松及神经退行性疾病等具有治疗作用。目前，基于高效液相色谱-二极管阵列检测法(high-performance liquidchromatography-diode arraydetection，hplc-dad)及响应面法优化红车轴草异黄酮提取工艺未见文献报道，为充分开发和利用红车轴草异黄酮，发明人提供一种基于hplc-dad及响应面法优化红车轴草异黄酮提取工艺。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种提取效率高、提取工艺简单且条件准确可靠的响应面法优化红车轴异黄酮的提取工艺，为红车轴的进一步研究提供理论和试验数据参考。该方法以红车轴为材料，以提高红车轴中异黄酮的得率为目的，采用超声辅助提取，结合高效液相色谱法测定红车轴草中大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a的含量，使用外标法定量，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化提取工艺。
4.本发明的技术方案：
5.一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法，基于hplc-dad及响应面法，步骤包括制备对照品溶液、制备样品溶液、制作标准曲线、hplc测总异黄酮、单因素试验、响应面试验，具体如下：
6.(1)制备对照品溶液:分别称取大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a对照品各20mg，甲醇溶解后定容至10ml，配置成2000μg/ml的标准储备液；
7.(2)制备样品溶液：取红车轴草干草粉碎后相应目数筛网过筛，准确称取5g粉末于烧瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液混合均匀，设置不同的水浴时间、水浴温度和超声提取时间及超声功率；抽滤后，使用旋转蒸发仪将滤液完全蒸干，用5ml甲醇溶解，提取物稀释10倍后过0.22mm微孔滤膜，即得红车轴异黄酮提取液；其中乙醇浓度为55％～95％、料液比为1:5～1:30、水浴温度为60℃、水浴时间为2h、超声时间为30min、超声功率为600w和药材粒径为10～100目；
8.(3)制作标准曲线：用2000μg/ml的标准储备液梯度稀释为0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/
ml、10μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的混合标准工作液，每个浓度设置3个重复，取平均值绘制标准曲线；
9.(4)采用高效液相色谱法测定红车轴草中大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a的含量，使用外标法定量，其hplc检测条件：安捷伦extend-c18柱(4.6
×
250mm，5m)；流速：1ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10l；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)和乙腈(b)；梯度洗脱程序：0～10min，30％～50％a；10～15min，50％～60％a；15～19min，60％～50％a；19～20min，50％～30％a；
10.样品溶液测定：样品溶液根据标准曲线计算含量后，经下式计算得到红车轴草异黄酮总提率：
11.在该公式中，x代表红车轴草异黄酮总提取率(μg/g)，m为经hplc测定后经外标法定量算得的大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a含量的总和(μg)，m为提取用药材干燥粉末的重量(g)；
12.(5)单因素试验：采用控制变量法，根据预实验结果控制初始条件为水浴温度60℃，水浴时间2小时，
13.超声时间30分钟和超声功率600w；选择乙醇浓度：55％、65％、75％、85％、95％；料液比：1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30；药材粒径为10目、20目、30目、40目、60目、80目、100目；三个因素对步骤(2)进行单因素试验，确定各因素最优水平，以单因素试验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，根据bx-benhnken设计原则进行三因素三水平响应面实验设计，以乙醇浓度、料液比、药材粒径为自变量，以异黄酮提取率为响应值，建立异黄酮提取率的多元二次方程；
14.(6)响应面试验：对步骤(5)，以乙醇浓度a、料液比b、药材粒径c三个因素为自变量，以异黄酮提取率y为响应值，建立的多元二次方程进行响应面分析：y＝2572.635-22.574a+100.306b-53.087c-10.357ab-58.874ac+46.681bc-125.490a
2-31.948b
2-13.927c2。
15.进一步地，步骤(6)取异黄酮含量最大值得出最优的提取条件为：乙醇浓度86.06％、料液比1:29.065(g/ml)、药材粒径0.478mm。
