一种基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂及其制备方法和用途。


背景技术：

2.组织粘合剂是指能够与体内组织产生相互作用力，由此引发组织间或组织与非组织（如植入体）间的粘合，并且具有控制流血（止血）及阻止气体和液体流动（密封）等功能的一类生物材料。随着现代医学的发展，要求在进行外科手术的过程中，不光要能够最大限度地修复其功能及外观，还要求尽可能低的减少患者的痛苦。目前，在处理较大缺损的组织缺损或出血点的手术中，常采取缝合或者铆钉的方式，其通过物理方法对组织进行拉近及修复，但是其并未取得较好的效果，主要原因有下：缝线及铆钉除了单纯的物理拉近之外，并没有提供伤口愈合、抗炎等额外作用；缝线及铆钉在手术过程中可能会引起周围组织的损伤及出血；伤口愈合后会有疤痕增生且有额外的拆线痛苦。采用医用组织粘合剂可以有效解决这些问题。另外，组织粘合剂的快速止血和伤口粘合功能尤其适合在战时环境下第一时间处置难以缝合的伤情，甚至处置一些止血绷带难以处理的内部创伤；此外，组织粘合剂在对伤口进行快速密封的同时还能起到防止伤口与外界进一步的接触以起到预防感染的效果。据报道，战争中很大一部分战场死亡是在受伤后与到达野战医院这段时间内发生的，如能使用加入止血和镇痛等药物的高效组织粘合剂，将会挽救更多的生命。此外，随着临床医学技术的发展，微创技术已经在临床各科广泛开展，但由于微创手术的创口小，视野和操作性有限，在操作中难以使用上述传统的创伤组织机械固定技术。因此，组织粘合剂在外科手术、整形美容、战场救护等方面有着极为广泛的应用前景。
3.然而，实现理想的组织界面黏附具有很大的挑战性，主要原因有二：一方面，组织表面有大量的液体存在，使得大量的粘合剂无法突破水化层与组织界面产生有效的分子间作用力，从而使粘合剂的黏附性能大打折扣；另一方面，组织的柔软特性导致其对粘合剂的顺应性要求极高，即，要求粘合剂可随组织活动进行适应性形变及调整，生物相容性同时也是需要十分重视的点，因此，这对粘合剂的黏附特性及成分组成均有极高的要求，大大增加了超强组织粘合剂的开发难度。
4.基于以上研究现状，基于生物工程蛋白的瞬时原位粘合剂的研发对于基础科研以及生物医学应用有着十分重要的意义。


技术实现要素：

5.发明目的本发明的目的在于提供一种粘合性能优异的、基于生物工程蛋白的双组分瞬时原位粘合剂及其制备方法和用途。
解决方案
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：第一方面，本发明提供了一种基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂，其包括：（1）富含氨基官能团的类弹性蛋白，和（2）含琥珀酰亚胺基的化合物。
7.作为优选，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含n个[(vpgkg)9]重复单元，每两个[(vpgkg)9]重复单元之间通过间隔物(vpgxg)间隔；其中，n为3～18之间的整数，x为除脯氨酸外的任意天然氨基酸；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为选自以下的任意一种或几种：双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss），琥珀酰亚胺基乙酸酯，二硫双琥珀酰亚胺丙酸酯。
[0008]
进一步优选地，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白中，重复单元[(vpgkg)9]的个数n为8～18之间的整数，并且/或者，所述间隔物(vpgxg)中，x为缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss）。
[0009]
在具体实施方案中，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss），其中聚乙二醇的平均相对分子量在2000-10000之间。
[0010]
在优选的具体实施方案中，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss），其中聚乙二醇的平均相对分子量在5000-10000之间。
[0011]
seq id no:1vpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg；其中，下划线部分为重复单元[(vpgkg)9]，粗体部分为间隔物(vpgxg)；seq id no:2vpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgagvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg；其中，下划线部分为重复单元[(vpgkg)9]，粗体部分为间隔物(vpgxg)；seq id no:3vpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgrgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg；其中，下划线部分为重复单元[(vpgkg)9]，粗体部分为间隔物(vpgxg)；
