一种鉴定鹅产蛋性能的分子标记及检测方法

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定鹅产蛋性能的分子标记及检测方法。


背景技术：

2.和大多数经济性状一样，鹅产蛋量的选育方式主要也是常规选育，即以表型选择为主的育种措施。目前鹅的个体笼养还未全面兴起，对鹅产蛋量对选择主要以圈养的整个家系为选择单位，只根据家系的产蛋量均值的大小决定个体的去留。这导致了采用常规选育鹅产蛋量提升的进展较为缓慢。
3.近年来，随着饲养方式的改变和人工授精技术的发展，鹅个体的产蛋和系谱的记录得以实现，这些发展让育种工作者可以利用个体、同胞、亲本和后裔的表型值对育种值的回归来估计育种值，并依据此进行常规选育。然而，由于产蛋性状还受营养、环境、疾病等随机环境因素的复杂影响，这些因素是基于表型选育无法进一步提升鹅产蛋量的障碍。
4.二十一世纪以来，全基因组测序技术增强了人们对畜禽各种经济性状的了解，全基因组选择技术在家禽产蛋量的选择中已有一些应用和效果。育种工作者通常在对不同家禽进行全基因组重测序的基础上，整合对重要经济性状功能基因的显著位点，研制出家禽商业育种芯片进行基因组选择育种。一般而言，基因组选择需要在参考群体中通过已知的表型和候选标记位点的基因型计算标记的效应；随后，根据估计的效应对已知表型和基因型的候选群体进行基因组育种值的估计，因此，丞需开发出一种用于鉴定和筛选鹅产蛋性能的分子标记，借助分子生物学的手段，实现高效且准确的高产蛋量鹅的鉴定，为鹅育种提供可靠的参考。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种鉴定鹅产蛋性能的分子标记及检测方法，本发明提供的分子标记，其核苷酸序列如seq id no.3所示，本发明还提供了扩增该分子标记的引物，其核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，通过该分子标记引物对鹅基因组dna进行扩增，根据扩增产物的序列可以鉴定出该鹅是否具备高产蛋性能。本发明提供的分子标记和分子标记引物可以高效且准确的鉴定具有高产蛋性能的鹅，在鹅的育种中具有显著的应用价值，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选，为鹅育种提供可靠的参考。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种鉴定鹅产蛋性能的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示；该分子标记位于鹅的3号染色体上，其中，该鹅的参考基因组为prjna813978。
7.本发明还提供了一种扩增上述分子标记的引物，该引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
8.本发明提供的鉴定鹅产蛋性能的分子标记可用于鹅育种中，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选。
9.本发明还提供了一种鹅产蛋性能的检测方法，包含如下步骤：
10.s1：提取待检测鹅的基因组dna；
11.s2：以s1中提取的鹅基因组dna为模板，以核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物进行pcr扩增；
12.s3：对s2中扩增的产物进行测序鉴定，当扩增产物的核苷酸序列如seq id no.3所示时，表明该鉴定的鹅具备高产蛋性能；当扩增产物的核苷酸序列与seq id no.3不相同时，表明该鉴定的鹅不具备高产蛋性能。
13.进一步地，上述的检测方法，其s2中的pcr扩增，具体如下：
14.pcr扩增反应体系为25μl：10μm的引物各1μl，dna模板1μl，2
×
rapid taq master mix 12.5μl，ddh2o 9.5μl；
15.pcr扩增反应程序：95℃3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃27sec，35cycles；72℃5min。
16.本发明提供的检测方法可用于鹅育种中，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选。
17.本发明的鉴定鹅产蛋性能的分子标记及检测方法，填补了鹅产蛋性能分子生物学鉴定和筛选的空白，具有以下优点：
18.本发明通过提供的引物对待检测鹅的基因组dna进行pcr扩增，根据扩增结果可以判定出这个待检测的鹅是否具备高产蛋性能，通过扩增产物的有无或具体序列即可判定出结果，该方法可以高效且准确的鉴定具有高产蛋性能的鹅，在鹅的育种中具有显著的应用价值，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选，为鹅育种提供可靠的参考。