16.进一步地，考虑实际试验操作，在所述步骤(6)中，红车轴异黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度为86％、料液比为1:29(g/ml)、药材粒径40目(0.425mm)。
17.一种优化的红车轴草异黄酮提取工艺，其特征在于：基于权利要求3所述的一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法得到的最佳工艺参数，取红车轴草干草粉碎后40目筛网过筛，称取粉末于烧瓶中，加入86％的乙醇溶液混合均匀，料液比为1:29g/ml，设置水浴温度为60℃、水浴时间为2h、超声时间为30min、超声功率为600w；抽滤后，使用旋转蒸发仪将滤液完全蒸干，得红车轴草异黄酮提取物。
18.本发明以红车轴为材料，以提高红车轴中异黄酮的得率为目的，采用超声辅助提取，结合高效液相色谱法测定红车轴草中大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a的含量，使用外标法定量，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化提取工艺，为红车轴的进一步研究提供理论和试验数据参考。
附图说明
19.图1大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a混合对照品hplc色谱图。
20.(其中：1.大豆苷元；2.染料木素；3.鹰嘴豆芽素a)
21.图2是乙醇浓度对异黄酮提取率的影响曲线图。
22.图3是料液比对异黄酮提取率的影响曲线图。
23.图4是药材粒径对异黄酮提取率的影响曲线图。
24.图5是乙醇浓度和料液比交互作用响应面图。
25.图6是乙醇浓度和药材粒径交互作用响应面图。
26.图7是料液比和药材粒径交互作用响应面图。
具体实施方式
27.为了更充分得解释本发明的实施，以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述。
28.一种基于hplc-dad及响应面法优化红车轴草异黄酮提取工艺，包括以下步骤：
29.(1)制备对照品溶液:分别称取大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a对照品各20mg，甲醇溶解后定容至10ml，配置成2000μg/ml的标准储备液。
30.(2)制备样品溶液：取红车轴草干草粉碎后相应目数筛网过筛，准确称取5g粉末于烧瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液混合均匀，设置不同的水浴时间、水浴温度和超声提取时间。抽滤后，使用旋转蒸发仪将滤液完全蒸干，用5ml甲醇溶解，提取物稀释10倍后过0.22mm微孔滤膜，即得红车轴异黄酮提取液。
31.(3)制作标准曲线：用2000μg/ml的标准储备液梯度稀释为0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的混合标准工作液，每个浓度设置3个重复，取平均值绘制标准曲线。以目标物峰面积为纵坐标，标准品储备液浓度为横坐标。最终得到回归方程见表1，混合对照品hplc色谱图见图1。式中：x为异黄酮各成分质量浓度(μg/ml)；y为异黄酮各成分峰面积。r2均大于0.99，表明该方法在试验浓度范围内线性良好。根据回归方程，求算异黄酮各成分含量。
32.表1各成分线性结果
[0033][0034]
(4)hplc检测条件：安捷伦extend-c
18
柱(4.6
×
250mm，5μm)；流速：1ml/min；检测波长254nm；柱温：30℃；进样量：10μl；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)和乙腈(b)。梯度洗脱程序：0～10min，30％～50％a；10～15min，50％～60％a；15～19min，60％～50％a；19～20min，50％～30％a。
[0035]
(5)样品溶液测定：样品溶液根据标准曲线计算含量后，经下式计算得到红车轴草异黄酮总提取率：
[0036]
在该公式中，x代表红车轴草异黄酮总提取率(μg/g)，m为经hplc测定后经外标法定量算得的大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a含量的总和(μg)，m为提取用药材干燥粉末的重量(g)。
[0037]
乙醇浓度对红车轴草异黄酮总提取率的影响：分别准确称取粉碎过20目筛后的红车轴草样品5g各5份于锥形瓶中，料液比为1：20g/ml，在水浴温度为60℃中提取2h，在超声功率为600w的条件下超声提取30分钟；考察不同乙醇浓度(55％、65％、75％、85％和95％)对红车轴草异黄酮总提取率的影响，按步骤(2)的方法制备提取液，按步骤(5)的方法测异黄酮含量。结果表明，乙醇浓度为85％时，红车轴草异黄酮总提取率最高，如图2所示。
[0038]