seq id no:4vpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgagvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgrgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpglgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgigvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgagvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg；其中，下划线部分为重复单元[(vpgkg)9]，粗体部分为间隔物(vpgxg)。
[0012]
seq id no:5vpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgagvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpglgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgrgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgigvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgagvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg；其中，下划线部分为重复单元[(vpgkg)9]，粗体部分为间隔物(vpgxg)。
[0013]
在具体实施方案中，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白以水溶液形式、单独存在，所述含琥珀酰亚胺基的化合物以固体粉末形式存在，在使用时，将所述含琥珀酰亚胺基的化合物用超纯水溶解，之后将其与类弹性蛋白水溶液进行混合，然后发生凝胶化，形成原位粘附层。
[0014]
作为优选，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在50~650mg/ml，优选在200~400mg/ml之间，更优选为200mg/ml；作为优选，使用时，所述含琥珀酰亚胺基的化合物被配制为质量体积浓度为0.5~1.5g/ml、优选为0.5~1.0g/ml、最优选0.75g/ml的水溶液；作为优选，使用时，所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液与所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液按体积比1：(0.5～2.0)、优选1：1进行混合；作为优选，将两种溶液混合后，所述凝胶化时间为0～120s。
[0015]
第二方面，本发明提供了如上述第一方面所述的双组分原位粘合剂的制备方法，
其包括如下步骤：1）将所述富含氨基官能团的类弹性蛋白与水混合，制备所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液；2）将所述含琥珀酰亚胺基的化合物溶于水中，制备所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液；以及任选地，3）将步骤1）所制备的所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液和步骤2）所制备的所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液分别封装入双组分注射器中。
[0016]
作为优选，步骤1）中所制备的所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在50~650mg/ml，优选在200~400mg/ml之间，更优选为200mg/ml；作为优选，步骤2）中所制备的所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液的质量体积浓度在0.5~1.5g/ml、优选为0.5~1.0g/ml、最优选0.75g/ml。
[0017]
第三方面，本发明提供了如上述第一方面所述的双组分原位粘合剂在制备用于组织或器官创口止血、修复和/或再生的药物中的应用；优选地，所述组织为半月板组织、肌肉组织、肌腱组织、骨组织、结缔组织、表皮组织或粘膜组织中的至少一种；优选地，所述器官为皮肤、心脏、肝脏、肾脏、脑或血管中的至少一种；优选地，所述修复为促进损伤部位的封闭、细胞粘附、增殖或分化中的至少一种；进一步优选地，所述药物用于血管重建封堵辅助止血或颅脑缝合部位辅助缝合；进一步优选地，所述药物用于表皮粘合或脑内粘合。
有益效果
[0018]
本发明提供的基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂可在组织伤口表面原位涂覆，其利用富含氨基官能团的类弹性蛋白上的氨基与含琥珀酰亚胺基的化合物的活性琥珀酰亚胺之间的常温edc-nhs反应，同时生物组织蛋白上的氨基也与活性琥珀酰亚胺快速发生edc-nhs反应（见以下反应式i），实现了在组织伤口处的原位、快速凝胶化，展现出优异的组织间粘合强度，并且，即使在潮湿组织表面也能表现出优异的粘合性能；反应式i凝胶化后，其胶面柔软，可用于实现潮湿创口止血、伤口修复等功效，例如用于血管重建封堵辅助止血、颅脑缝合部位辅助缝合等；同时，本发明的双组分原位粘合剂还具有制备过程简单、快速，无需特殊设备，以及快速粘附性和生物相容性等方面的优势，可作为新一代便携式瞬时生物医用胶水，在伤口急性出血，复杂创面处理等情况中有巨大的应用前景。
附图说明
[0019]
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说
明并不构成对实施例的限定。在这里，专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。在这里，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0020]
