氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体地说，是纳米氢化镁在诱导和维持小胶质细胞选择性极化治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状中的应用。


背景技术：

2.多发性硬化(multiple sclerosis，ms)是一种中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病，主要病理特征为炎症性脱髓鞘和轴突损伤，是青壮年除创伤外最常见的神经致残原因，通常导致感觉运动功能障碍和情感认知损伤，焦虑和抑郁是ms最常见的情感障碍，占比可高达45.6％，ms共病焦虑和抑郁症严重影响患者的生活质量、疾病进程和总体转归，两者相互促进，形成恶性循环。首先，焦虑和抑郁不仅可以加重ms患者的躯体功能障碍，影响患者的工作能力及家庭和社会生活能力，降低患者的生活质量；而且可以导致认知功能障碍，降低患者对治疗的依从性，间接导致病情加重和病程延长，明显影响预后；其次，焦虑和抑郁可以增加ms患者的死亡率。标准化死亡率(smr)统计显示，ms人群的自杀风险是普通人群的两倍；第三，ms反过来可以加重焦虑和抑郁症状。ms患者更严重的神经功能障碍及较差的生活自理能力可能促进患者抑郁、焦虑状态的发生。瑞典ms注册中心针对15000多名ms患者进行的临床研究表明，ms共病抑郁症患者的致残风险明显增加。
3.目前，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(ssri)和苯二氮卓类(bzd)被认为是焦虑和抑郁症的一线治疗药物，然而，ssri类药物普遍存在延迟起效、有效率不高、代谢综合症、心血管和胃肠道副作用、性功能障碍等缺陷；bzd类则有疲劳、嗜睡、食欲改变和认知障碍等副作用。尤为重要的是，ssri类药物可能增加儿童和青少年抑郁症患者的自杀倾向和敌对行为；仍有大约三分之一的抑郁症患者对现有的抗抑郁药物产生耐药性；此外，现有数据不足以支持ms患者抗焦虑治疗的有效性。由于现有一线抗焦虑抑郁药物的安全性问题、不良反应、有限的疗效和低耐受性，急需寻找更加安全有效的新型药物。
4.小胶质细胞作为中枢常驻的免疫细胞，也是天然免疫和获得性免疫重要的桥梁细胞，在ms共病焦虑和抑郁障碍的发生和发展中起关键作用。针对ms的研究表明，有48个ms风险基因优先表达于小胶质细胞；ms患者脑中存在小胶质细胞激活，且早于外周血免疫细胞浸润和脱髓鞘。小胶质细胞主要通过参与吞噬、炎症调控、抗原提呈和突触修剪等机制影响ms的进程。临床实验中应用小胶质细胞激活抑制剂米诺环素可以在早期减缓临床孤立综合征向ms的转变。针对焦虑和抑郁症的研究表明，抑郁症患者大脑情绪调节相关脑区存在小胶质细胞的激活。小胶质细胞激活进一步通过调节单胺能通路、谷氨酸能通路、突触传递、突触可塑性、海马神经发生以及单核细胞浸润等机制影响焦虑和抑郁状态。临床应用米诺环素可以减轻焦虑和抑郁症状。这些结果提示，以小胶质细胞为靶点的抗炎治疗可能成为缓解ms共病焦虑抑郁症患者精神症状的潜在治疗手段。然而，米诺环素作为一种四环素类抗生素，不仅具有导致恶心、腹泻、眩晕、皮疹和牙齿变黄等副作用，长期使用还可能导致菌群失调，不良反应较大，患者长期用药依从性差。因此有必要寻找安全性更高的抗炎药物。
5.纳米氢化镁(mgh2)是一种新型高效的镁基储氢材料，可以通过以下反应在胃中产生足量所需的h2：mgh2+2h2o
→
mg(oh)2+2h2。h2是一种生理惰性气体，早在20世纪70年代就被用于治疗疾病。如今，越来越多的证据表明h2对多种疾病具有保护作用，尤其是中枢神经系统疾病。h2主要通过抗氧化和抗炎发挥保护作用。氧化应激源于活性氧(ros)，h2可选择性地减少剧毒的ros和过氧亚硝酸盐。此外，h2还可以抑制脂多糖(lps)诱导的疾病动物模型中的炎症。同时，h2易于使用，具有神经保护作用且副作用少。镁作为哺乳动物细胞中含量第二丰富的阳离子参与了众多生物学过程。镁对神经系统具有保护作用，多种神经系统疾病中均存在镁稳态的异常，如帕金森、阿尔兹海默症抑郁、应激相关精神障碍。镁同样具有抗炎作用，有研究表明镁可以抑制大脑中ros的产生，同时镁缺乏会引发炎症(nielsen,2018；shahi et al.,2019；zheltova et al.,2016)。纳米氢化镁较传统的给h2方法而言，其释放h2量多，通过缓释的方式被机体吸收作用时间长，在释放h2的同时也可以补充镁元素。