料液比对红车轴草异黄酮总提取率的影响：分别准确称取粉碎过20目筛后的红车轴草样品5g各5份于锥形瓶中，以85％的乙醇作为溶剂，在水浴温度为60℃中提取2h，在超声功率为600w的条件下超声提取30分钟；考察不同料液比(1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30g/ml)对红车轴草异黄酮总提取率的影响，按步骤(2)的方法制备提取液，按步骤(5)的方法测异黄酮含量。结果表明，料液比为1：25时，红车轴草异黄酮总提取率最高，如图3所示。
[0039]
药材粒径对红车轴草异黄酮总提取率的影响：分别准确称取粉碎过目筛后的红车轴草样品5g各5份于锥形瓶中，以85％的乙醇作为溶剂，料液比为1：25g/ml，在水浴温度为60℃中提取2h，在超声功率为600w的条件下超声提取30分钟；考察不同药材粒径(10目、20目、30目、40目、60目、80目、100目)对红车轴草异黄酮总提取率的影响，按步骤(2)的方法制备提取液，按步骤(5)的方法测异黄酮含量。结果表明，在40目处出现最大值，40目至100目条件下提取率无显著变化(p》0.05)。综合考虑响应面设计中需要的梯度变化，故选取30目、40目以及100目作为后续试验条件，如图4所示。
[0040]
响应面优化实验：
[0041]
因素水平选取及响应面设计：
[0042]
通过单因素实验结果，确定进行优化的因素和水平，即选择乙醇浓度(a)、料液比(b)、药材粒径(c)三个因素对红车轴异黄酮提取率影响进行优化，运用design-expert 11.0软件设计3因素3水平响应面试验，根据box-behnken中心组合设计原理，确定响应面实验方案，并建立回归方程预测模型确定最佳提取工艺参数。其因素水平设计见表2，设计组合及异黄酮提取结果见表3。
[0043]
表2设计实验因素水平
[0044][0045]
表3试验设计与结果
[0046][0047]
回归模型的建立与分析
[0048]
采用design-expert 11.0软件对实验结果进行多项式拟合回归，得到回归方程：y＝2572.635-22.574a+100.306b-53.087c-10.357ab-58.874ac+46.681bc-125.490a
2-31.948b
2-13.927c2。方差分析结果见表4。
[0049]
表4模型方差分析
[0050]
[0051][0052]
注：*代表差异显著，p《0.05；**代表差异极显著p《0.01。
[0053]
由表3可知，回归模型的p值为0.0190，p《0.05，表明拟合模型非常显著，模型相关r2＝0.9318，校正决定系数r2adj＝0.8091，二者相差不大且都接近1.0，说明模型实际值与预测值拟合良好，能很好的反映各因素与响应值之间的关系。模型中的线性项系数b、c的p值《0.05说明料液比和药材粒径对黄酮提取率有显著影响，二次项a2(p《0.01)对提取率也有极显著的影响，而a的偏回归系数不显著(p》0.05)说明乙醇浓度对红车轴异黄酮提取率没有显著的影响。根据f值，三个因素对红车轴异黄酮提取率的影响顺序为b》c》a，即提料液比》药材粒径》乙醇浓度。
[0054]
根据回归方程可绘制出相应的响应曲面图，分析当乙醇浓度、料液比、药材粒径三个因素中有一个因素固定时，另外两个因素的交互作用对异黄酮提取率的影响，响应面图见图5～7。3d曲面图平缓和陡峭的趋势可以直观、完整地反映出各因素对红车轴异黄酮提取率的影响。表面越陡，此因素对结果的影响越大，表面越光滑，则该因素对结果的影响越小。由图5可知，，料液比和乙醇浓度曲线的陡峭程度最大，因此对红车轴草异黄酮总提取率的影响最为显著，其次为料液比与药材粒径的交互作用(图7)。由图6可知，乙醇浓度与粒径之间的曲面图平缓，因此对红车轴草异黄酮总提取率的影响不显著，这与方差分析结果一致。
[0055]
通过design-expert 11.0软件求解方程得到，红车轴异黄酮的最优提取工艺为：乙醇浓度为86.06％，料液比为1:29.065(g/ml)，药材粒径为0.478mm；在此条件下三种主成分的提取总量的预测值为2630.862μg，考虑试验实际操作，将乙醇浓度调整为86％，料液比为1:29(g/ml)，药材粒径40目(0.425mm)。再根据改进的最佳工艺进行试验验证，做3组重复试验，实测值红车轴异黄酮平均值为2641.469μg，与理论值非常接近。因此，design-expert 11.0软件进行响应面优红车轴异黄酮提取工艺条件是可靠的。
[0056]
以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法，其特征在于：基于hplc-dad及响应面法，步骤包括制备对照品溶液、制备样品溶液、制作标准曲线、 hplc测总异黄酮、单因素试验、响应面试验，具体如下：（1） 制备对照品溶液:分别称取大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a对照品各20 mg，甲醇溶解后定容至10 ml，配置成2000 μg/ml的标准储备液；（2） 制备样品溶液：取红车轴草干草粉碎后相应目数筛网过筛，准确称取5 g粉末于烧瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液混合均匀，设置不同的水浴时间、水浴温度和超声提取时间及超声功率；抽滤后，使用旋转蒸发仪将滤液完全蒸干，用5 