蛋白质的β-1,4半乳糖基化

蛋白质的
β-1，4半乳糖基化
1.本发明涉及一种细胞，其中该细胞被修饰以增强该细胞产生的多肽产物的β-1，4半乳糖基化，一种修饰细胞的方法，以及产生多肽产物的方法。
2.β-1，4半乳糖基化(β-1，4galactosylation)是治疗性蛋白质变异性的主要来源，甚至是由制造过程中细微的工艺偏差引起的。在制造治疗性蛋白质的大规模细胞培养过程中，营养可用性、代谢物积累、温度、ph和其他生物工艺条件会发生变化。众所周知，生物工艺条件的变化会严重影响糖基化，尤其是β-1，4半乳糖基化。减少产品异质性是确保治疗性蛋白质的安全性和疗效的关键，因此也是生物制药生产操作的基本目标。
3.β-1，4半乳糖基化对治疗性蛋白质功效的积极影响最近才被报道。因此，迄今为止开发的技术旨在调节β-1，4半乳糖基化，以减少产品异质性或通过增加唾液酸化来增强生物制药的抗炎活性和血清半衰期。已经开发了三大类技术来影响重组糖蛋白的β-1，4半乳糖基化：
4.1.尿苷/锰/半乳糖(umg)补料。
5.治疗性糖蛋白β-1，4半乳糖基化的代谢调节已通过喂食udp-gal(半乳糖基化所需的共底物)的生物合成前体实现。在该策略中，向细胞培养物中加入尿苷和半乳糖可增强udp-gal的细胞内可用性，同时添加锰可增强β4galtl的活性(mn2+是该酶的催化辅助因子)。umg补料在整个细胞培养过程中进行，以在重组蛋白上实现目标β-1，4半乳糖基化谱。一项关于umg补料的研究实现了一种细胞系的mahβ-1，4半乳糖基化增加5.3％至39％(6.8％双半乳糖基化聚糖)，另一种细胞系增加9％至48％(9.7％双半乳糖基化聚糖)[1]。第二项研究实现了一种细胞系增加56％至79％(24％双半乳糖基化聚糖)，另一种细胞系增加36％至67％(19％双半乳糖基化聚糖)[2]。
[0006]
然而，用于调节β-1，4半乳糖基化的umg补料策略存在三个基本缺点：(1)umg补料只能实现β-1，4半乳糖基化的适度变化，特别是双-半乳糖基聚糖的收益；(2)据报道，umg补料会对cho细胞培养物的生长和治疗性蛋白质生产率产生负面影响。据报道，参与umg补料的所有三种成分(尿苷、锰和半乳糖)都会降低cho细胞的生长速度，从而降低治疗性蛋白质的产量；(3)需要广泛的实验来确定最佳的umg补料策略，以达到对β-1，4半乳糖基化的预期效果，同时最大限度地减少对治疗性蛋白质产量的负面影响。尽管umg补料有局限性，但它仍用于工业，因为可以部署该策略来调节已批准的生物过程/治疗产品的β-1，4半乳糖基化。
[0007]
2.异位β4galt表达
[0008]
一些研究已经在产生治疗性蛋白质的cho细胞系中异位表达人类β4galt1，主要目的是增加产物唾液酸化。通过异位β4galt表达实现的产物β-1，4半乳糖基化的范围为73％-98％，双半乳糖基化的范围为49％-87％，这大于通过umg补料策略实现的范围。schulz等人的工作[25]，特别是在整体产物β-1，4半乳糖基化和双半乳糖基化方面实现了最高收益。值得注意的是，schulz等人的研究涉及复杂的基因工程策略，其中人类β4galtl被敲入cho基因组中的“安全港(safe-harbour)”位点。异位β4galt表达已与umg补料相结合，以实现进一步的mabβ-1，4半乳糖基化[3]。该研究发现，人类β4galt1在hek细胞中的瞬时过表达导致
mah fc聚糖的70％β-1，4半乳糖基化和0.08g/l的产物滴度。然后，作者在细胞培养物中补充d-半乳糖以实现82％β-1，4半乳糖基化，但观察到产物滴度降低至0.05g/l[3]。
[0009]
3.体外酶促β-1，4半乳糖基化
[0010]
治疗性蛋白质β-1，4半乳糖基化也已通过用牛β4galt1对糖蛋白进行体外处理进行了修饰。tayi和butler[4]实现了mab fcβ-1，4半乳糖基化从82％增加到96％(包括96％双半乳糖基化)和mab2从39％增加到98％(92％双半乳糖基化)。尽管在单-β-1，4半乳糖基化和双-β-1，4半乳糖基化方面表现出最好的增加，但体外酶促聚糖重塑存在两个关键限制：(1)体外酶促β-1，4半乳糖基化在大规模情况下极其昂贵。它需要额外的生物处理步骤并增加下游纯化的负担以去除添加的β4galt(及其污染物)，从而增加生物工艺资本支出。此外，体外酶促处理步骤需要24小时至48小时才能实现高转化率。这些额外的步骤增加了总处理时间，从而提高了生物处理成本。消耗品成本，尤其是β4galt1酶的消耗品成本在大规模生产时似乎令人望而却步。(2)体外酶促β-1，4半乳糖基化需要复杂的消耗品：β4galt酶。牛β4galt已用于执行体外β-1，4半乳糖基化。然而，在过去20年中，动物源成分的使用已逐步退出生物制药业务，以减少可变性和解决供应链限制。β4galt1必须来自动物产品或通过哺乳动物细胞中的重组表达，因为酶本身是糖基化的。这导致必须在哺乳动物细胞中生产糖蛋白消耗品以生产治疗性糖蛋白的情况。
[0011]
所需要的是一种改进的治疗性蛋白质β-1，4半乳糖基化方法，可以克服上述现有技术的部分或全部局限性。
[0012]
根据本发明的第一方面，提供了一种细胞，其中该细胞被修饰以例如增强由该细胞产生的多肽产物的β-1，4半乳糖基化，该修饰包括：
[0013]
通过减少细胞中功能性cosmc分子伴侣和/或通过减少细胞中功能性t-合酶，减少o-galnac半乳糖基化在细胞中的活性；以及细胞中β-1，4-半乳糖基转移酶的过度表达。
[0014]
本发明有利地提供多肽产物的增强的β-1，4半乳糖基化。特别地，本发明已被证明可最大化细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞，cho)中产生的治疗性单克隆抗体(mab)的天冬酰胺(n)-连接的聚糖的β-1，4半乳糖基化。本发明结合了两种遗传修饰以同时消除代谢瓶颈(通过增加udp-gal的细胞内可用性，它是β-1，4半乳糖基化所需的共底物)和细胞机制瓶颈(通过增加细胞表达的β4galtl量)。本发明包括消除cosmc的表达，例如使用特定的锌指核酸酶[5]或crispr-cas9技术[6]。cosmc表达的废除消除了苏氨酸/丝氨酸(o)连接的β-1，3半乳糖基化，从而产生带有所谓tn抗原的细胞糖蛋白。消除o-连接的半乳糖基化大大减少了(大约30％[7])尿苷二磷酸半乳糖(udp-gal)的消耗，udp-gal是所有半乳糖基化反应所需的供体代谢物，用于细胞半乳糖基化和增加udp-gal对治疗性蛋白质产品的n-连接β-1，4半乳糖基化的可用性。本发明还包括用β4galt基因转染细胞。β4galt酶的异位表达增加了细胞将β-1，4-连接的半乳糖残基添加到糖蛋白n-连接聚糖的能力和速率。
[0015]
减少的o-galnac半乳糖基化
[0016]
在一个实施方案中，减少的o-galnac半乳糖基化包括细胞中o-galnac半乳糖基化活性的基本消除。在一个实施方案中，修饰细胞对多肽的o-galnac半乳糖基化可能检测不到。
[0017]
细胞o-galnac半乳糖基化可以通过流式细胞术测量，例如使用凝集素辅助流式细胞术。vvl(vicia villosa)凝集素以高特异性结合tn-抗原(废除o-糖基化)。细胞可以与荧
光标记或生物素化结合剂(如vvl)一起孵育，并使用流式细胞术进行分析或选择。在结合剂(例如vvl)结合方面，给出比对照更高信号的细胞群是那些o-连接的半乳糖基化已被废除的细胞群。不呈现荧光的细胞具有o-连接的半乳糖基化。因此，流式细胞术可以提供细胞表面o-半乳糖基化的相对定量。使用vvl流式细胞术的o-半乳糖基化可以使用stolfa等人报道的方法(sci rep 6，30392(2016).https://doi.org/10.1038/srep30392)，其通过引用并入本文。cho细胞系中报道的o-聚糖(yang等人，molecular&cellular proteomics，2014，13(12)3224-3235.https://doi.org/10.1074/mcp.m114.041541，通过引用并入本文)是t-抗原、st-因子和唾液酸-tn抗原，它们可以分别用苋菜(amaranthus caudatus，acl)或花生凝集素(pna)和木菠罗素凝集素(jacalin lectins)的结合剂检测。
[0018]
o-连接的半乳糖基化也可以使用传统的液相色谱法或基于质谱法的方法进行测量(mulagapati等人，biochemistry 2017,56,9,1218-1226.https://doi.org/10.1021/acs.biochem.6b01244，其通过引用并入本文)。
[0019]
通过去除细胞提供功能性cosmc分子伴侣的能力，可以防止或减少细胞中的o-galnac半乳糖基化。可以修饰细胞使得cosmc分子伴侣不表达(例如cosmc分子伴侣敲除)。或者，cosmc分子伴侣的表达可能在修饰细胞中减少。在一个实施方案中，可以通过敲除细胞中功能性cosmc分子伴侣降低细胞中的o-galnac半乳糖基化活性。敲除可包括cosmc基因cigalticl(基因id：2375260)的基因敲除。基因敲除可包含cosmc基因序列中的插入、缺失或一个或多个点突变。在一个实施方案中，编码cosmc分子伴侣的基因序列(ciga1ticl)可以被删除或部分删除。在另一个实施方案中，编码cosmc分子伴侣的基因序列(cigalticl)可以用dna序列插入物修饰，例如以敲除该基因。在一个实施方案中，编码cosmc分子伴侣的基因序列(ciga1ticl)可以被其非功能性形式取代。
[0020]
在另一个实施方案中，来自cosmc基因(cigaltic1)的翻译可以被沉默/抑制，例如通过rna沉默。rna沉默(或rna干扰)是指基因沉默效应家族，通过这种效应，基因表达受到非编码rna(如microrna)的负调控。rna沉默也可以定义为由双链rna(dsrna)触发的基因表达的序列特异性调节。因此，在一个实施方案中，细胞可以与能够靶向cosmc基因序列或其转录物的rna分子(例如mirna、sirna或pirna)接触。在另一个实施方案中，可以修饰细胞以编码和表达这样的rna分子。
[0021]
