一种基于LAMP-CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法

一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法。


背景技术：

2.猪圆环病毒(porcine circovirus,pcv)为圆环病毒科成员。pcv1是1974年从猪肾上皮细胞(pk-15)中分离出来的非致病性病毒粒子。pcv2为引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated diseases,pcvad)的主要病原，具有较强的致病性，可致宿主机体的免疫抑制，造成免疫功能低下，临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍和呼吸及消化系统疾病。2016年10月，美国堪萨斯州立大学的palinski r等借助宏基因组测序技术从患病母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出pcv3，证实美国多个州猪群存在pcv3感染。随后,波兰、意大利、韩国等国家相继检测出pcv3。虽然目前关于pcv3致病作用的证据较为匮乏,但普遍认为与pdns、繁殖障碍和多系统炎症存在潜在关联。2019年4月,在中国湖南省的几只临床疾病严重的猪身上发现了一种与其他圆环病毒有明显亲缘关系的新型圆环病毒，并命名为pcv4。
3.pcv2引起的综合征给养猪业造成了巨大损失，因此有必要开发一种临床简便检测pcv2的有效方法来预防这些疾病。目前已经开发了许多检测这种病毒的方法，但大都需要专业设备和人员才可进行检测，缺乏偏远地区临床检测的机动性，因此仍然需要一种快速、灵敏和易于操作的方法，特别是对于pcv2的检查。