6.目前还没有氢化镁在多发性硬化共病焦虑抑郁症中的作用和机制研究。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供氢化镁新的医药用途，具体是纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用；以及促进小胶质细胞转为m2极化状态中的应用。本发明还提供一种促进小胶质细胞转为m2极化状态的方法。
8.本发明的第一方面，提供纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用。
9.进一步的，所述的纳米氢化镁通过抑制中枢神经系统小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化，并且通过抑制神经炎症反应改善患者的抑郁焦虑样表现。
10.进一步的，所述的炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状是指多发性硬化共病焦虑和抑郁症。多发性硬化患者情感障碍以焦虑抑郁为主要表现。焦虑和抑郁是多发性硬化患者最常见的共病，占比可高达45.6％。多发性硬化共病焦虑和抑郁症严重影响患者的生活质量、疾病进程和总体转归，两者相互促进，形成恶性循环。
11.进一步的，所述的药物为口服制剂。
12.本发明的第二方面，提供纳米氢化镁在制备促进小胶质细胞转为m2极化状态的药物中的应用。
13.进一步的，所述的纳米氢化镁通过抑制小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化。
14.进一步的，所述的促进小胶质细胞转为m2极化状态的药物是具备降低炎症，抑制氧化应激等神经保护作用的药物。
15.本发明的第三方面，提供纳米氢化镁在制备调节小胶质细胞极化及降低氧化应激水平的药物中的应用。
16.进一步的，所述的纳米氢化镁降低小胶质细胞ros水平、减少线粒体损伤。
17.本发明探究mgh2作为一种新型、安全有效的缓解炎症性脱髓鞘和抑郁症状药物的可行性。本发明研究发现氢化镁可以减轻由于炎症性脱髓鞘和急性束缚引起的大脑神经炎症，从而改善脱髓鞘导致的运动功能障碍和小鼠的焦虑、抑郁样表型，而这一作用可能是通过氢化镁调节小胶质细胞极化及抑制氧化应激得以实现。
18.抑郁、疲劳和焦虑的相关症状是决定ms患者生活质量的重要因素，而ms共病焦虑和抑郁症也会导致ms患者疼痛、疲劳及认知功能障碍症状加重，所以针对ms共病焦虑和抑郁症值得更多的重视与研究。免疫炎症在ms或是抑郁症的病因学中都起到了重要的并且可以调节的作用，ms患者大脑小胶质细胞激活与抑郁症状评分之间存在相关性，这为ms患者的免疫激活与抑郁症之间的直接联系提供了相关证据。同时，也为治疗ms共病抑郁症提供了一种可能：抗炎治疗。本发明研究发现，新型的抗炎药物mgh2可以很好地降低炎性脱髓鞘模型eae小鼠的中枢炎症水平，改善其抑郁症状并缓解eae的发病进程。鉴于目前临床上常见的治疗精神障碍药物可能存在粒细胞缺乏症、肝损伤、代谢综合征等严重的副作用。mgh2有望成为一种新型、安全有效的治疗ms共病焦虑和抑郁症的选择。
19.eae可以模拟ms疾病进程，其中情感障碍的行为学异常只能在其造模后10天(10dpi)之前的时间段去观察，因为10天后小鼠会出现运动功能障碍。在此期间，小鼠会陆续出现焦虑抑郁样精神症状，并且，在这些认知功能障碍的eae小鼠中发现海马内tnf-α水平和神经元丢失增加、纹状体中tnf-α水平升高和小胶质细胞活化、下丘脑中il-1b和tnf-a水平升高。在本发明中，我们发现这些小鼠的大脑海马区存在小胶质细胞及星形胶质细胞的激活、胼胝体中出现小胶质细胞激活、髓鞘及轴突轻微损伤。这些实验结果表明，eae小鼠的焦虑抑郁样表型往往伴随着广泛的中枢神经系统炎症，提示神经炎症可能在认知功能障碍中发挥一定作用。