在另一个实施方案中，cosmc分子伴侣可以被修饰以使其没有功能性，或功能性显着降低。术语“功能性”是指cosmc分子伴侣的功能性能力，以避免聚集、蛋白酶体降解，从而避免高尔基体中t-合酶的活性。修饰可以包括相对于野生型的cosmc分子伴侣氨基酸序列中的一处或多处突变。突变可以包括一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加。修饰可以包括cosmc分子伴侣氨基酸序列的截短。技术人员将熟悉可以进行以基本上消除或降低活性蛋白例如cosmc分子伴侣的功能的技术和序列修饰。
[0022]
在另一个实施方案中，降低细胞中的o-galnac半乳糖基化活性可以通过敲除细胞中的功能性t-合酶来进行。通过去除细胞提供功能性t-合酶的能力，可以防止或减少细胞中的o-galnac半乳糖基化。t-合酶可以是核心1合酶、糖蛋白-n-乙酰半乳糖胺3-β-半乳糖基转移酶1(也称为c1galt1)。在一个实施方案中，c1galt1是genebank编号rlq78471.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/rlq78471.1)。在一个实施方案中，c1galt1由基因id号为100761169的clgalt1基因编码。
[0023]
可以修饰细胞使得不表达t-合酶(例如t-合酶敲除)。或者，t-合酶的表达可在修饰细胞中降低。在一个实施方案中，降低细胞中的o-galnac半乳糖基化活性可以通过敲除细胞中的功能性t-合酶来实现。敲除可包括编码t-合酶的基因的基因敲除。基因敲除可包含t-合酶基因序列中的插入、缺失或一处或多处点突变。在一个实施方案中，编码t-合酶的基因序列可以被删除或部分删除。在另一个实施方案中，编码t-合酶的基因序列可以用dna序列插入物修饰，例如以敲除该基因。在一个实施方案中，编码t-合酶的基因序列可以被其非功能性版本取代。
[0024]
在另一个实施方案中，t-合酶基因的翻译可以被沉默/抑制，例如通过rna沉默。在一个实施方案中，细胞可以与能够靶向t-合酶基因序列的rna分子(例如mirna、sirna或pirna)或其转录物接触。在另一个实施方案中，可以修饰细胞以编码和表达这样的rna分子。
[0025]
在另一个实施方案中，t-合酶可以被修饰以使其没有功能性，或功能性显着降低。术语“功能性”旨在指代t-合酶进行o-galnac半乳糖基化的功能性能力。修饰可以包括相对于野生型的t-合酶氨基酸序列中的一处或多处突变。突变可包括一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加。修饰可以包括t-合酶氨基酸序列的截短。技术人员将熟悉可以进行以基本上消除或降低活性蛋白质例如t-合酶的功能的技术和序列修饰。
[0026]
在一个实施方案中，细胞降低或消除了功能性cosmc分子伴侣的水平。在一个实施方案中，细胞具有降低或消除水平的功能性t-合酶。在一个实施方案中，细胞降低或消除了功能性cosmc分子伴侣和功能性t-合酶的水平。在另一个实施方案中，通过敲除细胞中的功能性cosmc分子伴侣和敲除细胞中的功能性t-合酶来降低细胞中的o-galnac半乳糖基化活性。
[0027]
技术人员将熟悉遗传修饰dna的技术，例如消除基因的表达，例如那些编码cosmc和t-合酶的基因。例如，特定的锌指核酸酶[5]或crispr-cas9技术[6]可用于特定的基因修饰。
[0028]
cosmc和/或t-合酶的基因敲除可包括编码基因内一个或多个碱基的插入/缺失。ronda等人(2014.biotechnology and bioengineering(生物技术和生物工程).vol.111(8),pp.1604-1616.https://doi.org/10.1002/bit.25233；通过引用并入本文)描述了插入或缺失改变(插入/缺失)(insertion/deletion)策略，可用于敲除诸如cosmc的基因。
[0029]
在一个替代的实施方案中，细胞中功能性t-合酶的减少可包括细胞中t-合酶的抑制。t-合酶可以被布置为阻断t-合酶活性的试剂抑制，例如布置为阻断t-合酶活性位点的合成galnac糖配体。可以通过提供去除了3-羟基或4-羟基的galnac糖来抑制t-合酶。正如brockhausen等人所报道的，已知这种修饰的galnac糖会抑制clgalt1活性。(biochemistry and cell biology(生物化学和细胞生物学),1992,70(2):99-108,(https://doi.org/10.1139/o92-015)，其通过引用并入本文。
[0030]
β1,4-半乳糖基转移酶的过表达
[0031]
在一个实施方案中，可以通过提供β1,4-半乳糖基转移酶i的异位表达来提供β1,4-半乳糖基转移酶在细胞中的过表达。在一个实施方案中，用编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸转化细胞。编码β1,4-半乳糖基转移酶i的核酸序列可以是染色体整合的(稳定转化的)。在另一个实施方案中，β1,4-半乳糖基转移酶可以从转化到细胞中的质粒过表达(例如
瞬时表达)。
[0032]
技术人员将认识到，β1,4-半乳糖基转移酶具有β1,4-半乳糖基转移酶活性的功能。β1,4-半乳糖基转移酶可以是重组的β1,4-半乳糖基转移酶。β1,4-半乳糖基转移酶可以是异源的β1,4-半乳糖基转移酶。在一个实施方案中，β1,4-半乳糖基转移酶是哺乳动物，优选人类的β1,4-半乳糖基转移酶。β1,4-半乳糖基转移酶可包含seq id no：1(ncbi参考序列：np_001488.2)的序列，或其具有功能性β1,4-半乳糖基转移酶活性的变体。
[0033]
在一个实施方案中，β1,4-半乳糖基转移酶是β1,4-半乳糖基转移酶同种型i(β4galt1)。技术人员可以考虑其他β1,4-半乳糖基转移酶同种型，例如同种型1-7中的任何一种。优选地，β1,4-半乳糖基转移酶是选自同种型1、2、3和4的同种型(ncbi参考序列：分别为np_001488.2、np_001365424、np_001365425.1和np_001365426.1)。技术人员将认识到，β1,4-半乳糖基转移酶可以源自不同的生物体，例如智人(homo sapiens)、小家鼠(mus musculus)、褐家鼠(rattus novergicus)、黑猩猩(pan troglodytes)和牛(bos taurus)。优选人类β4galt1(uniprotkb蛋白p15291)，因为据报道这种特殊的酶在cho-衍生的糖蛋白中实现了最高水平的β-1,4半乳糖基化。
[0034]
β1,4-半乳糖基转移酶可以过表达，例如相对于未修饰细胞的正常表达(例如在相同条件下)。在相同细胞培养条件下，相对于未修饰细胞中β1,4-半乳糖基转移酶的典型表达，β1,4-半乳糖基转移酶的表达/过表达可以至少增加两倍的表达。在相同的细胞培养条件下，相对于未修饰细胞中β1,4-半乳糖基转移酶的典型表达，β1,4-半乳糖基转移酶的表达/过表达可以至少增加3、4、5或10倍的表达。相对于未修饰的细胞，表达的增加可能足以提供多肽产物的β1,4半乳糖基化的增加。可以通过检测多肽产物的β1,4-半乳糖基化的增加来检测β1,4-半乳糖基转移酶的成功过表达。
[0035]
过表达可以是诱导性的或组成性的。在一个实施方案中，β1,4-半乳糖基转移酶的表达是组成型的。表达的控制可以由启动子提供，该启动子可以是细胞中的组成型或诱导型启动子。在一个实施方案中，细胞在启动子的控制下用编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸转化。启动子对于细胞可能是异位的。可以使用的典型启动子包括诱导β1,4-半乳糖基转移酶在细胞中过表达的任何启动子，例如选自cmv、sv40、pgk-1、ubc和cag的启动子。在一个实施方案中，β1,4-半乳糖基转移酶的启动子是人类延伸因子-1α(hef-1α)核心启动子。β1,4-半乳糖基转移酶可由复合hefl-htlv启动子诱导，该启动子偶联人类延伸因子-lα(ef-lα)核心启动子和人类t-细胞白血病病毒(htlv)1型长末端重复序列的r区段和部分u5序列(r-u5’)。
[0036]
在一个替代的实施方案中，可以用编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸转化细胞，其中它被整合到染色体上以处于细胞的内源启动子的控制之下。例如，促进组成型表达的内源性启动子。
[0037]
在另一个实施方案中，细胞的内源性β1,4-半乳糖基转移酶可以过表达。例如，可以转化异位启动子并将其插入细胞的染色体以控制β1,4-半乳糖基转移酶的表达。在一个实施方案中，内源性β1,4-半乳糖基转移酶启动子通过重组替换为组成型或诱导型启动子，例如受多西环素调控的tetr-cmv启动子。
[0038]
在一个实施方案中，转化到细胞中的核酸是编码β1,4-半乳糖基转移酶和/或启动子的质粒。质粒可包含编码β1,4-半乳糖基转移酶和/或启动子的序列和染色体dna的侧翼
序列，用于将编码β1,4-半乳糖基转移酶和/或启动子的序列异源重组到细胞的染色体中。在一个实施方案中，编码β1,4-半乳糖基转移酶和启动子的质粒包含puno(例如来自invivogen)。puno提供hb4galt1基因并使用杀稻瘟素抗性基因。blasticidin允许快速选择转染细胞。
[0039]
细胞
[0040]
细胞可以是真核生物。该细胞可以是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，细胞可以选自哺乳动物细胞、昆虫细胞和原生动物细胞，例如利什曼原虫细胞(leishmania tarentolae)。在一个实施方案中，该细胞适用于生产多肽产物。这样的细胞可以选自cho、nso、sp2/0、per.c6、sf9、very、bh、hela、cos、mdck、293、293t、3t3、wi38、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、crl7030和hs578bst。哺乳动物细胞可以选自cho、nso、sp2/0、per.c6、very、bh、hela、cos、mdck、293、293t、3t3、wi38、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、crl7030和hs578bst。cho细胞可以是cho细胞变体，例如选自包含dg44、cho-s、cho-k1、cho-dxb11和gs-cho(使用谷氨酰胺合成酶(gs)基因表达系统的cho-ki衍生细胞系)变体。