图1显示了实施例1中制备的双组分原位粘合剂在去脂猪皮上的粘合力学曲线；其中，横坐标显示的是粘合剂拉伸长度（即，位移，单位为mm），纵坐标显示的是搭接剪切强度（单位为kpa）；图2显示了实施例2中制备的含不同分子量的peg的ss-peg-ss与基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白形成的双组分粘合剂固化后的形态；其中，ab1为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为1000）的双组分原位粘合剂，ab2为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为2000）的双组分原位粘合剂，ab3为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，ab4为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为10000）的双组分原位粘合剂。
[0021]
图3显示了实施例1、实施例3中制备的五种双组分原位粘合剂在去脂猪皮上的粘合强度；其中，横坐标显示的是双组分原位粘合剂的类型，其中，a1b为基于如seq id no：1所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，a2b为基于如seq id no：2所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，a3b为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，a4b为基于如seq id no：4所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂；a5b为基于如seq id no：5所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂；纵坐标显示的是搭接剪切强度（单位为kpa）。
具体实施方式
[0022]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0024]
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0025]
以下，对本发明进行详述。
[0026]
一方面，本发明提供了一种基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂，其包含富含氨基官能团的类弹性蛋白和含琥珀酰亚胺基的化合物。
[0027]
作为优选，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白是以(vpgkg)9为基本重复单元的工程表达蛋白，每两个重复单元之间通过(vpgxg)间隔，重复单元的数目n在3～18之间，优选
在8～18之间，并且间隔物(vpgxg)中的x为除脯氨酸外的任意天然氨基酸。
[0028]
在优选的具体实施方案中，间隔物(vpgxg)中，x为缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或精氨酸。
[0029]
在优选的具体实施方案中，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含选自以下的氨基酸序列或者由其组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5。
[0030]
作为优选，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为选自以下的任意一种或几种：双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss），琥珀酰亚胺基乙酸酯，二硫双琥珀酰亚胺丙酸酯，更优选为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss），进一步优选地，所述ss-peg-ss中，peg的平均相对分子量在2000-10000之间、优选在5000-10000之间。
[0031]
另一方面，本发明提供了如上所述基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂的制备方法，其包括以下步骤：1）将所述富含氨基官能团的类弹性蛋白与水混合，制备所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液；优选地，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在50~650mg/ml，优选在200~400mg/ml之间，更优选为200mg/ml；2）将所述含琥珀酰亚胺基的化合物溶于水中，制备所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液；优选地，所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液的质量体积浓度在0.5~1.5g/ml，优选为0.5-1.0g/ml，更优选为0.75g/ml；以及任选地，3）将步骤1）所制备的所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液和步骤2）所制备的所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液分别封装入双组分注射器中。