技术实现要素：

4.1.要解决的技术问题
5.本发明的目的是为了解决现有技术中pcv2引起的综合征给养猪业造成了巨大损失的问题，而提出的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法。
6.2.技术方案
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，包括以下操作步骤：
9.步骤1：组织样品的处理
10.将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；
11.步骤2：病毒dna的提取
12.步骤3：引物设计
13.在genbank中检索多株猪圆环病毒2型全基因组序列，通过meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段orf2基因，使用primer premier 5软件，设计
orf2基因的全长引物；以高度保守片段orf2基因，运用在线生物网站primerexplorer v5(https://primerexplorer.jp/)设计4条计特异性的lamp扩增引物；猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段orf2基因，使用crispr-dt引物设计网站设计猪圆环病毒2型orf2基因的crrna引物和探针，并委托某生物有限公司合成；
14.根据genbank中检索的多株猪圆环病毒2型参考序列使用primer premier 5软件设计orf2基因引物，进行pcr扩增，pcr体系为50μl，其中mix 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板3μl，灭菌水20μl；
15.步骤4：pcr产物回收及纯化
16.根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用，置于-20℃保存；
17.步骤5：标准质粒的构建
18.根据某公司的pmdtm19t vector cloning kit使用说明书，构pmd
tm
18t-orf2重组质粒；
19.步骤6：重组质粒鉴定
20.取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与cap基因全长进行比对分析；
21.步骤7：质粒dna小量抽提
22.根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd
tm
18-orf2重组质粒备用；
23.步骤8：lamp引物筛选
24.根据lamp核酸扩增试剂盒说明扩增猪圆环2型，筛选出最佳lamp引物；
25.步骤9：猪圆环病毒2型lamp-crispr/cas12a检测体系建立
26.最佳浓度筛选：设置lbcas12a蛋白浓度分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm，设置crrna浓度设置分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm进行正交试验，筛选出最佳的反应浓度比
27.crrna筛选：对设计的五对猪圆环病毒2型crrna引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；
28.灵敏度试验；
29.特异性试验；
30.重复性检验：选择105～103copies/μl的稀释质粒，利用已确定的最佳检测体系进行3次重复，并于不同时间点再重复检测，以确定该方法的重复性；
31.临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，与lamp基础型核酸扩增试剂相结合，使用primer premier 5软件，设计cap基因的era引物，采用本研究建立的crispr cas12a方法对15份样本进行pcv4的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价crispr技术的临床应用的实用价值。
32.3.有益效果
33.相比于现有技术，本发明的优点在于：
34.本发明中，在crispr技术的基础上与lamp技术相结合，建立了pcv2的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要
复杂的仪器设备、对于冷链运输和非专业人员，即使在偏远地区也能对疫病进行实时监测，为pcv2的流行病学的调查，掌握传播规律以及疫病的防控提供技术支持。
附图说明
35.图1为本发明中提出的pcv2 orf2引物表；
36.图2为本发明中提出的pcv2 lamp引物表；
37.图3为本发明中提出的pcv2 crrna引物表；
38.图4为本发明中提出的探针序列表；
39.图5为本发明中提出的目的片段的pcr扩增程序表；
40.图6为本发明中提出的lamp扩增体系；
41.图7为本发明中提出的反应体系优化中的反应体系表；
42.图8为本发明中提出的pmd18-t-orf2质粒基因pcr扩增结果；
43.图9为本发明中提出的lamp引物筛选图；
44.图10为本发明中提出的lamp-crispr/cas12a反应浓度优化；
45.图11为本发明中提出的lamp-crispr/cas12a crrna引物筛选图；
46.图12为本发明中提出的灵敏度分析图；
47.图13为本发明中提出的特异性分析图；
48.图14为本发明中提出的重复性分析图；
49.图15为本发明中提出的猪圆环病毒2型的临床样本检测示意图。
具体实施方式
50.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
51.实施例1：
52.参照图1-15，一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，包括以下操作步骤：
53.(1)组织样品的处理
54.将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；
55.(2)病毒dna的提取
56.步骤如下：
57.s1、用移液器将20ul proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；
58.s2、向离心管中加入200ul血清；
59.s3、加入200ulcarrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；
60.s4、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
61.s5、加入500ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀；
62.s6、在室温下15～25℃放置5min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
63.s7、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2，盖上管
盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
64.s8、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
65.s9、小心打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
66.s10、重复步骤9；
67.s11、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；
68.s12、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；
69.s13、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20～150ul rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min，置于-20℃保存。
70.(3)引物设计
71.在genbank中检索多株猪圆环病毒2型全基因组序列，通过meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒4型全基因组中高度保守片段orf2基因，使用primer premier 5软件，设计orf2基因的全长引物，针对猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段orf2基因，使用crispr-dt(http://bioinfolab.miamioh.edu/crispr-dt/interface/cpf1_main.php)引物设计软件设计猪圆环病毒2型orf2基因的crrna引物和探针，并委托某生物公司合成，如图3和图4所示；
72.根据genbank中检索的多株猪圆环病毒2型参考序列使用primer premier 5软件设计orf2基因的全长引物，如图1所示，进行pcr扩增，pcr体系为50μl，其中mix25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板3μl，灭菌水20μl，反应程序见图5。