[0041]
在一个实施方案中，细胞是cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)或hek细胞(人胚肾细胞)，例如hek-293。在一个优选的实施方案中，细胞是cho细胞。cho细胞可以是cho细胞系cho vrc01或cho dp12。技术人员将认识到可以使用/修饰具有与cho细胞相同或基本相似的糖基化途径的任何合适的细胞。
[0042]
在细胞是昆虫细胞的实施方案中，细胞可以包含sf9或由sf9组成。昆虫细胞可以是鳞翅目昆虫细胞。
[0043]
多肽产物
[0044]
多肽产物可以是异源多肽。多肽产物可以是重组多肽。多肽产物可包含生理或代谢相关的蛋白质。多肽产物可包含细菌或细菌来源的蛋白质。多肽产物可包含哺乳动物或哺乳动物来源的蛋白质。多肽产物可以是任何肽、多肽或蛋白质。多肽产物可包含研究、诊断或治疗分子。
[0045]
在一个实施方案中，多肽产物是抗体肽，例如单克隆抗体的一种或多种肽。在一个实施方案中，多肽产物是抗体或其片段，例如重链或轻链肽。
[0046]
多肽产物可包含酶或其底物、蛋白酶、酶活性调节剂、肽适体、抗体、蛋白质-蛋白质相互作用的调节剂、生长因子或分化因子。
[0047]
多肽产物可以选自治疗性分子；药物；前药；功能性蛋白质或肽，例如酶或转录因子；微生物蛋白质或肽；以及毒素。多肽产物可包含病毒颗粒蛋白。
[0048]
多肽产物的长度可为约20至约30000个氨基酸。多肽产物的长度可为约20至约10000个氨基酸。多肽产物的长度可为约20至约5000个氨基酸。多肽产物的长度可为约20至约1000个氨基酸。多肽产物的长度可以是至少约20个氨基酸。多肽产物的长度可以是至少约100个氨基酸。
[0049]
多肽产物可包含抗il-8igg1κmab的一种或多种或所有肽。多肽产物可以包含一种或多种或所有选自以下的治疗剂的肽：德卢替康-曲妥珠单抗([fam-]trastuzumab deruxtecan)、乐利单抗(leronlimab)、纳索利单抗(narsoplimab)、银马泽伯(regneb3)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)、塔法西塔单抗(tafasitamab)、英比利珠单抗(inebilizumab)、沙利珠单抗(satralizumab)、依普奈珠单抗(eptinezumab)、艾萨妥昔单
抗(isatuximab)、替妥木单抗(teprotumumab)、立赞利珠单抗(crizanlizumab)、维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、利散吉珠单抗(risankizumab)、洛莫索珠单抗(romosozumab)、布洛舒单抗(burosumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、依玛鲁单抗(emapalumab)、依帕伐单抗(emapalumab-lzsg)、厄瑞努单抗(erenumab)、瑞玛奈珠单抗(fremanezumab)、伽奈珠单抗(galcanezumab)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、伊巴组单抗(ibalizumab)、伊巴珠单抗(ibalizumab-uiyk)、拉那鲁单抗(lanadelumab)、莫格利组单抗(mogamulizumab、雷夫利珠单抗(ravulizumab(alxn1210))、替曲吉珠单抗(tildrakizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、苯拉组单抗(benralizumab)、布罗达单抗(brodalumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、依米赛珠单抗(emicizumab)、谷瑟库单抗(guselkumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、西鲁库单抗(sarilumab)、阿特利珠单抗(atezolizumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、伊卡组单抗(ixekizumab)、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、阿利苏单抗(alirocumab)、达妥木单抗(daratumumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、依妥组单抗(elotuzumab)、依沃苏单抗(evolocumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、奈妥木单抗(necitumumab)、司库奴单抗(secukinumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿伦单抗(alemtuzumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)、珀妥珠单抗(pertuzumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、贝利木单抗(belimumab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、伊匹单抗(ipilimumab)、地舒单抗(denosumab)、卡那奴单抗(canakinumab)、戈利木单抗(golimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托珠单抗(tocilizumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、依库珠单抗(eculizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、巴利昔单抗(basiliximab)、英利昔单抗(infliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)以及阿昔单抗(abciximab)。
[0050]
多肽产物可能有益于任何不含o-连接聚糖的糖蛋白。特别是，由于(i)同质性增加，(ii)溶瘤mab的细胞毒性效应功能(adcc、cdc、adcp)增强，以及(iii)在抗炎mab中免疫反应调节的唾液酸化增加，临床试验中或已经上市的mab可以从本发明中受益。
[0051]
在一个实施方案中，多肽产物是一种病毒蛋白。病毒蛋白可包含病毒载体的组分，例如raav。raav可以是aav2或aav5血清型。
[0052]
raav载体和其他病毒载体用于基因治疗。raav5具有至少一个可受益于本发明的n-连接糖基化位点，因为预测raav免疫原性和靶细胞相互作用由o-连接聚糖介导。
[0053]
在一个实施方案中，细胞可以表达或编码多种产物以供表达。多种产物可包含抗体或抗体变体分子的重链和轻链。
[0054]
细胞可以用或不用编码多肽产物的核酸转化。例如，细胞可以根据本发明进行修饰并且可以用编码多肽产物的核酸转化(例如细胞可以稍后修饰以表达选择的多肽产物)。在另一个实施方案中，细胞被进一步修饰以表达多肽产物。在一个实施方案中，细胞已经用
编码多肽产物的核酸转化。
[0055]
编码多肽产物的核酸可以被稳定转化(染色体整合)或瞬时转染(例如在表达质粒上)。技术人员将熟悉转化细胞以引起所需多肽产物表达的技术和公开可用的技术。例如，多肽产物可以编码在适合多肽产物在细胞中转化和表达的表达质粒、构建体或病毒载体(例如慢病毒载体)上。表达质粒或构建体可包含可操作地连接至编码多肽产物的基因的启动子。启动子可以是诱导型或组成型的。质粒或构建体可以被安排整合到细胞的染色体中，例如通过同源重组或插入元件。质粒或构建体可包含选择标记以确定成功转化的细胞。
[0056]
本发明的修饰可以应用于通过任何选择/扩增策略表达重组产物的细胞。稳定转染的细胞系可以基于基因扩增和表达系统(例如dhfr)或基于代谢选择(例如谷氨酰胺合成酶)。
[0057]
质粒或构建体的分子成分可包括复制起点、启动子和增强子元件(天然或合成)、晚期启动子、内含子、终止信号(聚腺苷酸化)、病毒放大器、ires元件和可选择的传播基因中的一种或多种。
[0058]
质粒或构建体的其他元件可以包括以下的一种或多种：为遗传调控因子的wpre(土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件)序列、支架/基质附着区(s/mar)、基因座控制区(lcr)、为绝缘体的无处不在的染色质开放元件(ucoe)和稳定抗抑制元件(star)。
[0059]
例如编码多肽产物和/或β1,4-半乳糖基转移酶的核酸可以通过重组位点整合到细胞的染色体中，例如使用cre重组酶、flp-frt或phic31整合酶。
[0060]
阳性选择标记可能适用于cho细胞，例如那些依赖吉欧霉素(zeocin)、嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素b(hygromycin b)或g418选择的细胞。
[0061]
在一个实施方案中，可以进一步修饰细胞以表达α-2,6唾液酸转移酶(α6siat)以提高多肽产物如mah n-连接聚糖上的n-乙酰神经氨酸(neu5ac)的含量。α-2,6唾液酸转移酶(α6siat)可以安排在细胞中过表达。例如，细胞可以进一步包含编码α-2,6唾液酸转移酶(α6siat)的核酸，其可以与细胞异源。编码α-2,6唾液酸转移酶(α6siat)的核酸可以是染色体整合的或染色体外的，例如在表达质粒上。