[0032]
另外，本发明提供了如上所述的双组分原位粘合剂在制备用于组织创口止血、修复和/或再生的药物中的应用。例如，所述药物用于血管重建封堵辅助止血或颅脑缝合部位辅助缝合。
[0033]
下面通过实施例来进一步说明本发明；以下实施例中，除非特别说明，所使用的生物、化学材料均为市售产品；所用类弹性蛋白可通过本领域技术人员已知的任何合适技术制备而成。
[0034]
以下实施例中，所使用的富含氨基官能团的类弹性蛋白均由北京镧系生物技术有限公司合成获得；所使用的含不同分子量peg的ss-peg-ss均购自西安凯新生物有限公司；所使用的生物组织均为发明人由商购的实验动物上通过常规分离方法自行分离获得；所使用猪肠衣（商品名：“皮小贱天然猪肠衣”，购自深圳市品粤品食品有限公司）为发明人通过商购方式获得。
实施例1
[0035]
1）将200mg富含氨基官能团的类弹性蛋白加入至1ml超纯水中，混合均匀，得到均相的200mg/ml蛋白溶液，记为a组分溶液（即，类弹性蛋白溶液）；所述类弹性蛋白具有如seq id no：3所示氨基酸序列；2）称取1g双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇（ss-peg-ss）粉末（其中peg的平均相对分子量为5000），加入至1ml超纯水中，混合均匀，得到b组分溶液（即，ss-peg-ss溶液）；3）将a组分溶液和b组分溶液分别封装入双组分注射器，即得本发明所述双组分原
位粘合剂a3b。
[0036]
使用时，将a、b组分溶液依次涂布在猪皮、猪肉、猪肝、猪心软组织样品表面，混匀后，快速用同类型底片搭接至胶面，凝胶化2s，形成原位粘附层；其中，类弹性蛋白溶液与ss-peg-ss溶液的体积比为1:1。
[0037]
利用shimadzu slbl-500n拉力机，采用剪切粘合强度，对粘合剂的粘附性能进行评估，以表征粘合剂在去脂猪皮、猪肉、猪肝、猪心软组织样品上的粘合强度。
[0038]
图1为本实施例中制备的粘合剂在去脂猪皮软组织样品上的粘合力学曲线，其中，3条曲线分别来自3次平行实验，其制备、测试过程均一致。图1显示：基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss的本发明双组分原位粘合剂测试所得粘合强度为53.54
±
7.47kpa；该结果表明：基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss的本发明双组分原位粘合剂在生物表皮组织上具有良好的粘合性能。
实施例2
[0039]
本实施例中，通过下述步骤，制备三种本发明的双组分原位粘合剂：ab1、ab2、ab3和ab4，其中：ab1为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss溶液（其中peg的平均相对分子量为1000）的双组分原位粘合剂；ab2为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss溶液（其中peg的平均相对分子量为2000）的双组分原位粘合剂；ab3为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss溶液（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂；ab4为基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss溶液（其中peg的平均相对分子量为10000）的双组分原位粘合剂；制备方法为：将具有如seq id no：3所示氨基酸序列的类弹性蛋白200mg加入至1ml超纯水中，混合均匀，得到均相的200mg/ml蛋白溶液a组分溶液；将含不同分子量peg的ss-peg-ss溶液配置为750mg/ml水溶液，制备为b组分溶液。将a、b组分溶液灌装于双组分注射器的两个推注器中，形成预充式双组分胶水。
[0040]
使用时，a、b组分溶液以1：1的体积比推注到原位，形成双组分胶。
[0041]
观察ab1、ab2、ab3、ab4成胶过程中，其固化时间、形态（见图2），并检测破裂强度（见表1）。
[0042]
破裂强度检测方法：将猪肠衣适当处理（包括：清洗肠衣以去掉多余的盐以及用水浸泡以使其保持弹性）后，安装到破裂工装上，检测密封性良好后，在工装中心位置穿透直径0.5mm孔洞，模拟组织泄露点。将ab1、ab2、ab3、ab4双组分胶水推注于破裂工装上的肠衣膜上，封闭破裂位点，推注总体积为1ml。推注结束后开始计时，直到双组分瞬时粘合剂完全固化结束，所用时间计为该双组分瞬时粘合剂的固化时间。向密封的工装中推注空气，气体通过压力表传入工装内部，当贴附在肠衣上的固化后的粘合剂无法耐受增加的气压，则会被肠衣上穿孔处泄露气体，压力表读数瞬时降低；记录压力表的最高读数计为该配比双组分瞬时原位粘合剂的破裂强度。
[0043]
表1含不同分子量peg的ss-peg-ss溶液与类弹性蛋白形成胶水的形态、固化时间
与破裂强度：
ab1ab2ab3ab4固化时间不固化约5min约90s约30s破裂强度20kpa5kpa30kpa35kpa形态0.5h后形成液体胶水固态胶状、有弹性、很柔软固态胶状、有弹性、柔软固态胶状、有弹性、较柔软
。
[0044]
图2为本实施例中制备的含不同分子量peg的ss-peg-ss粘合剂完全成胶后从破裂工装上剥离下来的形态。图2结果显示，含不同分子量peg的ss-peg-ss对粘合剂的破裂强度的影响不同：peg分子量越高，固化速度越快、破裂强度越强、胶体越硬。考虑到当双组分胶水施用于体内时，较高的胶体硬度会增加不适感，故并非双组分胶破裂强度越强、胶体越硬越好；同时，在体内施用双组分胶水时，合适的固化时间（例如，5s~2min）是必要的，使得既便于医生操作，也规避了错误涂抹后无法快速去除胶体。