73.以高度保守片段orf2基因，运用在线生物网站primerexplorer v5(https://primerexplorer.jp/)设计4条计特异性的lamp扩增引物，如图2所示，并委托某生物公司合成；
74.(4)pcr产物回收及纯化
75.根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用,置于-20℃保存；
76.(5)标准质粒的构建
77.根据某公司的pmd
tm
18t vector cloning kit使用说明书，构建pmd
tm
18t-orf2重组质粒；
78.(6)重组质粒鉴定
79.取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与cap基因全长进行比对分析；
80.(7)质粒dna小量抽提
81.根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd
tm
18-t-orf2重组质粒备用；
82.(8)lamp引物筛选
83.s1、按照图6反应体系制备引物混合物和体系预混液，充分震荡混匀并短暂离心；
84.s2、对于每份样本，将12μl预混液转移至每管基础扩增试剂中，振荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心；
85.s3、对于每份样本，最后在反应管中加上8μl目的基因，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心；
86.s4、将反应管放入恒温仪65℃中孵育60min
87.s5、反应产物进行核酸凝胶电泳，筛选出最佳lamp引物。
88.(9)猪圆环病毒2型lamp-crispr/cas12a检测体系建立
89.最佳浓度筛选：设置lbcas12a蛋白浓度分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm，设置crrna浓度设置分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm进行正交试验，筛选出最佳反应浓度比，用于后续试验，反应体系见图7；
90.crrna筛选：对设计的5条猪圆环病毒2型crrna进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；
91.灵敏度试验：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释orf2基因重组质粒(pmd18-t-orf2)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl、108copies/μl、并使用灭菌水作为实验的阴性对照。
[0092]
特异性试验：使用pcv3、asfv、prv、csfv为对照，阳性和阴性对照分别使用阳性样本和ddh2o，进行特异性试验，验证lamp-crispr/cas12a方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。
[0093]
重复性检测：选择105～103copies/μl的稀释具有pcv2 orf2序列的质粒，利用已知的最优检测体系进行3次重复检测，设立无酶水为阴性对照。并于第二天，第三天分别再次重复检测，检测反应体系的重复性。
[0094]
临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，与lamp基础型核酸扩增试剂相结合，使用primer premier 5软件，设计orf2基因的lamp引物(图2所示)，反应体系见图6，采用本研究建立的lamp-crispr/cas12a方法对20份样本进行pcv2的检测，同时，使用pcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价crispr技术的临床应用的实用价值；
[0095]
(10)实验结果
[0096]
基因重组质粒构建
[0097]
pmd
tm
19t-pcv2-orf2基因重组质粒构建，提取待检测样本的核酸在pcr扩增之后，针对扩增的片段使用1％的琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定结果如图8所示。与预期相符的目的基因片段在蓝光切胶仪的辅助下切取目的条带，进行胶回收实验，并与pmd18-t载体连接，转化到jm109中；
[0098]
重组质粒鉴定测序，将构建的质粒送到北京某生物科技有限公司进行测序，测序结果在ncbi的blast网站、genbank基因库和meglign软件的辅助下进行序列比对，结果显示，测序结果与所需目的基因片段的对应率达到100％，表明目的基因重组质粒构建合格，无变异，可作为阳性对照使用；
[0099]
lamp引物筛选
[0100]
使用lamp扩增试剂盒验证合成的引物是否成功，将dna模板与引物按试剂盒说明书添加，增加无酶水作为阴性对照，配置完成后的体系放置于金属浴中，65℃保温60min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果可以看见第3泳道有明显的瀑布状梯形条带，说明第3条引物可成功扩增出pcv2，如图9所示。
[0101]
猪圆环病毒2型lamp-crispr/cas12a检测体系优化
[0102]
最佳浓度筛选：设置lbcas12a蛋白浓度分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm，设置crrna浓度设置分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm进行正交试验，筛选出cas12a蛋白与crrna最佳反应浓度比2:3，用于后续试验，如图10所示
[0103]
crrna引物筛选：使用crispr-dt
[0104]
(http://bioinfolab.miamioh.edu/crispr-dt/
[0105]
interface/cpf1_main.php)引物设计软件设计猪圆环病毒2型orf2基因的crrna引物5条以及一条荧光探针，对设计的三对引物进行筛选，经过筛选第3对引物最优，并用于后续试验。如图11所示；
[0106]
猪圆环病毒2型的灵敏度实验
[0107]
猪圆环病毒2型orf2基因菌液在lb培养液中过夜培养，使用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒后，以10倍的稀释倍数对提取的重组质粒进行稀释，在紫外等下观察，lamp-crispr/cas12a技术荧光结果显示检测猪圆环病毒2型的灵敏度达到了8
×
100copies/μl。如图12所示。
[0108]
猪圆环病毒2型的特异性实验
[0109]
使用pcv3、asfv、prv、csfv为对照，阳性和阴性对照分别使用阳性样本和ddh2o，进行特异性试验，pcv3、asfv、prv、csfv在紫外灯下不发光，阳性对照明显发绿光，阴性对照没有变化。如图13所示。
[0110]
猪圆环病毒2型的重复性检测
[0111]
选择105～103copies/μl的稀释具有pcv2 orf2序列的质粒，利用已知的最优检测体系进行3次重复检测，设立无酶水为阴性对照。并于第二天，第三天分别再次重复检测，检测反应体系的重复性。结果显示批内的重复性小于5％，批间重复性小于10％，重复性良好，如图14所示。
[0112]
猪圆环病毒4型的临床样本检测
[0113]
采用本研究建立的lamp-crispr/cas12a方法对20份样本进行pcv2的检测，同时，使用pcr技术检测方法平行检测，两者的检出率一致，lamp-crispr/cas12a技术具有临床应用价值，如图15所示。
[0114]
本发明中，在crispr技术的基础上与lamp技术相结合，建立了pcv2的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂的仪器设备、对于冷链运输和非专业人员，即使在偏远地区也能对疫病进行实时监测，为pcv2的流行病学的调查，掌握传播规律以及疫病的防控提供技术支持。
[0115]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：步骤1：组织样品的处理，将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；步骤2：病毒dna的提取；步骤3：引物设计，在genbank中检索多株猪圆环病毒2型全基因组序列，通过meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段orf2基因，使用primer premier 5软件，设计orf2基因的全长引物；以高度保守片段orf2基因，运用在线生物网站primerexplorer v5(https://primerexplorer.jp/)设计4条计特异性的lamp扩增引物；猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段orf2基因，使用crispr-dt引物设计网站设计猪圆环病毒2型orf2基因的crrna引物和探针，并委托某生物有限公司合成；步骤4：pcr产物回收及纯化，根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用，置于-20℃保存；步骤5：标准质粒的构建，根据某公司的pmdtm19t vector cloning kit使用说明书，构pmd