[0062]
其他方面
[0063]
根据本发明的另一个方面，提供了修饰细胞的方法，其中修饰细胞以增强多肽产物的β-1,4半乳糖基化，所述修饰包括：
[0064]
降低细胞中的o-galnac半乳糖基化活性通过减少细胞中功能性cosmc分子伴侣和/或通过减少细胞中功能性t-合酶；以及
[0065]
修饰细胞以提供细胞中β1,4-半乳糖基转移酶的过表达。
[0066]
该方法可以包括用编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸转化细胞。
[0067]
此外，该方法可包括修饰编码cosmc分子伴侣和/或t-合酶的基因，或修饰其调控元件。修饰可以是基因的敲除。在一个实施方案中，基因被删除，或被插入破坏。在另一个实施方案中，基因的核酸序列被修饰，使得cosmc分子伴侣和/或t-合酶不以功能形式表达，或以功能活性/能力显着降低的形式表达。
[0068]
该方法还可以包括修饰细胞以表达多肽产物。例如，可以用编码用于表达的多肽产物的核酸转化细胞。
[0069]
转化的核酸可包含用于鉴定成功转化的细胞的选择标记。因此，该方法还可以包
括选择成功转化的已经被修饰的细胞的步骤。选择可以通过在选择培养基上生长或在允许选择的试剂存在下进行。
[0070]
可以顺序地或在一个转化事件中提供对细胞的修饰。
[0071]
根据本发明的另一个方面，提供了生产多肽产物的方法，该方法包括获得或提供根据本发明修饰的细胞，以及在适于表达多肽产物的条件下培养该细胞。
[0072]
可以产生具有至少80％β-1,4半乳糖基化和/或至少50％双半乳糖基化的多肽产物。在另一个实施方案中，可以生产具有至少90％β-1,4半乳糖基化和/或至少60％双半乳糖基化的多肽产物。在另一个实施方案中，可以生产具有至少95％β-1,4半乳糖基化和/或至少75％双半乳糖基化的多肽产物。
[0073]
在另一个实施方案中，可以生产多肽产物以具有至少0.5倍增加的β-1,4半乳糖基化和/或至少0.5倍增加的双半乳糖基化。在另一个实施方案中，可以生产多肽产物以具有至少增加2倍的β-1,4半乳糖基化和/或至少增加2倍的双半乳糖基化。在另一个实施方案中，可以生产多肽产物以具有增加至少5倍的β-1,4半乳糖基化和/或增加至少5倍的双半乳糖基化。倍数增加可以是相对于与未根据本发明修饰的相同细胞而言的，例如在相同培养条件下。
[0074]
在适于表达多肽产物的条件下培养细胞可包括在适于细胞生长的温度和气氛下在细胞生长培养基中培养细胞，例如标准条件(例如对于哺乳动物细胞约37℃和约5％ co2)。技术人员将熟悉用于维持和生长细胞的合适的生长培养基。例如，细胞生长培养基可以包括基础培养基，例如mem(最低必需培养基)或dmem(杜氏改良培养基(dulbecco's modified eagle's medium))，复合培养基例如imdm(iscove's modified dulbecco's medium)或rpmi-1640，或无血清培养基例如ham的f-10或f-12。基础培养基可包括化学成分确定的基础培养基。细胞培养物可以补充有细胞饲料。在细胞培养过程中可以添加额外的葡萄糖和/或氨基酸，例如l-谷氨酰胺。昆虫细胞可以在合适的昆虫细胞生长培养基中生长，例如grace培养基。
[0075]
培养可以是连续培养或分批培养，例如补料分批培养。在一个实施方案中，培养是补料分批培养。
[0076]
在一个实施方案中，可以用umg补料策略(即在培养基中添加尿苷/锰/半乳糖)培养细胞。
[0077]
有利地，结合umg补料策略可以实现更高水平的半乳糖基化。与标准umg补料相比，细胞需要的剂量要少得多，因为大多数umg补料会绕过细胞o-半乳糖基化并直接进入n-半乳糖基化。
[0078]
可以从细胞和/或上清液中收获多肽产物。例如，可以从剩余的细胞和/或培养基内容物中分离和纯化多肽产物。技术人员将熟悉一系列合适的纯化技术和用于从细胞例如哺乳动物细胞中纯化多肽产物的技术。
[0079]
根据本发明的另一个方面，提供了由本发明的修饰细胞产生的或由本发明的方法产生的多肽。
[0080]
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的修饰细胞用于生产多肽产物的用途。
[0081]
根据本发明的另一个方面，提供了核酸，例如质粒，其编码：
[0082]
靶向敲除或减少细胞中功能性cosmc分子伴侣和/或t-合酶表达的遗传修饰元件；
[0083]
用于在细胞中表达的b4galt；以及
[0084]
任选的选择标记，例如抗生素抗性基因。
[0085]
质粒可以进一步编码用于表达的多肽产物。
[0086]
根据本发明的另一个方面，提供了试剂盒，其包含：
[0087]-第一质粒，其编码：
[0088]
靶向敲除或减少细胞中功能性cosmc分子伴侣和/或t-合酶表达的遗传修饰元件；以及
[0089]
第二质粒，编码用于在细胞中表达的b4galt和任选的选择标记，例如抗生素抗性基因。
[0090]
该试剂盒还可包含编码用于表达的多肽产物的质粒，例如本文所述的。
[0091]
该试剂盒可以进一步包含细胞，例如用于用质粒进行转导和遗传修饰的细胞。该细胞可以是本文所述的细胞，例如哺乳动物细胞(例如cho细胞)。该试剂盒还可以包含一种或多种缓冲液和/或用于细胞转化的试剂。该试剂盒可包含一种或多种选择剂，用于选择成功转化或修饰的细胞。
[0092]
在一个实施方案中，细胞可能能够表达，或可能已经被预先修饰以表达多肽产物。
[0093]
遗传修饰元件可包含用于插入细胞染色体的dna。此外或备选地，遗传修饰元件可以提供向导rna和/或核酸酶。遗传修饰元件可包含锌指核酸酶、talen(转录激活因子样效应核酸酶)或向导rna(grna)和cas9(用于crispr修饰)。遗传修饰元件可包含布置成插入(例如通过双重组)和破坏细胞中cosmc分子伴侣和/或t-合酶的靶向遗传元件的序列。遗传修饰元件可包含布置成结合编码cosmc分子伴侣和/或t-合酶的基因的转录物的沉默rna序列(例如mirna或sirna)。遗传修饰元件可包含具有区段标记的同源重组盒，例如抗生素抗性基因。
[0094]
定义
[0095]
术语“增强多肽产物的β-1,4半乳糖基化”应理解为是指多肽产物在细胞中被β-1,4半乳糖基化。在一个实施方案中，多肽产物的β-1,4半乳糖基化比它在未修饰细胞(例如野生型细胞)中的更大。在一个实施方案中，多肽产物的β-1,4半乳糖基化大于它在不降低o-galnac半乳糖基化活性和/或不在细胞中过表达β1,4-半乳糖基转移酶的相同细胞类型中的水平，例如野生型细胞。
[0096]
β-1,4半乳糖基化可以是天冬酰胺(n)-连接的聚糖的β-1,4半乳糖基化。增强的β-1,4半乳糖基化可包括产物β-1,4半乳糖基化增加至至少80％，和/或双半乳糖基化物质增加至至少50％。
[0097]
对于“抗体”，我们包括基本上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人抗体、人源化抗体(其中至少一个氨基酸相对于天然存在的人抗体发生突变)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体，以及抗原结合片段和它们的衍生物。特别地，本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，无论是天然的还是部分或完全合成产生的。该术语还涵盖具有结合结构域(binding domain)的任何多肽或蛋白质，该结合结构域是或同源于抗体结合结构域。这些可以来自天然来源，或者它们可以部分或
全部合成生产。抗体的例子是免疫球蛋白同种型(例如igg、ige、igm、igd和iga)及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，例如fab、scfv、fv、dab、fd；以及双特异抗体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体可称为“mab”。
[0098]
已经表明，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。本发明的结合片段的实例是(i)由ve、vh、ce和chi结构域组成的fab片段；(ii)由vh和chi结构域组成的fd片段；(iii)由单个抗体的vl和vh结构域组成的fv片段；(iv)由vh结构域组成的dab片段；(v)隔离的cdr区域；(vi)f(ab’)2片段，包含两个连接的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过肽接头连接，这允许两个结构域缔合形成抗原结合位点；(viii)双特异性单链fv二聚体(pct/us92/09965，通过引用并入本文)以及；(ix)“双特异抗体(diabody)”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(wo94/13804，通过引用并入本文)。
[0099]
当提及变体多肽或核苷酸序列时，技术人员将理解可以容忍一个或多个氨基酸残基或核苷酸取代、缺失或添加，任选地在序列中可以容忍两个取代，使得它保持其功能。技术人员将理解，可以取代、添加或去除1、2、3、4、5个或更多个氨基酸残基或核苷酸而不影响功能。序列同一性的引用可以通过blast序列比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)使用标准/默认参数。例如，该序列可以具有至少99％的同一性并且仍然具有根据本发明的功能。在其他实施方案中，该序列可以具有至少98％的同一性并且仍然具有根据本发明的功能。在另一个实施方案中，该序列可以具有至少95％的同一性并且仍然具有根据本发明的功能。在另一个实施方案中，该序列可以具有至少90％、85％或80％的同一性并且仍然根据本发明发挥功能。在一个实施方案中，变异和序列同一性可以根据全长序列。在其他实施方案中，变异可能限于非保守序列和/或活性位点之外的序列，例如结合结构域。因此，活性位点或蛋白质的结合位点可能是100％相同的，而侧翼序列可能包含规定的同一性变化。此类变体可称为“保守活性位点变体”。