[0045]
均衡以上考虑及结果：用其中peg的平均相对分子量为2000、5000、10000的ss-peg-ss（特别是后两者）配制的本发明粘合剂在潮湿生物组织上均具有较好的综合性能，依照使用途径、作用部位可选取不同组合。
实施例3
[0046]
本实施例中，通过下述步骤，制备四种本发明的双组分原位粘合剂：a1b、a2b、a4b和a5b，其中，a1b为基于如seq id no：1所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，a2b为基于如seq id no：2所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，a4b为基于如seq id no：4所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂，a5b为基于如seq id no：5所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的双组分原位粘合剂：1）分别将如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：5所示的四种富含氨基官能团的类弹性蛋白各200mg加入至1ml超纯水中，混合均匀，得到均相的200mg/ml蛋白溶液，分别记为a1、a2、a4、a5组分溶液；2）称取1g双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇粉末，加入至1ml超纯水中，混合均匀，得到b组分溶液；3）将a1组分溶液、或a2组分溶液、或a4组分溶液、或a5组分溶液和b组分溶液分别封装入双组分注射器，即得本发明所述双组分瞬时原位粘合剂a1b、a2b、a4b、a5b。
[0047]
使用时，分别将a1、b或a2、b或a4、b或a5、b组分溶液依次涂布在去脂猪皮软组织样品表面，混匀后，快速用同类型底片搭接至胶面，凝胶化2s，形成原位粘附层；其中，富含氨基官能团的类弹性蛋白溶液与ss-peg-ss溶液的体积比为1:1。
[0048]
将本实施例制备的四种双组分瞬时原位粘合剂a1b、a2b、a4b、a5b分别在去脂猪皮组织上进行搭接粘合，并进行拉伸测试（方法同实施例1），其结果以及实施例1所制备的双组分瞬时原位粘合剂a3b的测试结果如图3所示，图3显示：基于如seq id no：1所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的本发明双组分原位粘合剂a1b所测得粘合强度21.24
±
2.97kpa，基于如seq id no：2所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的本发明双组分原位粘合剂a2b所测得粘合强度31.91
±
3.05kpa，基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的本发明双组分原位粘合剂a3b所测得粘合强度53.54
±
7.47kpa（即，实施例1中所测试的粘合强度），基于如seq id no：4所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的本发明双组分原位粘合剂a4b所测得粘合强度51.49
±
3.86kpa，基于如seq id no：5所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss（其中peg的平均相对分子量为5000）的本发明双组分原位粘合剂a5b所测得粘合强度50.22
±
1.81kpa。
[0049]
上述结果表明：基于如seq id no：1或seq id no 2或seq id no 3或seq id no 4或seq id no：5所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss的本发明双组分原位粘合剂在潮湿生物组织上都具有良好的粘合性能，均可满足临床中的组织粘合需求，可针对不同组织粘合要求提供多样化的解决方案。其中，基于如seq id no：3或seq id no 4或seq id no：5所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss的本发明双组分原位粘合剂的粘合性能较高，尤以基于如seq id no：3所示的类弹性蛋白和ss-peg-ss的本发明双组分原位粘合剂a3b粘合性能最佳；当序列长度大于seq id no：3所示序列时，粘合强度不会快速增加（a3b、a4b、a5b粘合强度差不多），但蛋白表达效率降低，故序列seq id no：3为较优的类弹性蛋白序列。
[0050]
以上实施例说明，本发明的双组分瞬时原位粘合剂可在潮湿生物组织表面实现原位、快速凝胶化，表现出优异的粘合性能，可用于实现潮湿创口止血、伤口修复等功效，例如用于血管重建封堵辅助止血、颅脑缝合部位辅助缝合等。