20.氢化镁减轻eae运动功能损伤以及炎症性脱髓鞘。氢化镁还可以缓解eae导致的情感障碍。那么，这种抗焦虑抑郁的作用是由于脱髓鞘损伤的减轻导致，还是由于抗炎作用导致的呢？为此本发明建立了急性束缚应激模型以期寻找答案。在过去几十年中，束缚作为心理应激源仍然是一种诱导应激的主要方法，尤其是针对以啮齿动物为研究对象的实验(buynitsky and mostofsky,2009；campos et al.,2013)。近期的研究也提示应激相关的精神疾病与大脑神经炎症及氧化应激密切相关(chen et al.,2019；kalinichenko et al.,2019；liu et al.,2018)。急性束缚应激模型可以诱导抑郁样表型(chu et al.,2016)，本发明中也验证了束缚模型抑郁表型的存在。并且，经过急性束缚后，我们发现小鼠胼胝体几乎不存在如脱髓鞘、轴突损伤等结构异常。胼胝体、海马区小胶质细胞激活提示我们这种单纯性的免疫炎症同样在抑郁症的发病中发挥作用。而随着对疾病神经生物学机制及治疗手段研究的深入，越来越多的证据也表明神经炎症在抑郁的发生中起到不可忽视的作用(chen et al.,2019；cornell et al.,2022；kalinichenko et al.,2019；sun et al.,2021)，也就是说抑制炎症反应从而改善抑郁症状是有可能实现的。临床上常用的抗抑郁药物同时具有减少中枢神经系统的免疫细胞浸润、抑制促炎细胞因子的作用也可以证实这一点(stamoula et al.,2021)。
21.神经炎症是一把双刃剑，一方面，它在神经组织的修复中发挥作用；另一方面，持续性的炎症会损伤神经细胞。神经炎症是由中枢神经系统神经胶质细胞和外周免疫细胞精心安排的复杂过程。尽管许多细胞对神经炎症都有反应，但在伤害性刺激或病理状态下，小胶质细胞总是比其他胶质细胞更早被激活，同时，小胶质细胞m1和m2型极化也是神经炎症的重要组成部分。星形胶质细胞对炎症刺激的反应似乎比小胶质细胞更被动，而少突胶质细胞由于其高代谢需求容易发生炎症反应。这也解释了我们在eae模型和束缚模型中所观察的炎症多是小胶质细胞的激活，少部分可能存在星形胶质细胞的激活。本发明实验结果
显示在eae或是束缚模型中，海马区均存在不同程度的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，但胼胝体在这方面似乎反应迟钝一些。显然，本发明的研究强烈提示海马区相较于胼胝体区比较容易受到急、慢性炎症的挑战，尽管它们都是情感障碍的关键脑区。
22.本发明的实验结果表明，mgh2在体外可以抑制小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化。可能是h2与镁的协同作用导致的，因为有研究表明硫酸镁可以促进大脑中m2型巨噬细胞的极化并且可以抑制lps活化的小胶质细胞释放炎性因子(gao et al.,2013；li et al.,2021)。
23.以往的研究提示抑制nf-κb通路、激活ampk通路可能在mgh2抗炎的过程中发挥作用(chu et al.,2019；gao et al.,2013；li et al.,2016)。而且，神经炎症的发生通常伴随氧化应激，氧化应激损伤源于活性氧(ros)产生和清除之间的不平衡。ros是氧化应激的标志物，ros的产生主要发生在线粒体中，所以氧化应激条件下线粒体功能也会受到影响。我们的体外研究发现mgh2能够降低小胶质细胞ros水平、减少线粒体损伤。
24.本发明优点在于：
25.1、本发明研究发现新型药物mgh2可以调节小胶质细胞极化及降低氧化应激水平，并且通过抗炎作用有效地改善eae小鼠抑郁样表型，从而为ms共病抑郁症提供一种新的、更加安全有效的治疗选择。