[0100]
氨基酸置换可以是保守置换。例如，修饰的残基可包含与野生型取代的残基基本相似的性质。例如，取代的残基可包含与野生型取代的残基基本相似或相等的电荷或疏水性。例如，取代的残基可包含与野生型取代的残基基本相似的分子量或空间体积。关于“变体”核酸序列，本领域技术人员将理解可以取代、添加或去除1、2、3、4、5个或更多个密码子而不影响功能。例如，可以考虑保守替代。
[0101]
技术人员将理解，在适当的情况下，本发明的一个实施方案或方面的可选特征可适用于本发明的其他实施方案或方面。
[0102]
现在将参考附图仅通过示例的方式更详细地描述本发明的实施方案。
[0103]
图1-mab n-聚糖变异性的来源。变异性源于糖基化过程。机制：在高尔基体中的停留时间(q
p
)1、酶活性、酶可及性等。代谢：核苷酸糖供体(nsd)可用性2。nsd同时被消耗用于细胞和产物糖基化。
[0104]
图2-n-聚糖变异性。
[0105]
图3-通过以下方式提高cho细胞的mab半乳糖基化能力：a.通过敲除cosmc分子伴侣消除o-galnac半乳糖基化；以及b.通过过表达β-1,4-半乳糖基转移酶i来增加细胞半乳糖基化能力。
[0106]
图4-cho dp12细胞系。这两个细胞工程事件都是必需的。
[0107]
图5-cho vrc01细胞系。这两个细胞工程事件都是必需的。
[0108]
图6-与其他技术的比较。
[0109]
图7-补料分批cho dp12细胞培养。galmax增强半乳糖基化
[0110]
实施例1-galmax-最大化治疗性蛋白质半乳糖基化：同时消除代谢和细胞机制瓶颈
[0111]
概述
[0112]
β-1,4半乳糖基化对治疗性蛋白质功效的积极影响最近才被报道。表1总结了各种聚糖修饰对mah癌症杀伤能力的影响，并强调了半乳糖基化对安全性、cdc、adcc和pk/pd的积极影响。
[0113]
表1.mah癌症杀伤能力。(1,4)-半乳糖基化是治疗性蛋白质变异性的来源。半乳糖基化可提高功效并降低异质性(参见raju等人(2012)mabs 4(3):385-391planinc等人(2017)eur.j.hosp.pharm.sc.pract.24(5):286-292，其通过引用并入本文)。
[0114][0115]
本发明使细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞，cho)中产生的治疗性单克隆抗体(mab)的天冬酰胺(n)-连接聚糖的β-1,4半乳糖基化最大化。本发明结合了两种基因修饰以同时消除代谢瓶颈(通过增加udp-gal的细胞内可用性，是β-1,4半乳糖基化所需的辅助底物)和细胞机制瓶颈(通过增加细胞表达的β4galt1的量)。本发明包括以下两个基因工程事件，可以依次或同时进行：
[0116]
1.核心1β3galt特异性分子伴侣(cosmc)的基因敲除。
[0117]
第一个基因工程事件涉及使用特定的锌指核酸酶[1]或crispr-cas9技术[2]消除cosmc的表达。cosmc表达的废除消除了苏氨酸/丝氨酸(o)-连接的β-1,3半乳糖基化，从而产生带有所谓的tn抗原的细胞糖蛋白。消除o-连接的半乳糖基化大大减少(大约30％[3])尿苷二磷酸半乳糖(udp-gal)的消耗，所有半乳糖基化反应所需的供体代谢物，用于细胞半乳糖基化并增加udp-gal对治疗性蛋白质产品的n-连接β-1,4半乳糖基化的可用性。
[0118]
2.β-1,4半乳糖基转移(β4galt)酶的基因过表达。
[0119]
第二个基因工程事件涉及用β4galt基因稳定转染细胞，该细胞可以是任何同种型(1到7)，并且来自不同的生物体(智人(homo sapiens)、小家鼠(mus musculus)、褐家鼠(rattus novergicus)、黑猩猩(pan troglodytes)和牛(bos taurus))。优先选择人类β4galt1(uniprotkb蛋白p15291)，因为据报道这种特殊的酶在cho衍生的糖蛋白中实现了最高水平的β-1,4半乳糖基化[4]。
[0120]
β4galt酶的异位表达增加了细胞将β-1,4-连接的半乳糖残基添加到糖蛋白n-连接的聚糖的能力和速率。
[0121]
材料
[0122]
产生抗il-8igg1κ的cho dp-12克隆#1934[ail8.92 nb 28605/14](crl-12445
tm
)用于我们的初步研究。该细胞系适用于使用含4mm l-谷氨酰胺和200nm mtx的ex-302无血清培养基(sigma-aldrich,cat.no.14324c)，悬浮生长。从第3天开始，每48小时一次，通过向基础培养基(sigma-aldrich,cat.no.14324c)中补充6.25％v/v的含葡萄糖的ex-cell advanced cho补料(sigma-aldrich，cat.no.24367c)来进行补料分批培养。补料进一步补充有45％w/v葡萄糖，以在补料后将残余葡萄糖浓度维持在4g/l以上。衍生自cho-k1并产生人类igglκ的第二cho细胞系(vrc01)用于确认galmax策略。这细胞系适用于补充有4mm l-谷氨酰胺和100nm mtx的无血清actipro培养基(hyclone cat.no.sh31039.02)。
[0123]
按照制造商的说明，使用clb-转染装置和clb-转染试剂盒(lonza,cat.no.veca-1001)，用带有人类β4galt1编码序列的puno1质粒转染dp-12和vrc01 cho细胞(invivogen cat.代码punol-hb4galtl)来进行人类β4galt1的异位表达。puno1支架还包含用于选择成功转染细胞的杀稻瘟菌素抗性基因的编码序列。
[0124]
cosmc的敲除是使用crispr-cas9基因组编辑系统进行的，使用从addgene获得的一体化px458质粒(pspcas9(bb)-2a-gfp)(质粒#48138)[8]。靶向cigalticl基因(基因id：2375260)的grna序列(gaatatgtgagtgtggatggagg)是使用cho cas9 target finder(http://staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy，目标id 2375260)设计的[6]。
[0125]
使用带有488nm(蓝色)激发激光的facsaria iii细胞分选仪(beckton-dickinson)选择成功转染px458+sgrna质粒的细胞用于egfp荧光。使用前向和侧向散射标准对同质群体进行门控以选择单峰。使用未转染的细胞作为自发荧光对照来鉴定荧光阳性细胞。回收并培养细胞库。两周后，gfp阴性细胞群被分离并再培养三天，之后，带有cosmc敲除表型的细胞(只带有暴露的galnac残基-tn抗原-在它们的表面o-连接聚糖上)使用facsaria iii仪器通过凝集素辅助细胞分选鉴定和分离。
[0126]
fitc标记的vicia villosa凝集素(vector labs，cat.no.b-1235)，对tn抗原具有特异性，用于cosmc敲除细胞分选。对用人类β4galtl转染的细胞进行了类似的程序，但使用的凝集素是(来自鸡冠刺桐(erythrina cristagalli)的荧光素标记的凝集素，vector labs，cat.no.fl-1141)以选择呈现增强的细胞表面β-1,4-半乳糖基化聚糖的细胞。
[0127]
使用最近开发的方法进行mah聚糖分析，该方法已针对糖肽的定量进行了优化(carillo等人，药物分析杂志.volume 10,issue 1，2020年2月，第23-34页.https://doi.org/10.1016/j.jpha.2019.11.008，其通过引用并入本文)。
[0128]
研究结果
[0129]
我们在产生mab的cho细胞中进行了概念验证研究，其中本发明使产物β-1,4半乳糖基化从55.2％增加到96.2％(cho dp12)和从45％增加到97.6％(cho vrc01)，包括双半乳糖基化物种从8.4％显着增加到79.4％(cho dp12)和从5.2％增加到80.3％(cho vrc01)(表8以及图4和图5)。确认设计技术的基本原理的关键发现是，需要cosmc的同时敲除和人类galt1的异位表达才能实现本发明获得的产物β-1,4半乳糖基化的异常增加。
[0130]
为证实该技术的优势，cho-dp12在补料分批操作下培养，本发明使产物β-1,4半乳糖基化从47.7％增加到91.8％，包括双半乳糖基化种类从7.2％大幅增加至80.0％(表9和图7)。两个关键发现是(i)本发明在补料分批培养下产生增强的产物β-1,4半乳糖基化，这是大规模mab生产的标准做法，以及(ii)本发明产生比仅β4galt1过表达细胞高得多的半乳糖基化，因此表明两种遗传修饰都是最大化产物β-1,4半乳糖基化所必需的。
[0131]
本发明为重组治疗性糖蛋白(包括单克隆抗体(mab))的制造过程中出现的关键质量保证挑战提供了简单而稳健的解决方案。本发明解决的关键挑战是与治疗性糖蛋白的(1)异质性，(2)治疗功效(药效学)和(3)血清半衰期(药代动力学)相关的挑战，如下所述。
[0132]
1.最大化β-1,4半乳糖基化可降低治疗性蛋白质的异质性。
[0133]
β-1,4半乳糖基化是治疗性蛋白质变异性的主要来源[10,11]，甚至是由制造过程中细微的工艺偏差引起的[12]。在制造治疗性蛋白质的大规模细胞培养过程中，营养可用性、代谢物积累、温度、ph和其他生物工艺条件会发生变化。众所周知，生物工艺条件的变化会严重影响糖基化，尤其是β-1,4半乳糖基化[13]。减少产品异质性是确保安全性和治疗性蛋白质的治疗功效的关键，因此是生物制药生产操作的基本目标。
[0134]
本发明抵消了不同生物工艺条件对产物β-1,4半乳糖基化的负面影响，从而降低了产物的异质性：
[0135]
·
通过消除与mab无关的细胞o-连接半乳糖基化消耗udp-gal来解决营养可用性问题，这约占非工程化cho细胞消耗的所有udp-gal的30％[7]。当细胞o-半乳糖基化被消除时，可以使用更多的udp-gal，并且产物n-半乳糖基化对营养可用性波动的依赖性降低。