[0051]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂，其包括：（1）富含氨基官能团的类弹性蛋白，和（2）含琥珀酰亚胺基的化合物。2.根据权利要求1所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含n个[(vpgkg)9]重复单元，每两个[(vpgkg)9]重复单元之间通过间隔物(vpgxg)间隔；其中，n为3～18之间的整数，x为除脯氨酸外的任意天然氨基酸；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为选自以下的任意一种或几种：双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，琥珀酰亚胺基乙酸酯，二硫双琥珀酰亚胺丙酸酯。3.根据权利要求2所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白中，重复单元[(vpgkg)9]的个数n为8～18之间的整数，并且/或者，所述间隔物(vpgxg)中，x为缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇。4.根据权利要求3所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，其中聚乙二醇的平均相对分子量为2000-10000。5.根据权利要求4所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物为双琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇，其中聚乙二醇的平均相对分子量为5000-10000。6.根据权利要求1~5任一项所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白以水溶液形式、单独存在，所述含琥珀酰亚胺基的化合物以固体粉末形式存在，在使用时，将所述含琥珀酰亚胺基的化合物用超纯水溶解，之后将其与类弹性蛋白水溶液进行混合，然后发生凝胶化，形成原位粘附层。7.根据权利要求6所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在50~650mg/ml；和/或，使用时，所述含琥珀酰亚胺基的化合物被配制为质量体积浓度为0.5~1.5g/ml的水溶液；和/或，使用时，所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液与所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液按体积比1：(0.5～2.0)进行混合；和/或，所述凝胶化时间为0～120s。8.根据权利要求7所述的双组分原位粘合剂，其特征在于，所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在200~400mg/ml之间；和/或，所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液的质量体积浓度在0.5~1.0g/ml；和/或，使用时，所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液与所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液按体积比1：1进行混合。9.根据权利要求1~8任一项所述的双组分原位粘合剂的制备方法，其包括如下步骤：
1）将所述富含氨基官能团的类弹性蛋白与水混合，制备所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液；2）将所述含琥珀酰亚胺基的化合物溶于水中，制备所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液；以及任选地，3）将步骤1）所制备的所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液和步骤2）所制备的所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液分别封装入双组分注射器中。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所制备的所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在50~650mg/ml；和/或，步骤2）中所制备的所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液的质量体积浓度在0.5~1.5g/ml。11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所制备的所述富含氨基官能团的类弹性蛋白的水溶液的质量体积浓度在200~400mg/ml；和/或，步骤2）中所制备的所述含琥珀酰亚胺基的化合物的水溶液的质量体积浓度在0.5~1.0g/ml。12.根据权利要求1~8任一项所述的双组分原位粘合剂在制备用于组织或器官创口止血、修复和/或再生的药物中的应用。13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述组织为半月板组织、肌肉组织、肌腱组织、骨组织、结缔组织、表皮组织或粘膜组织中的至少一种；和/或，所述器官为皮肤、心脏、肝脏、肾脏、脑或血管中的至少一种；和/或，所述修复为促进损伤部位的封闭、细胞粘附、增殖或分化中的至少一种。

技术总结
本发明提供了一种基于超电荷蛋白的双组分原位粘合剂及其制备方法和用途。本发明的双组分原位粘合剂可在组织伤口处进行原位、快速凝胶化，展现出优异的组织间粘合强度，并且，即使在潮湿组织表面也能表现出优异的粘合性能；凝胶化后，其胶面柔软，可用于实现潮湿创口止血、伤口修复等功效，例如用于血管重建封堵辅助止血、颅脑缝合部位辅助缝合等；同时，本发明的粘合剂还具有制备简单、快速，无需特殊设备，以及快速粘附性和生物相容性等方面的优势，可作为新一代便携式瞬时生物医用胶水，在伤口急性出血，复杂创面处理等情况中有巨大的应用前景。景。


技术研发人员：孙瑶 张娜娜 俞强
受保护的技术使用者：北京镧系生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/14