ml甲醇溶解，提取物稀释10倍后过0.22 mm微孔滤膜，即得红车轴异黄酮提取液；其中乙醇浓度为55%~95%、料液比为1:5~1:30、水浴温度为60℃、水浴时间为2h、超声时间为30min、超声功率为600w和药材粒径为10~100目；（3） 制作标准曲线：用2000 μg/ml的标准储备液梯度稀释为0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、30 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml的混合标准工作液，每个浓度设置3个重复，取平均值绘制标准曲线；（4）采用高效液相色谱法测定红车轴草中大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a的含量，使用外标法定量，其 hplc检测条件：安捷伦extend-c18柱：4.6
×
250 mm，5 m；流速：1 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：10 l；流动相a为0.1%甲酸水溶液，流动相b为乙腈；梯度洗脱程序： 0~10 min，30%~50%a；10~15 min，50%~60%a；15~19 min，60%~50%a；19~20 min，50%~30%a；样品溶液测定：样品溶液根据标准曲线计算含量后，经下式计算得到红车轴草异黄酮总提率： ；其中，x代表红车轴草异黄酮总提取率，单位μg/g；m为经hplc测定后经外标法定量算得的大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素a含量的总和，单位μg；m为提取用药材干燥粉末的重量，单位g；（5） 单因素试验：采用控制变量法，根据预实验结果控制初始条件为水浴温度60℃，水浴时间2小时，超声时间30分钟和超声功率600w；选择乙醇浓度：55%、65%、75%、85%、95%；料液比：1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30；药材粒径为10目、20目、30目、40目、60目、80目、100目；三个因素对步骤（2）进行单因素试验，确定各因素最优水平，以单因素试验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，根据bx-benhnken设计原则进行三因素三水平响应面实验设计，以乙醇浓度、料液比、药材粒径为自变量，以异黄酮提取率为响应值，建立异黄酮提取率的多元二次方程；（6）响应面试验：对步骤（5），以乙醇浓度a、料液比b、药材粒径c三个因素为自变量，以异黄酮提取率y为响应值，建立的多元二次方程进行响应面分析，取异黄酮含量最大值得出最优的提取条件；y=2572.635-22.574a+100.306b-53.087c-10.357ab-58.874ac+46.681bc-125.490a
2-31.948b
2-13.927c
2 。2.根据权利要求1所述的一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法，其特征在于：
在步骤（3）中建立多元二次方程时，根据试验数据进行多元回归拟合，根据试验结果建立的数学模型，建立数学模型后对红车轴中黄酮提取的数学模型进行显著性检验。3.根据权利要求1所述的一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法得到的最优工艺参数，其特征在于：乙醇浓度86.06%、料液比1:29.065g/ml、药材粒径0.478 mm。4.一种优化的红车轴草异黄酮提取工艺，其特征在于：基于权利要求3所述的一种优化红车轴草异黄酮提取工艺参数的方法得到的最优工艺参数，考虑实际试验操作，选最佳工艺：取红车轴草干草粉碎后40目筛网过筛，称取粉末于烧瓶中，加入86%的乙醇溶液混合均匀，料液比为1:29g/ml，设置水浴温度为60℃、水浴时间为2h、超声时间为30min、超声功率为600w；抽滤后，使用旋转蒸发仪将滤液完全蒸干，得红车轴草异黄酮提取物。

技术总结
本发明公开了一种基于HPLC-DAD及响应面法优化红车轴草异黄酮提取工艺，采用超声辅助醇提法提取红车轴草异黄酮，结合HPLC-DAD对其主成分大豆苷元、染料木素和鹰嘴豆芽素A进行定量以获得最佳提取工艺。基于单因素试验结果，采用响应面设计试验对提取工艺进行优化，选取乙醇浓度、料液比和粒径三个因素作为响应变量，以红车轴草异黄酮提取率作为响应值，对各因素进行多项式拟合回归，得到回归方程，对回归方程进行计算，得到红车轴草异黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度86%、料液比1:25（g/mL）和药材粒径40目，在此最佳条件下红车轴草三种主成分总提取量为2641.469μg。本发明提取工艺简单，提取成本较低，提取效率较高，易于推广应用，为开发红车轴草有效成分提供理论参考。考。考。


技术研发人员：杨剑 罗争琴 吕世明 徐一丹 宋旭琴 欧德渊
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/14