一种新型抗新冠病毒阻断肽及其应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种新型抗新冠病毒阻断肽及其应用。


背景技术：

2.当前，新冠病毒的防治已是全球关注的重大公共安全和卫生问题。新冠病毒进入细胞是其侵染人体的关键环节，人血管紧张转移酶-2（ace 2）是其主要细胞表面受体之一。因此，以人血管紧张转移酶-2为目标设计抗新冠病毒阻断剂，通过阻断剂特异性结合在人血管紧张转移酶-2表面，继而阻断新冠病毒结合ace 2已成为研究热点。
3.当前抗新冠病毒阻断剂设计研究中，小分子物质一直是热门，但是，这些小分子物质大多含有杂环，结构复杂，合成成本高；同时，这些小分子物质大多非天然生物物质，具有毒性，生物安全性不确定。多肽分子量小，具有一定生理功能，免疫源性低，是理想的阻断剂，但天然多肽配体序列冗长，具免疫源性，限制了其的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种安全、经济、高效的新型新冠病毒阻断肽及其应用。
5.具体技术方案如下：在第一方面，本发明提供了一种新型新冠病毒阻断肽，所述阻断肽的氨基酸序列（n端至c端）如seq id no.1中所示： gln-ser-lys-gly-arg-tyr。
6.上述的阻断肽，对人正常细胞安全无毒，同时能结合在人血管紧张转移酶-2上，继而阻断新冠病毒结合具有ace 2的细胞。
7.进一步的，所述含有人血管紧张转移酶-2的细胞选自由人肺泡上皮细胞，脐静脉内皮细胞所组成的组。
8.在第二方面，本发明提供了新型新冠病毒阻断肽在非疾病诊断和治疗目的阻断新冠病毒进入人体细胞中的应用。
9.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：安全：该阻断剂肽分子量小，由6个氨基酸残基组成，免疫原性低；其残基序列取自20种必需氨基酸，安全无毒。
10.经济：该阻断剂肽段由固相合成而得，成本较低且便于质量管控。
11.（3）高效：该阻断肽段可以结合在含有人血管紧张素转移酶-2的细胞上，从而有效抑制新型冠状病毒进入人体细胞。
实施方式
12.以下是对本发明的具体实施方式进行详细说明，仅用于对本发明提供进一步说明解释，但并不构成对本发明的限制。
13.实施例1：新冠病毒阻断肽的合成
（1）活化树脂：称取2000mg的fmoc-tyr wang resin，加入20ml的dmf浸泡30min，使其充分溶胀。
14.（2）脱保护：压滤除去浸泡树脂的dmf，加入10ml含有20%哌啶的dmf溶液，氮气吹沸反应15min，然后压滤除去，脱除氨基的fmoc基团，用10ml的异丙醇和10ml的dmf交替洗涤树脂三次，然后用茚三酮法检测树脂应成黑色或紫色。
15.（3）缩合反应：连接下一个氨基酸，称取1.4mmol/g树脂的fmoc-氨基酸，以910mg tbtu，0.45g hobt和0.52ml diea的20ml dmf为反应液，室温下氮气吹沸反应3h，反应结束后，用10ml的异丙醇和10ml的dmf交替洗涤树脂三次。检测氨基。
16.（4）重复步骤（2）-（3）步骤：按多肽的顺序自c端向n端延伸多肽。重复脱保护、洗涤、缩合的过程至剩余的氨基酸连接完毕，完成多肽的连接。
17.（5）多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按体积比为80/5/5/5/3/2将tfa/phenol/超纯水 /thioanisole/edt/tis配成20ml的混合切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌3h，用200目砂芯过滤器除去树脂，滤液直接滴入冷冻乙醚中，5000r/min离心沉淀，冻干至恒重即得粗肽。
18.（6）粗肽用hplc纯化至纯度大于95%。
19.根据上述方法合成的氨基酸序列为gln-ser-lys-gly-arg-tyr。
20.实施例2：细胞毒性实验（1）接种细胞：取96孔板，每孔加入含有5
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103个人上皮细胞培养液，37℃，5%二氧化碳培养箱24小时，使细胞贴壁。
21.（2）培养细胞：配置含1 mm浓度的阻断肽的培养基，以无阻断肽的培养基为阴性对照孔（control），37℃，5%二氧化碳培养24h。
22.（3）显色：贴壁细胞每孔加入20μl mtt，继续孵育4h之后弃掉培养液，每孔加入150μl dmso，震荡10min。