26.2、纳米氢化镁是一种新型高效的镁基储氢材料，可以通过以下反应在胃中产生足量所需的h2：mgh2+2h2o
→
mg(oh)2+2h2。
27.3、纳米氢化镁较传统的给h2方法而言，其释放h2量多，通过缓释的方式被机体吸收作用时间长，在释放h2的同时也可以补充镁元素。
28.4、可以添加到食物中进行喂食，用药途径更方便。
29.5、可以更安全的贮存和提供氢气，同时提供镁离子。该药释放的镁离子可以抑制大脑中氧化应激源于活性氧(ros)的产生，同时镁缺乏会引发炎症。镁对免疫细胞的功能也至关重要。镁离子可以抑制胶质细胞中tnf-α、il-1β的表达从而发挥抗炎作用。同时，镁也可以通过抑制炎症、氧化应激反应以及阻断nmda受体等作用缓解抑郁症患者的症状。h2在体外显著抑制了m1型小胶质细胞的增加，但对m2型小胶质细胞没有影响。富氢盐水可以促进新生小鼠缺氧缺血后小胶质细胞m2型极化。我们的实验结果表明，mgh2在体外可以抑制小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化。这也可能是h2与镁的共同作用导致的，因为有研究表明硫酸镁可以促进大脑中m2型巨噬细胞的极化并且可以抑制lps活化的小胶质细胞释放炎性因子。
附图说明
30.图1.mgh2治疗减轻eae的进展。(a)显示eae进展和干预的时间过程的示意图。(b)对照组和mgh2治疗组小鼠eae的平均临床评分。每组分别为11只和12只。(c，d)来自eae小鼠的30dpi的h&e染色的代表性脊髓切片和eae小鼠的白质(wm)中损伤部位周围浸润细胞数量的定量分析。浸润性细胞是指病变部位与正常部位相比细胞数量的增加。每组分别为3只和3只。(e-g)30dpi时eae小鼠病变部位周围脊髓切片的代表性抗iba1(红色)和抗gfap(绿色)免疫荧光，以及iba1+细胞/mm2和gfap+细胞/mm2的定量分析，每组n＝3对3只小鼠。(h-j)30dpi时eae小鼠损伤部位周围脊髓切片的代表性抗cc1(红色)和抗sox10(紫色)免疫荧光，
以及sox10+细胞/mm2和cc1+细胞/mm2的定量分析，每组n＝3对3只小鼠。(k，l)快蓝(luxol fast blue,lfb)在30dpi染色eae小鼠的代表性脊髓切片和总白质(white matter,wm)中脱髓鞘wm百分比的定量分析n＝3对每组3只小鼠。(m，n)30dpi eae小鼠脊髓切片的代表性抗mbp(绿色)免疫荧光和mbp+区域的定量分析。每组3只对3只小鼠。数据信息：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
31.图2.mgh2可以改善eae小鼠的行为。(a)显示研究中使用的行为测试方案的示意图。(b)开场实验(open field test,oft)，统计分析总距离，运动时间和进入中心区域，n＝8对每组8只小鼠。(c)大理石埋藏实验(marble burying test,mbt)，对一些埋藏的大理石进行统计分析，每组n＝5对5只小鼠。(d)黑白箱实验(light/dark transition test,ldt)，光室中时间的统计分析和转换数，每组n＝8对7只小鼠。(e)蔗糖偏好实验(sucrose preference test,spt)，蔗糖消耗百分比的统计分析，每组n＝5对5只小鼠。(f)尾悬吊实验(tail suspension test,tst)，静止时间的统计分析，每组n＝7比7小鼠。数据信息：*p《0.05。