附图说明
19.图1为本发明中采用两种不同方法取交集筛选候选基因结果示意图。
20.图2为本发明中不同品种的鹅在indel
chr3:54429172
位点发生突变的比例统计结果。
21.图3为本发明中不同基因型中esr1基因在鹅卵巢基质中的表达量统计结果。
具体实施方式
22.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.说明：本实施方式中未具体说明的均为常规试验方法和常用实验材料。
24.实施例
25.在多个地方品种的发源地，分别收集野生品种鸿雁以及4个高产品种和9个低产品种母鹅(共计91个个体)，具体见下表1，采集各个母鹅的血液或组织并置于液氮中，随后转移至-80℃冰箱保存。
26.表1本发明中采集血液或组织样本的来源和基本信息
[0027][0028][0029]
采用dneasy血液与组织试剂盒从各品种的血液或组织中提取基因组dna。采用agilent 2200tapestation、qubit 2.0荧光仪和琼脂糖凝胶电泳评估dna的质量。按照制造商的说明，使用truseq文库构建工具包构建插入尺寸为350bp的双端文库，并在illuminanovaseq 6000平台进行测序。对测序得到的原始reads，首先利用fastqc软件对原始数据据进行检测。根据原始数据的质量，利用ngs qc toolkit工具对原始测序数据进行质控，去除残留的引物和接头序列，同时每一条测序读长少于70％的碱基测序质量在20以上的也被去除。将质控后的数据再利用fastqc软件进行检测。随后，将质控后的数据利用bwa-mem软件的
‘
bwa-k 40-m-r’参数比对到四川白鹅参考基因组(版本号为：prjna813978)上。将得到的sam文件使用samtools软件将映射结果转换为bam格式，并过滤未映射和非惟一映射的reads。变异信息的获取是根据gatk(v4.1.7.0)软件推荐的最佳实践工作流程进行的。本发明共获得2,831,184,184,200bp的原始数据，平均每个样本的测序深度为21.69
×
，平均比对率为98.92％，这些数据分别有98.22％和95.19％的数据覆盖到基因组1
×
和4
×
。通过数据分析，共获得12,633,596个snp位点，位于外显子上的变异中，其中，853,494为同义突变类型，589,820个为非同义突变类型，7,963个为翻译提前终止类型，3,660个为未知类型，797个为终止密码子缺失类型。此外，还获得了1,288,558个indels，其中包含543,034个插入，745,524个缺失。
[0030]
为了检测具有选择性扫描显著特征的基因组区域，利用vcftools软件，在40kb滑动窗口内计算遗传分化指数(fst)和核苷酸多样性差异(log2θπ(鸿雁θπ/家养鹅θπ))，并在整个基因组中按20kb的步长移动。考虑到被选择的基因组区域具有较低的遗传变异水平，将等位基因频率分化最高的前5％区域和核苷酸多样性差异最高的前5％区域作为候选选择扫描区域，位于这些区域内或附近的基因作为候选基因。高产鹅种相比于鸿雁而言，fst值处于top5％并受到正向和反向选择的区域分别有1376和30个，低产鹅种分别有1418个和
17个，这些区域中有1个在高、低产蛋中受到了相反的选择，位于未组装完整的片段中，未注释到基因。其中，分别有536个和11个区域在高、低产鹅中均受到了正向和反向的选择，注释到219个基因。分别有881和6个区域仅在低产鹅种中受到了正向或反向的选择，注释到317个基因。分别有840和18个区域仅在高产鹅种中受到了正向或反向的选择，注释到416个基因。
[0031]
全基因组关联研究(gwas)使用在全基因组高效混合模型关联(genome-wide efficient mixed-model association，gemma)软件中实现的混合线性模型(mixed linearmodel，mlm)程序进行。利用所有检测的野生鹅和家鹅群体中已鉴定的snps(maf≥0.05，缺失率≤0.1，测序深度≥4)和indels(maf≥0.05，缺失率≤0.3，测序深度≥4)进行gwas分析。mlm程序采用统计模型
‘
y＝xα+sβ+kμ+e’，其中y表示表型，x表示基因型，s为结构矩阵，k为相对亲属关系矩阵，α和β表示固定效应，kμ为随机效应，e为正态分布残差。利用这些snps或indel得到的前2个主成分分析特征向量建立种群结构修正的s矩阵，利用简单匹配系数矩阵建立k矩阵。利用r软件中的qqman软件包对gwas结果的曼哈顿图和q-q图进行可视化处理。设定p《0.05/n+1和p《1/n+1分别设定为与性状显著和潜在相关的阈值，将变异信息注释到基因名。采用估计的独立标记数进行基于连锁不平衡修正的bonferroni校正，达到5％全基因组水平显著(p《5.15