[0136]
·
本发明减少了代谢物积累(例如氨)或ph变化/漂移的负面影响，这两者都会通过酶的基因过表达降低β4galt活性。这降低了对细胞培养环境变化的敏感性，因此也降低了产品的异质性。
[0137]
2.增加的β-1,4半乳糖基化增强了抗癌和抗炎单克隆抗体(mab)的功效。
[0138]
高水平的β-1,4半乳糖基化mah聚糖可使抗体依赖性细胞毒性(adcc)增加多达30％[14]，使补体依赖性细胞毒性(cdc)增加多达26％[15]。在许多商业产品中，两种细胞毒性机制(adcc和cdc)都决定了抗癌单克隆抗体的疗效[16,17]。
[0139]
本发明在cho细胞产生的mab的fc上实现了前所未有的β-1,4半乳糖基化水平——高达98％的β4-半乳糖基化n-聚糖(表8和图6)，从而展示了增强抗癌能力的巨大潜力mah产品的活性。
[0140]
据报道，抗体疗法的聚糖上存在α-2,6-n-乙酰神经氨酸(α6neu5ac)残基可增强免疫调节[18]，从而提高抗炎mab的功效。因为添加α6neu5ac需要β-1,4半乳糖残基作为受体，所以高水平的β-1,4半乳糖基化能够增加α6neu5ac的存在[19-21]；因此，通过本发明实现的产物β-1,4半乳糖基化水平的提高可以积极地促进抗炎mab的功效增强。
[0141]
3.增加的β-1,4半乳糖基化有助于提高治疗性蛋白质的血清半衰期。
[0142]
具有较高neu5ac含量(唾液酸化)的治疗性糖蛋白需要减少剂量或降低给药频率，因为增加的唾液酸化会延长治疗性糖蛋白在患者血清中的半衰期[22,23]。因此，增加唾液酸化可能会降低医疗保健提供者和患者的治疗成本。同样，β-1,4半乳糖基化对于添加neu5ac残基本质上是必需的。因此，需要增加β-1,4半乳糖基化水平来实现延长的血清半衰期，从而提高治疗性糖蛋白的治疗效果。
[0143]
cho dp12细胞系
[0144]
参考图4和表2和表3-cho dp12细胞系。这两个细胞工程事件都是必需的。
[0145]
图4以及表2和表3显示了由来自亲本cho dp12细胞的六种细胞系产生的单克隆抗体fc上存在的聚糖分布：
[0146]
(i)cho dp12亲本：非工程化cho dp12细胞。
[0147]
(ii)cho dp 12mcosmc-：在不存在靶向cosmc的grna序列(模拟cosmc-质粒)的情况下，用crispr质粒转染的cho dp 12细胞。
[0148]
(iii)cho dp12 cosmc-：用含有cosmc靶向grna的crispr质粒转染的cho dp12细胞。
[0149]
(iv)cho dp12 mgalt+：用空的(不存在hβ4galt1)puno质粒(模拟galt+质粒)转染的cho dp12细胞。
[0150]
(v)cho dp12 galt+：用含有hβ4galt1的puno质粒转染的cho dp12细胞。
[0151]
(vi)cho dp12 galmax(cosmc-/galt+)：同时含有cosmc敲除和hβ4galtl表达的cho dp12细胞(针对cosmc的crispr敲除进行转染/选择，针对hβ4galtl表达进行转染/选择)。
[0152]
图4a显示了在分批条件下培养的六种cho dp12细胞系中每一种产生的mah fc糖型分布。数据对应于cho dp12亲代的三次培养、mcosmc-的重复培养、cosmc-的四种培养、mgalt+的五种培养、galt+的重复培养和cho dp12 galmax的四种培养。使用质谱法测量mah fc糖基化模式(carillo等人，药物分析杂志(journal of pharmaceutical analysis).volume 10,issue 1,2020年2月，第23-34页.https://doi.org/10.1016/j.ipha.2019.11.008)。
[0153]
观察到四种主要糖型：
[0154]
(i)a2g0f：双触角(biantennary)、非半乳糖基化(non galactosylated)和岩藻糖基化(fucosylated)。
[0155]
(ii)a2g1f：双触角、单半乳糖基化和岩藻糖基化。
[0156]
(iii)a2g2f：双触角、双半乳糖基化和岩藻糖基化。
[0157]
(iv)a2s1g2f：双触角、单唾液酸化(mono-sialylated)、双半乳糖基化和岩藻糖基化。
[0158]
cho dp12亲代、cho dp12 mcosmc-、cho dp12 cosmc-和cho dp12 mgalt+细胞系产生的mah fc糖谱之间没有统计学显着差异(双尾t-检验)，其中平均相对a2g0f、a2g1f和a2g2f的丰度分别为47.8％
±
5％、43.8％
±
4.1％和8.3％
±
1.4％(四种细胞系所有复制培养物的平均值和标准差)。
[0159]
表达hβ4galt1的细胞系表现出a2g0f的显着降低和伴随的a2g2f的增加。对于cho dp12galt+细胞系，a2g0f降低至7.5％
±
0.3％，a2g2f增加至77.9％
±
1.5％。对于cho dp12 galmax(cosmc-/galt+)细胞系，a2g0f降低至3.8％
±
0.4％，a2g2f增加至79.4％
±
1.8％。尽管在galt+和galmax细胞系产生的双半乳糖基化a2g2f糖型中没有观察到统计学上的显着差异，但cho dp 12galmax细胞产生的非半乳糖基化a2g0f糖型约为galt+细胞产生的一半(p《0.01)，因此表明cosmc的敲除有助于增加mab半乳糖基化和整体聚糖同质性。
[0160]
图4b比较了所有cho dp12细胞系产生的总非半乳糖基化(a2g0f)和半乳糖基化
(a2g1f、a2g2f和a2s1g2f之和)糖型。同样，在亲本、cosmc-(模拟)、cosmc-和galt+(模拟)细胞系中，mah fc半乳糖基化在统计学上没有显着差异，其中非半乳糖基化和半乳糖基化的总体平均值(跨所有四种细胞系)分别为47.8％
±
5.0％和52.2％
±
5.0％。相比之下，在cho dp 12galt+和galmax细胞系之间观察到半乳糖基化的显着差异，其中cho dp 12galmax产生3.8％
±
0.4％非半乳糖基化和96.2％
±
0.6％半乳糖基化物种，而7.5％
±
0.3％和92.5％
±
0.3％由cho dp12 galt+细胞系产生。总体而言，当部署在cho dp 12细胞系中时，与亲代细胞系相比，galmax发明使a2g0f减少12倍，a2g2f增加9.4倍，半乳糖基化糖型增加74.1％。
[0161]
表2提供了图4a的数值。
[0162][0163]
表3提供了图4b的数值。
[0164][0165]
cho vrc01细胞系
[0166]
参考图5和表4和表5-cho vrc01细胞系。这两个细胞工程事件都是必需的。
[0167]
图5和表4和表5显示了六种cho vrco1衍生细胞系产生的mab的fc上存在的聚糖分布，与它们的dp12对应细胞系类似，它们被命名为vrc01亲代、vrc01 mcosmc-、vrc01 cosmc-、vrc01 mgalt+、vrc01 galt+和vrc01 galmax(cosmc-/galt+)。
[0168]
图5a显示了在分批条件下培养的六种cho vrc01细胞系中每一种产生的mah fc糖型分布。数据对应于vrc01亲代的五种培养物、vrc01 mcosmc-的单一培养物、vrc01 cosmc-的四种培养物、vrc01 mgalt+的一式两份培养物、vrc01 galt+的五种培养物和vrc01 galmax的一式三份培养物。使用carillo等人(药物分析杂志.volume 10,issue 1,2020年2月，第23-34页.https://doi.org/10.1016/j.jpha.2019.11.008)概述的质谱法测量mah fc糖基化模式。
[0169]
在cho vrc01细胞系(a2g0f、a2g1f、a2g2f和a2s1g2f)中也观察到了cho dp12衍生细胞系产生的相同主要糖型。在vrc01亲代、vrc01 mcosmc-、vrc01 cosmc-和vrc01 mgalt+细胞系产生的mah fc糖谱之间观察到很少或没有统计学显着差异(双尾t-检验)，其中a2g0f、a2g1f和a2g2f的平均相对丰度分别为58.0％
±
5.7％、37.4％
±
4.7％和4.6％
±
1.1％(四种细胞系所有复制培养物的平均值和标准差)。
[0170]
表达hβ4galt1的细胞系表现出a2g0f的显着降低和伴随的a2g2f的增加。对于vrc01 galt+细胞系，a2g0f降低至8.6％
±
5.0％，a2g2f增加至72.0％
±
5.8％。在vrc01 galmax细胞系中，a2g0f降低至2.4％
±
0.4％，a2g2f增加至80.3％
±
0.6％。vrc01 galmax细胞系产生的a2g0f比vrc01 galt+细胞系少3.6
±
2.2倍，因此表明cosmc的敲除有助于增加mah半乳糖基化和整体聚糖同质性。
[0171]
图5b比较了所有cho vrc01细胞系产生的总非半乳糖基化(a2g0f)和半乳糖基化(a2g1f、a2g2f和a2s1g2f之和)糖型。亲代、mcosmc-、cosmc-和mgalt+细胞系生成的mah fc糖谱之间存在细微差异，其中非半乳糖基化和半乳糖基化的总体平均值(跨所有四种细胞系)分别为58.0％
±
5.7％和42.0
±
5.5％。表达hβ4galt1的细胞系表现出半乳糖基化的显着增加。vrc01 galt+产生91.4％
±
5.0％半乳糖基化和8.6％
±
5.0％非半乳糖基化mab fc聚糖。vrc01 galmax产生97.6％
±
0.4％半乳糖基化和仅2.4％
±
0.4％非半乳糖基化mab fc聚糖。总体而言，与亲本vrc01细胞系相比，在vrc01细胞中部署的galmax发明使半乳糖基化增加了2.2倍，非半乳糖基化聚糖减少了23倍。
[0172]
表4提供了图5a的数值。
[0173][0174]
表5提供了图5b的数值。
[0175][0176]