32.图3.mgh2对eae小鼠海马和胼胝体炎症的影响。(a-c)海马dg，ca1和ca3区域的代表性抗iba1(红色)，抗gfap(紫色)免疫荧光。白色箭头标记iba1+小胶质细胞和gfap+星形胶质细胞。(d，e)海马中dg，ca1和ca3区的iba1+细胞/mm2和gfap+细胞/mm2的定量分析，每组n＝3只与3只小鼠。(f)cc，lv的代表性抗iba1(红色)，抗gfap(紫色)和抗olig2(绿色)免疫荧光：侧脑室。白色箭头标记iba1+小胶质细胞和gfap+星形胶质细胞。(g-i)每组3只小鼠的iba1+细胞/mm2，gfap+细胞/mm2和olig2+细胞/mm2的定量分析。(j)cc的代表性抗mbp(红色)、抗nf200(绿色)及抗smi32(紫色)免疫荧光。smi32+面积的差异以白色方框显示。(k-m)定量分析mbp，nf200和smi32的中值荧光强度(median fluorescence intensity,mfi)，每组n＝3对3只小鼠。数据信息：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
33.图4.mgh2治疗改善24小时束缚诱发的抑郁样行为。(a)24小时束缚应激模型。(b)示意图，显示行为测试在3个不同的组，以测试mgh2治疗的效果。(c)oft，总距离，中心区域总距离和中心区域移动时间的统计分析，每组n＝6比6比6小鼠。(d)mbt，对一些埋在地下的大理石进行统计分析，每组n＝6比6比6小鼠。(e)ldt光室时间和转换数量的统计分析，每组n＝6比6比6小鼠。(f)spt，蔗糖消耗百分比的统计分析，每组n＝6比6比6小鼠。(g)强迫游泳实验(forced swimming test,fst)，静止时间的统计分析，每组n＝6比6比6小鼠。数据信息：*p《0.05，***p《0.001。
34.图5.mgh2可减轻24小时束缚应激后海马和胼胝体的炎症反应。(a-c)海马中dg，ca1和ca3区域的代表性抗iba1(红色)，抗gfap(紫色)免疫荧光。白色箭头标记iba1+小胶质细胞和gfap+星形胶质细胞。(d，e)海马中dg，ca1和ca3区的iba1+细胞/mm2和gfap+细胞/mm2的定量分析，每组n＝3只小鼠。(f)cc的代表性抗iba1(红色)、抗gfap(紫色)和抗olig2(绿色)免疫荧光。白色箭头标记iba1+小胶质细胞和gfap+星形胶质细胞。(g-i)cc的iba1+细胞/mm2，gfap+细胞/mm2和olig2+细胞/mm2的定量分析，每组n＝3只小鼠。白色箭头标记iba1+小胶质细胞。数据信息：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
35.图6.mgh2可以影响小胶质细胞的极化和抑制氧化应激。(a)显示体外小胶质细胞极化研究的示意图。(b)il-4或lps刺激后24小时体外小胶质细胞中的相对inos，tnf-α，arg-1，ym1和fizz1 mrna表达。以inos和tnf-α为m1标记，以arg-1、ym1和fizz1为m2标记。每
组n＝3个对比3个实验。(c-e)在72小时的体外小胶质细胞的西方墨点法分析和相对inos和精氨酸酶-1蛋白水平，每组n＝3对3个实验。(f，g)通过流式细胞术(dcfh-da荧光探针)和mfi的定量分析测量小胶质细胞的细胞内ros。每组n＝3个对比3个实验。(h)代表性图显示体外小胶质细胞的jc-1荧光，红色荧光表示线粒体聚集体jc-1，绿色荧光表示单体jc-1。每组n＝3个对比3个实验。数据信息：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
36.图7.体外mgh2浓度的确定。bv2在不同浓度的mgh2中的细胞活力，每组至少n＝5个重复。数据信息：与对照组(0μm)相比，**p《0.01(t检验)。数据显示为平均值
±
标准差。
37.图8.髓鞘和轴突在24小时束缚应激后不发生改变。(a)cc的代表性抗mbp(红色)、抗nf200(绿色)和抗smi32(紫色)免疫荧光。(b，c)定量分析mbp和nf200的mfi，每组n＝3比3只小鼠。
38.图9.经24小时束缚应激后，mgh2处理可减少浸润细胞的数量。(a)海马不同区域的h&e染色的代表性脑切片。(b)约束组和mgh2处理组海马浸润细胞数量的定量分析，每组n＝3对3只小鼠。(c)cc中h&e染色的代表性脑切片。(d)约束组和mgh2处理组cc中浸润细胞数量的定量分析，每组n＝3只小鼠对3只小鼠。数据信息：*p《0.05，***p《0.001。