tm
18t-orf2重组质粒；步骤6：重组质粒鉴定，取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与cap基因全长进行比对分析；步骤7：质粒dna小量抽提，根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmd
tm
18-orf2重组质粒备用；步骤8：lamp引物筛选，根据lamp核酸扩增试剂盒说明扩增猪圆环2型，筛选出最佳lamp引物；步骤9：猪圆环病毒2型lamp-crispr/cas12a检测体系建立；最佳浓度筛选：设置lbcas12a蛋白浓度分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm，设置crrna浓度设置分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm进行正交试验，筛选出最佳的反应浓度比crrna筛选：对设计的五对猪圆环病毒2型crrna引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；灵敏度试验；特异性试验；重复性检验：选择105～103copies/μl的稀释质粒，利用已确定的最佳检测体系进行3次重复，并于不同时间点再重复检测，以确定该方法的重复性；临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，与lamp基础型核酸扩增试剂相结合，使用primer premier 5软件，设计cap基因的era引物，采用本研究建立的crispr cas12a方法对15份样本进行pcv4的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价crispr技术的临床应用的实用价值。2.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述病毒dna的提取包括以下操作步骤：s1、用移液器将20ul proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；s2、向离心管中加入200ul血清；
s3、加入200ulcarrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；s4、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；s5、加入500ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀；s6、在室温下15～25℃放置5min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；s7、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s8、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s9、小心打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；s10、重复步骤9；s11、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；s12、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；s13、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～70ul rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min，置于-20℃保存。3.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述基因重组质粒构建具体包括以下操作步骤：pmd
tm-18t-pcv2-orf2基因重组质粒构建，提取待检测样本的核酸在pcr扩增之后，针对扩增的片段使用1％的琼脂糖凝胶电泳验证，与预期相符的目的基因片段在蓝光切胶仪的辅助下切取目的条带，进行胶回收实验，并与pmd
tm
18-t载体连接，转化到jm109中；重组质粒鉴定测序，将构建的质粒送到南京某生物科技有限公司进行测序，测序结果在ncbi的blast网站、genbank基因库和meglign软件的辅助下进行序列比对，结果显示，测序结果与所需目的基因片段的对应率达到100％，表明目的基因重组质粒构建合格，无变异，可作为阳性对照使用。4.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述lamp引物筛选详细试验方案如下：s1、按照反应体系制备引物混合物和体系预混液，充分震荡混匀并短暂离心；s2、对于每份样本，将12μl预混液转移至每管基础扩增试剂中，振荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心；s3、对于每份样本，最后在反应管中加上8μl目的基因，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心；s4、将反应管放入恒温仪65℃中孵育60分钟；s5、反应产物进行核酸凝胶电泳，筛选出最佳lamp引物。5.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述lamp-crispr/cas12a体系建立操作步骤：最佳浓度筛选：设置lbcas12a蛋白浓度分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm，设置crrna浓度设置分别为25nm、50nm、100nm、150nm、200nm进行正交试验，筛选出最佳的反应浓度比；
crrna筛选：对设计的五对猪圆环病毒2型crrna引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验。6.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述灵敏度试验操作步骤：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
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660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释orf2基因重组质粒(pmd18-t-orf2)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl、108copies/μl、并使用灭菌水作为实验的阴性对照。7.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述特异性试验操作步骤如下：使用pcv3、asfv、prv、csfv为对照，阳性和阴性对照分别使用阳性样本和ddh2o，进行特异性试验，验证lamp-crispr/cas12a方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。8.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述猪圆环病毒2型的重复性检测操作步骤如下：选择105～104copies/μl的稀释具有pcv2 orf2序列的质粒，利用已知的最优检测体系进行3次重复检测，设立无酶水为阴性对照，并于第二天，第三天分别再次重复检测，以确定该方法的重复性。9.根据权利要求1所述的一种基于lamp-crisprcas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述猪圆环病毒2型的临床样本检测操作步骤如下：采用本研究建立的crispr/cas12a方法对20份样本进行pcv2的检测，同时，使用pcr技术检测方法平行检测，两者的检出率一致，crispr/cas12a技术具有临床应用价值。

技术总结
本发明公开了一种基于LAMP-CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，包括以下操作步骤：(1)组织样品的处理；(2)病毒DNA的提取；(3)引物设计；(4)PCR产物回收及纯化；(5)标准质粒的构建；(6)重组质粒鉴定；(7)质粒DNA小量抽提；(8)LAMP引物筛选及扩增；(9)猪圆环病毒2型LAMP-CRISPR-Cas12a检测体系建立；本发明在CRISPR技术的基础上与LAMP技术相结合，建立了PCV2的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂仪器设备。这种低价、高度敏感和特异性强、便携式和可视化的方法将是现场PCV2检测的替代方法，这可能有助于及时监测和快速制定控制PCV2的策略。及时监测和快速制定控制PCV2的策略。及时监测和快速制定控制PCV2的策略。


技术研发人员：刘永杰 毛首会 兰喜 马维民 杨亚民 吕律 吴锦艳 张伟 何继军 尚佑军 郑海学
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/14