23.（4）比色：选择490nm波长，在酶标仪免疫检测仪上通过光吸收值计算细胞存活率。结果见表1：表1.阻断肽毒性测试结果由表1可知，本发明提供的阻断肽在高浓度（1mm）、长时间（24h）条件下对细胞未有明显伤害，安全无毒。
24.实施例3：人血管紧张转移酶-2吸附实验（1）接种细胞：a549细胞被植入6孔板(1
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106个细胞/孔)，并在含有10%胎牛血清(fbs, gibco)的杜尔贝科改良eagle培养基(dmem, gibco, thermo fisher scientific, shanghai, china)中培养，37℃，5%二氧化碳培养箱24小时（h），使细胞贴壁。
25.（2）培养细胞：25μg/ml fitc标记的阻断肽（绿色荧光）加入6孔板中，37℃，5%二氧化碳培养15分钟。10μg/ml 可特异吸附ace 2的新冠病毒结合蛋白s1（sars-cov-2 s1）加入6孔板中，37℃，5%二氧化碳培养1h。
26.（3） 染色：使用抗刺兔多克隆一抗(40591-t62, sino biological, 1:200)和山羊抗兔二抗(alexa fluor 488, invitrogen, thermo fisher scientific，红色荧光)对附着在细胞表面的sars-cov-2 s1进行染色。细胞核用4 '，6-二胺基-2-苯基吲哚二盐酸盐(dapi, c1002, beyotime)染色。
27.（4）荧光显微：去培养基，pbs洗涤三次加入胰蛋白酶，离心去上清。装片用蔡司lsm780 nlo共聚焦显微镜观察细胞。结果如表2：表2.阻断肽阻断sars-cov-2附着结果阻断肽浓度无阻断剂多肽25mm浓度的阻断剂多肽显微镜下颜色红色荧光绿色荧光由表2可知，在没有阻断肽存在时，sars-cov-2 s1有效吸附在ace 2上，双抗标记后呈红色荧光。而阻断肽存在时，阻断肽有效吸附在ace 2上，继而阻断sars-cov-2 s1吸附，双抗标记无效，只有阻断肽自身所标记的绿色荧光。故本发明提供的阻断肽在高浓度（25mm）条件下可以阻断sars-cov-2附着在细胞表面，并进入细胞中。
28.实施例4：sars-cov-2细胞吸附阻断实验（1）接种细胞：转染人ace2 (hek-293t-hace2)的人胚胎肾239t细胞(hek-293t-hace2)接种于96孔板(5
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103细胞/孔)，37℃，5%二氧化碳培养箱24小时，使细胞贴壁。
29.（2）培养细胞：在37℃条件下与浓度逐渐增加的阻断肽(0.5、1.0、3.0、6.0、15、25、30、25、50、75、100和200μg/ml)与人胚胎肾239t细胞(hek-293t-hace2)预孵育1 h，再加入sars-cov-2刺状伪病毒粒子(20 μl)，共孵育12 h。
30.（3）检测：培养结束后去除伪病毒粒子，进一步培养细胞48小时。使用双荧光素酶报告测定系统(e1910, promega，中国北京)测定荧光素酶活性，评估假病毒粒子感染情况。结果如表3：表3.阻断肽阻断sars-cov-2附着结果由表3可知，本发明提供的阻断肽在高浓度（29.4 mm）、长时间（48h）条件下可以阻断sars-cov-2附着在细胞表面，并进入细胞中。
31.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种新型新冠病毒阻断肽，其特征在于，所述阻断肽段的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的新型新冠病毒阻断肽，其特征在于，所述阻断肽对人体细胞安全无毒、能有效结合在含有人血管紧张转移酶-2的细胞上。3.根据权利要求2所述的新型新冠病毒阻断肽，其特征在于，所述含有人血管紧张转移酶-2的细胞选自由人肺泡上皮细胞，脐静脉内皮细胞所组成的组。4.权利要求1-3任一所述的新型新冠病毒阻断肽在非疾病诊断和治疗目的阻断新冠病毒进入人体细胞中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新型新冠病毒阻断肽及其应用，所述阻断肽的氨基酸序列为：Gln-Ser-Lys-Gly-Arg-Tyr；该阻断肽对人体细胞安全无毒、能有效结合在含有人血管紧张转移酶-2的细胞上；该阻断肽可应用与非疾病诊断和治疗目的阻断新冠病毒进入人体细胞。阻断新冠病毒进入人体细胞。


技术研发人员：刘子扬 韦宇平 张曼 时君楠 孙政豪 牛秋红
受保护的技术使用者：南阳师范学院
技术研发日：2023.02.02
技术公布日：2023/8/16