从cho dp-12和vrc01细胞系获得的结果与控制半乳糖基化的机制一致。限制半乳糖基化的两个关键瓶颈是(i)udp-gal可用性和(ii)β4galt可用性/活性。如果有足够的udp-gal，但β4galt可用性/活性降低，则将观察到低水平的半乳糖基化。相反，如果β4galt可用性/活性过多但udp-gal可用性不足，也会观察到低水平的半乳糖基化。我们的总体结果表明，β4galt可用性限制了未表达hβ4galt1的细胞系(亲本、mcosmc-、cosmc-和mgalt+)中的半乳糖基化。当hβ4galtl被异位表达(galt+和galmax细胞系)时，这个瓶颈得到缓解，并且整体增加galt+和galmax细胞系之间的半乳糖基化是由于cosmc敲除提供的udp-gal可用性的增加。因此，需要两种细胞工程干预(cosmc敲除和异位hβ4galt1表达)来最大化mah fc半乳糖基化，因此galmax发明得到验证。
[0177]
表6比较了cho dp12和cho vrc01分批培养的活细胞积分(ivc)、比生产率(q
p
)和产物滴度。
[0178][0179]
表7比较了cho dp12补料分批培养的活细胞积分(ivc)、比生产率(q
p
)和产物滴度。
[0180][0181]
表6和表7比较了细胞培养kpi，证明galmax技术对用于研究的cho dp 12和cho vrc01细胞系的生产力没有负面影响。表6显示了与分批培养相对应的数据，其中与亲代细胞系相比，dp12galmax显示活细胞积分(ivc)从每天14.3
±
0.22增加到19.5
±
0.95 106细胞ml-1
。与亲本cho dp12相比，ivc的增加导致比生产率(q
p
)从6.21
±
0.16降低到4.04
±
0.02pg细胞-1
每天。ivc和q
p
的这些变化相互抵消产生相似的滴度。dp12 galmax达到133.5
±
0.2mg l-1
的mah滴度，略高于亲代cho dp12产生的123.1
±
0.lmg l-1
。
[0182]
与vrc01亲代相比，vrc01 galmax细胞系的ivc值没有统计学显着差异(分别为47.4
±
1.1 106细胞ml-1
每天和48.3
±
0.9 106细胞ml-1
每天)。有趣的是，与亲本cho dp12(5.0
±
0.3pg细胞-1
每天)相比，vrc01 galmax呈现增加的q
p
(6.4
±
0.7pg细胞-1
每天)。与vrc01亲代相比(分别333.6
±
5.3mg l-1
vs 297.4
±
3.8mg l-1
)，在相似的ivc下，q
p
的增加导致vrc01 galmax细胞系的产物滴度略有增加。
[0183]
表7比较了在补料分批模式下培养时四种cho dp12衍生细胞系(dp12亲代、dp12 cosmc-、dp12 galt+和dp12 galmax)的ivc、q
p
和滴度。与dp12亲代实现的43.6
±
1.2 106细胞ml-1
每天相比，dp12 galmax实现的ivc略低，为37.7
±
0.1 106细胞ml-1
每天。与dp12亲代细胞系的2.1
±
0.0pg细胞-1
每天相比，这降低的ivc导致2.5
±
0.1pg细胞-1
每天的q
p
略有增加。ivc和q
p
补偿的这些差异产生了相似的滴度，分别为157.6
±
3.8mg l-1
(dp12 galmax)和155.6
±
1.5mg l-1
(dp12亲代)。
[0184]
总体而言，表6和表7表明galmax技术对细胞培养kpi没有负面影响——在所有情况下，galmax技术产生的滴度均高于亲代细胞系。
[0185]
galmax与其他技术的比较
[0186]
参考图6和表8。galmax的性能与其他可用技术相当或优于其他可用技术。
[0187]
图6和表8将galmax发明与已开发用于最大化mah fc半乳糖基化的其他技术进行了比较。umg补料是指尿苷-锰-半乳糖细胞培养补充[1,2]，β4galt表达是指β4galt酶的异位表达[19,24,25]，酶促重塑是指mah fc聚糖的体外酶促修饰[4,14]。
[0188]
galmax发明提供了96.2％至97.6％的整体半乳糖基化(分别为dp12和vrc01细胞系)。这些值与通过schulz等人的细胞工程策略以及thomann等人[14]和tayi&butler[4]的体外方法实现的98％总半乳糖基化相当[25]。galmax大大优于raymond等人[19]和chang等人的细胞工程策略[24]，其收益率值分别为73％和87％。galmax的性能也优于umg补料策略，后者报告了48％至67％的总mah fc半乳糖基化[1,2]。
[0189]
galmax发明产生高达80％的双半乳糖基化mah fc聚糖，这与thomann等人[14](体外)获得的83％的值相当。schulz等人[25](细胞工程)以及tayi&butler(体外)获得的mah fc双半乳糖基化水平略高于galmax发明所达到的水平。galmax产生的双半乳糖基化mah fc
聚糖比umg补料[1,2]和其他细胞工程策略[19,24]报道的要大得多。
[0190]
表8比较了galmax与现有技术的性能。
[0191][0192]
cho dp12的补料分批培养
[0193]
参考图7和表9。galmax cho dp12细胞系。这两个细胞工程事件都是必需的，单半乳糖基化和双半乳糖基化水平在分批培养和补料分批培养中保持不变。
[0194]
图7和表9显示了在补料分批模式下培养的来自cho dp12(dp12亲代、dp12 cosmc-、dp12galt+和dp12 galmax)的四种工程化细胞系生产的mab fc上存在的聚糖分布。数据对应于每个细胞系的重复培养物。使用carillo等人(药物分析杂志(journal of pharmaceutical analysis).volume 10,issue 1,2020年2月,第23-34页.https://doi.org/10.1016/j.jpha.2019.ll.008)概述的质谱法测量mah fc糖基化模式。
[0195]
图7a显示，对于分批培养观察到的相同主要糖型也适用于补料分批模式(a2g0f、a2g1f、a2g2f和a2s1g2f)。dp12 cosmc-细胞系产生略微较低的非半乳糖基化糖型a2g0f和较高的单半乳糖基化a2g1f聚糖。双半乳糖基化a2g2f聚糖的比例没有观察到统计学上的显着差异。这些结果表明cosmc敲除有助于增强在补料分批操作下培养的细胞中的产物糖基化。
[0196]
图7a显示，与分批培养一样，表达hβ4galt1的cho dp12呈现出a2g0f的显着降低(从51.4
±
1.2到11.8
±
2.0)和伴随的a2g2f增加(从7.2
±
0.3到57.5
±
8.6)。在cho dp12 galmax细胞系中，a2g0f减少至1.7％
±
0.2％，a2g2f增加至80.0％
±
0.6％。dp12 galmax细胞系产生的a2g0f比dp12 galt+细胞系少7.1
±
1.5倍，因此表明cosmc的敲除显着有助于增加mah半乳糖基化和整体聚糖同质性。
[0197]
图7b比较了四种dp12衍生细胞系在补料分批模式下产生的总非半乳糖基化(man5+a2g0f)和半乳糖基化(a2g1f、a2g2f和a2s1g2f之和)糖型。在dp12亲代和dp12 cosmc-细胞生成的产物的半乳糖基化之间观察到微小差异(分别为47.7％
±
1.2％和50.7％
±
1.4％)。dp12 galt+产生77.1％
±
11.0％半乳糖基化和22.6％
±
8.1％非半乳糖基化mah fc聚糖。dp12 galmax生成91.8％
±
0.3％半乳糖基化聚糖和8.2％
±
0.2％mah fc聚糖。总体而言，与亲本dp12细胞系相比，galmax发明部署在以补料分批模式培养的cho dp12细胞中，半乳糖基化增加1.9倍，非半乳糖基化聚糖减少6.4倍。
[0198]
表9提供了图7a的数值。
[0199][0200]
讨论
[0201]
将所提出的发明与其他细胞糖工程策略区分开来的关键方面是敲除cosmc表达和异位表达β4galt1的组合。
[0202]
敲除cosmc可提供产物β-1,4半乳糖基化所需的额外udp-gal共底物，而无需进行已知会对细胞生长和生产力产生负面影响的额外操作或补料策略。我们小组的计算研究表明，细胞o-连接半乳糖基化是cho细胞中udp-gal消耗的最大汇集-超过30％的udp-gal消耗用于细胞o-连接半乳糖基化[7]。
[0203]
同时过表达βgaltl酶可提供额外的细胞机制来催化将β-1,4半乳糖添加到产物n-连接聚糖中的反应。cho细胞中内源性β4galt的基线水平不足以进行广泛的产物β-1,4半乳糖基化。除此之外，通常观察到的细胞培养条件变化(例如氨积累或ph值变化)可能会对内源性β4galt的活性产生负面影响。因此，异位表达β4galt1提供了额外的机制来实现更高的产物β-1,4半乳糖基化，同时限制了不同细胞培养条件对酶活性的负面影响。
[0204]
β-1,4半乳糖基化最近才被确定为mah产品疗效的关键决定因素。因此，有很大的机会通过最大化这种聚糖基序来增强这些产品的药代动力学和药效学。本发明提出了全新且简便的基因工程策略，可最大化mab的β-1,4半乳糖基化。在生物制药制造的背景下，本发明具有广泛的实施范围，可以迅速促进提高最畅销的药物产品类别的救生药物的安全性和有效性。
[0205]
序列
[0206]
β1,4-半乳糖基转移酶i同种型1氨基酸序列(seq id no：1)》np_001488.2β-1,4-半乳糖基转移酶1同种型1[智人]
[0207][0208]
β1,4-半乳糖基转移酶i dna/编码序列(seq id no：2)
[0209]
》nm_001497.4智人β-l,4-半乳糖基转移酶1(b4galt1)，转录变体l，mrna
[0210]
[0211]
736.
[0239]
25.schulz，m.a.，et al.，glycoengineering design options for igg1 in cho cells using precise gene editing.glycobiology，2018.28(7)：p.542-549.