e-9
)的snp位点有9个，注释到bpifc基因的相关区域。采用估计的独立标记数进行基于连锁不平衡修正的bonferroni校正，达到5％全基因组水平显著(《6.74
e-8
)的位点注释情况如下表2所示，注释到bpifc、rtcb、syne1和esr1基因。
[0032]
表2不同品种间蛋产量差异显著相关的位点及其注释
[0033][0034][0035]
对esr1基因下游的indel
chr3:54429172
位点的基因型与鹅产蛋性能进行相关分析，其中，采用两种不同方法取交集筛选候选基因的结果示意图如图1所示，可知，仅有esr1基因同时被两种方法筛选出来。而esr1基因中最显著的标记是位于该基因下游的位点indel
chr3:54429172
，该位点(indel
chr3:54429172
)是在3号染色体上第54429172bp后的2bp发生了缺失。对不同品种的鹅在该位点发生突变的比例进行统计，结果如图2所示，可知，高产蛋鹅种中该位点几乎未发生突变，而在低产蛋鹅种中该位点发生突变的比例较高(发生了2bp的缺失)。同时，对不同基因型中esr1基因在鹅卵巢基质中的表达量做进一步研究，其表达量统计结果如图3所示，可知，发现该位点纯合突变后会显著改变esr1基因在鹅卵巢基质中的表达量。
[0036]
根据上述标记的突变位点，开发了通过pcr扩增可以特异性鉴定该位点信息的分子标记引物f和r，具体序列如下所示。通过该引物(f和r)对鹅产蛋性能进行鉴定，以鹅基因组dna为模板进行pcr扩增，当扩增产物的核苷酸序列如seq id no.3所示时，表明该鉴定的鹅具备高产蛋性能；当扩增产物的核苷酸序列与seq id no.3不相同时，表明该鉴定的鹅不具备高产蛋性能。同时，核苷酸序列如seq id no.3所示的片段可以作为一种分子标记，通过鉴定该分子标记的有无，可以用来鉴定待检测鹅是否具备高产蛋性能，在鹅的育种中具有显著的应用价值，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选。在该分子标记的序列(seq id no.3)中，加粗且标注有下划线的2bp为突变位点，当基因中该位点的2bp发生了缺失时，代表该检测的鹅不具备高产蛋性能。
[0037]
具体引物为(5
’→3’
)：
[0038]
f(seq id no.1)：aggaaaagaaagatgaccaa；
[0039]
r(seq id no.2)：tgagatgaaaggacagcgt；
[0040]
分子标记(seq id no.3)：
[0041]
aggaaaagaaagatgaccaagctgtaaagctgtctaataccacagtctgtaatgcttgagggtactctgggtgtgcttttttccccctacacttgccccattaaccctagttcatgctatgatgattaacacacatgttgatgccacactgagctttgcaactcaaggtagatcttcaagccactggtactcattggatgatttttgctttaatgggatcctgtgaagtttgggcatcctgtgggtatttgtttcagctttcgctgctttgtgccagttcttaggatcatgatgtagttctgcaaaaacacatttgaagtcataatggaatcagttcagggctgggaattccttttagaggaatctgtttctcaaaccactttaactgttcaggtggaaactttgtctagagttgagattgaagactagaaagtaagaagcctgagctggcactcaagagacccttaacatactgtcacaaacttcctacgattcccttaagacagctcacaaactgaccttcctatacttgagggtataggaggtttacagtttacaaacaggtgttttccaggtctgtgacattatgaattcattatcaattaattatgaaaagttcctatgatctcacatcagctatgccctacctctttaatgaggttaacctccattccttctgcagctcatcactttcttctcagtcttcctagactgaacatttcatgttcatgggagaggaaagaagagggcatgaccattatgaacaagatggaaccattctgcgcatcatccctcccaaattttagtgattacttccccagactccactggaagcttgaatgaggtgtagaagttctgctttccttttatagacaaaaggctgttcttccctaggtcttagggaagtgggtatggcattcagaccatcaaaagagaaagctgctctggcagatacaaactttgcagaagtccgtagctttctaaatgccaaaacagcagtactagagacaaccacacctggctactttgctgcagtcccactttcttgcatatgtcccttcagtctcccccatctttgaaagtcacccagaacactcattttactgagttcaaaaataagtcagtatcatgcaataggatggtttcagacctctcataccattgcagtccctctgatctgattacaacgctgtcctttcatctca。