39.图10.mgh2处理不影响opcs的体外功能。(a)显示体外opc功能研究的示意图。(b)分别在48小时(增殖培养基)和72小时(分化培养基)体外的opcs的代表性抗brdu(红色)和抗caspase3(紫色)免疫荧光。(c，d)中brdu+细胞和caspase3+细胞百分比的定量分析，n＝1356比824细胞(brdu)，n＝1695比1375细胞(caspase3)。(e)体外72小时(在分化培养基中)opcs的代表性抗mbp(绿色)免疫荧光。(f-h)在72小时(分化培养基)的体外西方墨点法蛋白相对mbp和mag蛋白水平，每组n＝3对3个实验。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
41.实施例：
42.一、材料和方法
43.1、动物和mgh2治疗
44.所有的动物实验都是按照美国国立卫生研究院协会关于使用实验动物的指导方针进行的，并且得到了美国海军医科大学动物护理委员会的批准。c57bl/6小鼠购自上海斯拉克实验动物有限公司(中国上海)，在特定的无病原条件下饲养，8-10周龄使用。
45.治疗24小时束缚，实验组喂饲0.5％mgh2(ain93g+0.5％mgh2)，对照组喂饲标准化饲料(ain93g)。为了检测体外培养的bv2细胞中mgh2的浓度，我们检测了mgh2对bv2细胞活性的影响。将mgh2粉末悬浮于丙二醇中进行细胞实验，对照组在体外加入相同剂量的丙二醇。
46.2、实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型的建立
47.正如前面描述的那样，用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog35-55)诱导eae模型。简单地说，雌性c57bl/6小鼠(8周)接种于含热灭活剂的完全弗氏佐剂(h37ra株；difco)和百日咳毒素(516561，calbiochem-emd chemicals，san diego，ca)在pbs腹腔注射后0天(dpi)和2dpi。mgh2采用1dpi灌胃给药。临床eae评分为0-5分，每日进行盲法检查：0分，无临床症状，1分，尾部麻痹，2分，肢体瘫痪，3分，截瘫，4分，前肢无力或瘫痪，5分，垂死或死亡。
48.3、24小时束缚的程序
49.24小时的小鼠约束部分修改。简单地说，将老鼠放入50毫升的离心管中，从上午10点到第二天上午10点对它们进行24小时的约束。50ml离心管的头部、尾部和侧壁开孔(直径约0.5cm)，使空气流动。老鼠可以移动头部和前肢，但是身体和后躯不能移动或转身。在限制期间，老鼠没有食物和水。一旦限制结束，老鼠被立即放回它们的笼子，可以自由地获得食物和水。非束缚组(对照组)留在家养笼中。实验组小鼠在束缚后立即喂食mgh2，并持续到行为实验结束。
50.4、行为程序
51.每次实验前，将小鼠提前放入行为实验室1-2小时。所有的行为实验都是在上午9:00到下午5:00之间进行的。行为被记录下来，储存起来，然后通过一个自动行为追踪系统(smart 3.0.06，panlab harvard instruments)进行分析，该系统配备了红外线感光ccd摄像机。
52.5、旷场实验
53.将小鼠放置在一个40cm
×
40cm的开放野外装置的角落，利用高空视频跟踪系统进行10分钟的自发探索。在实验过程中，观察了小鼠的总行程、中心区的行程(20cm
×
20cm中心区)以及在中心区的行程时间和进入时间。
54.6、埋珠实验
55.大理石掩埋试验是在小鼠上进行的，经过了微小的修改(wiebe等人，2019年)。简单地说，老鼠被单独放置在一个开放的竞技场(50厘米
×
50厘米
×
30厘米)，其中包括新鲜的被褥(5厘米深)和20个干净的大理石，预先排列成5
×