技术特征：
1.细胞，其中该细胞被修饰为：通过减少细胞中的功能性cosmc分子伴侣和/或通过减少细胞中的功能性t-合酶来减少细胞中的o-galnac半乳糖基化活性；以及在细胞中过表达β1,4-半乳糖基转移酶。2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述修饰包括敲除cosmc分子伴侣或其中抑制来自cosmc分子伴侣基因的翻译。3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述修饰包括敲除细胞中功能性t-合酶或其中抑制来自t合酶基因的翻译。4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞用编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸转化。5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述β1,4-半乳糖基转移酶包括人β4galt1。6.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞选自cho、hek、ns0、sp2/0、per.c6、sf9、very、bh、hela、cos、mdck、293、293t、3t3、wi38、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、crl7030和hs578bst。7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞被修饰以表达多肽产物，其中所述多肽产物是异源多肽。8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞被修饰以表达多肽产物，其中所述多肽产物是一种或多种抗体肽或病毒蛋白。9.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞被修饰以表达多肽产物，其中所述多肽产物包含一种或多种或所有选自以下的治疗剂的肽：德卢替康-曲妥珠单抗([fam-]trastuzumab deruxtecan)、乐利单抗(leronlimab)、纳索利单抗(narsoplimab)、银马泽伯(regneb3)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)、塔法西塔单抗(tafasitamab)、英比利珠单抗(inebilizumab)、沙利珠单抗(satralizumab)、依普奈珠单抗(eptinezumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、替妥木单抗(teprotumumab)、立赞利珠单抗(crizanlizumab)、维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、利散吉珠单抗(risankizumab)、洛莫索珠单抗(romosozumab)、布洛舒单抗(burosumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、依玛鲁单抗(emapalumab)、依帕伐单抗(emapalumab-lzsg)、厄瑞努单抗(erenumab)、瑞玛奈珠单抗(fremanezumab)、伽奈珠单抗(galcanezumab)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、伊巴组单抗(ibalizumab)、伊巴珠单抗(ibalizumab-uiyk)、拉那鲁单抗(lanadelumab)、莫格利组单抗(mogamulizumab、雷夫利珠单抗(ravulizumab(alxn1210))、替曲吉珠单抗(tildrakizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、苯拉组单抗(benralizumab)、布罗达单抗(brodalumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、依米赛珠单抗(emicizumab)、谷瑟库单抗(guselkumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、西鲁库单抗(sarilumab)、阿特利珠单抗(atezolizumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、伊卡组单抗(ixekizumab)、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、阿利苏单抗(alirocumab)、达妥木单抗(daratumumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、依妥组单抗(elotuzumab)、依沃苏单抗(evolocumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、奈妥木单抗
(necitumumab)、司库奴单抗(secukinumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿伦单抗(alemtuzumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)、珀妥珠单抗(pertuzumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、贝利木单抗(belimumab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、伊匹单抗(ipilimumab)、地舒单抗(denosumab)、卡那奴单抗(canakinumab)、戈利木单抗(golimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托珠单抗(tocilizumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、依库珠单抗(eculizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、巴利昔单抗(basiliximab)、英利昔单抗(infliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)以及阿昔单抗(abciximab)。10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞被修饰以表达多肽产物，其中所述多肽产物包含病毒载体例如raav的组分。11.修饰细胞的方法，其中修饰细胞以增强多肽产物的β-1,4半乳糖基化，所述修饰包括：通过减少细胞中的功能性cosmc分子伴侣和/或通过减少细胞中的功能性t-合酶来降低细胞中的o-galnac半乳糖基化活性；以及修饰细胞以在细胞中提供β1,4-半乳糖基转移酶的过表达。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法包括用编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸转化细胞的步骤。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述方法包括修饰编码所述cosmc分子伴侣和/或t-合酶的基因，或修饰其调控元件以敲除其表达。14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括修饰所述细胞以表达多肽产物。15.生产多肽产物的方法，所述方法包括提供根据权利要求1至10中任一项所述的细胞，或获得根据权利要求11至14中任一项所述的修饰细胞，以及培养用于表达多肽产物的细胞。16.根据权利要求15所述的方法，其中产生的多肽产物具有至少80％的β-1,4半乳糖基化和/或至少50％的双半乳糖基化；或者其中产生的所述多肽产物具有至少0.5倍增加的β-1,4半乳糖基化和/或至少0.5倍增加的双半乳糖基化。17.根据权利要求15或16中任一项所述的方法，其中用umg补料策略培养细胞，所述umg补料策略包括或由以下组成：在细胞培养基中添加尿苷、锰和半乳糖。18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中从细胞和/或上清液中收获多肽产物。19.多肽，由根据权利要求1至10中任一项所述的修饰细胞产生，或由根据权利要求15至17中任一项所述的方法产生。20.根据权利要求1至10中任一项所述的修饰细胞在生产多肽产物中的用途。
21.质粒，编码：靶向敲除或减少细胞中功能性cosmc分子伴侣和/或t-合酶表达的遗传修饰元件；用于在细胞中表达的b4galt；以及任选的选择标记，例如抗生素抗性基因。22.试剂盒，包括：-第一质粒，编码：靶向敲除或减少细胞中功能性cosmc分子伴侣和/或t-合酶表达的遗传修饰元件；以及第二个质粒，编码用于在细胞中表达的b4galt和任选的选择标记，例如抗生素抗性基因。23.根据权利要求22所述的试剂盒，还包含编码用于表达的多肽产物的质粒。24.根据权利要求22或23所述的试剂盒，其中遗传修饰元件包含锌指核酸酶、talen(转录激活因子样效应核酸酶)、向导rna(grna)和cas9(用于crispr修饰)、沉默rna或具有抗生素耐药基因的同源重组盒。

技术总结
本发明涉及细胞以及相关的方法、试剂盒和用途，其中该细胞被修饰为：通过减少细胞中的功能性COSMC分子伴侣和/或通过减少细胞中的功能性T-合酶来减少细胞中的O-GalNAc半乳糖基化活性；以及在细胞中过度表达β1,4-半乳糖基转移酶。基转移酶。基转移酶。


技术研发人员：约斯卡尼
受保护的技术使用者：爱尔兰国立都柏林大学
技术研发日：2021.08.10
技术公布日：2023/8/14