[0042]
在有个体产蛋记录的四川白鹅群体中采集其血液或组织进行dna的提取，以提取的dna为模版，采用上述开发的引物按下表3所示的pcr扩增体系和表4所示的pcr扩增程序进行pcr扩增，随后用sanger测序进行测序后判断基因型。采用基因型对四川白鹅群体的产蛋情况进行关联分析发现，再结合pcr扩增对该位点进行鉴定，选择未发生突变的鹅种进行繁育统计，发现选育的鹅种可以提高365日龄产蛋量3.5个，而365日龄产蛋频率显著提高0.08，具体见下表5所示。
[0043]
表3pcr扩增反应体系
[0044]
[0045][0046]
表4pcr扩增反应程序
[0047][0048]
表5采用该标记在四川白鹅进行选择的效果
[0049][0050]
综上可知，通过本发明提供的分子标记、分子标记引物和检测方法可以高效且准确的鉴定出所鉴定的鹅是否具有高产蛋性能，在鹅的育种中具有显著的应用价值，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选，为鹅育种提供可靠的参考。
[0051]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
[0052]
[0053]

技术特征：
1.一种鉴定鹅产蛋性能的分子标记，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示；该分子标记位于鹅的3号染色体上，其中，所述的鹅的参考基因组为prjna813978。2.如权利要求1所述分子标记的扩增引物，其特征在于，所述的引物，其核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。3.如权利要求1所述的分子标记在鹅育种中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用包含高产蛋性能鹅的鉴定和筛选。5.一种鹅产蛋性能的检测方法，其特征在于，包含如下步骤：s1：提取待检测鹅的基因组dna；s2：以s1中提取的鹅基因组dna为模板，以核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示的引物进行pcr扩增；s3：对s2中扩增的产物进行测序鉴定，当扩增产物的核苷酸序列如seq id no.3所示时，表明该鉴定的鹅具备高产蛋性能；当扩增产物的核苷酸序列与seq id no.3不相同时，表明该鉴定的鹅不具备高产蛋性能。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述s2中的pcr扩增，具体如下所述：pcr扩增反应体系为25μl：10μm的引物各1μl，dna模板1μl，2
×
rapid taqmastermix 12.5μl，ddh2o 9.5μl；pcr扩增反应程序：95℃3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃27sec，35cycles；72℃5min。7.如权利要求5-6中任意一项所述的检测方法在鹅育种中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用包含高产蛋性能鹅的鉴定和筛选。

技术总结
本发明公开了一种鉴定鹅产蛋性能的分子标记及检测方法，涉及分子生物学技术领域。本发明提供的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，本发明还提供了扩增该分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，通过该分子标记引物对鹅基因组DNA进行扩增，当可以扩增得到如SEQ ID NO.3所示的序列时，表明该鹅具有高产蛋性能；当不能扩增出该序列时，表明该鹅不具备高产蛋性能。本发明提供的分子标记和分子标记引物可以高效且准确的鉴定具有高产蛋性能的鹅，在鹅的育种中具有显著的应用价值，尤其可用于高产蛋性能鹅的鉴定和筛选，为鹅育种提供可靠的参考。为鹅育种提供可靠的参考。为鹅育种提供可靠的参考。


技术研发人员：欧阳清渊 王继文 胡深强 胡继伟 刘贺贺 李亮
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/8/16