4的格子。老鼠被允许埋藏大理石20分钟。试验结束后，对埋藏大理石进行人工计数。大理石如果至少有2/3被层理覆盖，则被认为是被埋葬的。
56.7、明暗场实验
57.明暗场实验(ldt)是基于啮齿动物对明亮区域的天生厌恶，做了一些小的修改。小鼠被轻轻地放置在一个笼子里(25厘米
×
25
×
25厘米)，笼子被分成一个黑暗的房间和一个有门的隔板照明的房间。老鼠被允许在开着门的两个房间之间自由移动10分钟。视频跟踪数据进行分析，使用软件提取的运动轨迹，在每个房间花费的时间和过渡号码。
58.8、蔗糖偏好实验
59.蔗糖偏好试验是用两个瓶子进行的，在这个过程中，小鼠可以自由地接触到水和蔗糖溶液。老鼠首先习惯于摄入两个瓶子中的水48小时。习惯化后3天停水，测定小鼠对蔗糖的喜好。前两天作为蔗糖溶液的习惯化。第3天的结果用于蔗糖偏好性的评价。每天，将小鼠分别放入小塑料笼中，12小时内放入两个瓶子，一个装自来水，另一个装2％蔗糖溶液。水或蔗糖溶液的消耗量是通过衡量两个瓶子的体积。瓶子在笼子的左右两侧被平衡，它们的位置在不同的测试中交替。蔗糖偏好(％)的计算方法如下：偏好＝[蔗糖溶液摄入量(ml)/总液体摄入量(ml)]
×
100。
[0060]
9、悬尾实验
[0061]
尾部悬吊试验是在前面描述的基础上进行。老鼠用胶带把尾巴悬挂在一个它们无法逃脱或抓住附近表面6分钟的位置。在测试的最后4分钟使用视频跟踪系统进行量化。
[0062]
10、强迫游泳实验
[0063]
小鼠被放置在一个玻璃烧杯中(24厘米高，直径14厘米)，其中含有15厘米深的水，
温度为24
±
1℃。老鼠被允许游泳6分钟。在测试的最后4分钟使用视频跟踪系统进行量化。
[0064]
11、细胞培养
[0065]
小胶质细胞和opcs的原代培养和纯化的方法简要地说，出生后1天(p1)c57bl/6小鼠处死获得含有小胶质细胞的混合大脑胶质细胞培养物。在含10％胎牛血清(fbs，gbico)的dmem/f12培养基(invitrogen)中培养10-14天后，摇动培养1h(180rpm，37℃)收集小胶质细胞。在m1极化方面，用脂多糖(lps，10ng/ml，r&d)刺激小胶质细胞。m2极化时，用il-4(10ng/ml，r&d)刺激小胶质细胞。
[0066]
将p1的sd大鼠处死，获得混合培养的皮质胶质细胞。在含10％fbs的dmem培养基中培养8-10天后，摇动培养1h(180rpm，37℃)去除小胶质细胞。更换培养基后，再摇动14小时(200转，37℃)收集细胞。在dmem/f12培养基中加入pdgfaa(0.1％)、b27(2％)、n2(1％)和bfgf(0.1％)培养增殖，在神经基底培养基中加入2％b27培养分化。
[0067]
12、rna提取和qpcr
[0068]
用trizol(invitrogen，卡尔斯巴德)从原代细胞培养物中提取总rna。利用反向第一链cdna合成试剂盒(thermo fisher scientific，沃尔瑟姆)合成了第一链cdna。采用上海toyobo公司的sybr green实时定量pcr混合系统，在罗氏公司的lightcycler 96仪上进行了实时定量pcr。基因表达以mrna水平表达，用
△△ct
方法将其归一化为标准的管家基因。引物对如下：
[0069]
inos：
[0070]
f：ttgacgctcggaactgtag(seq id no.1)；
[0071]
r：gacctgatgttgccattgt(seq id no.2)；
[0072]
tnf-α：
[0073]
f：gcctccctctcatcagttct(seq id no.3)；
[0074]
r：acttggtggtttgctacgac(seq id no.4)；
[0075]
arg-1：
[0076]
f：gcttgcttcggaactcaac(seq id no.5)；
[0077]
r：cgcattcacagtcacttagg(seq id no.6)；
[0078]
ym1：
[0079]
f：tactcctcagaaccgtcagat(seq id no.7)；
[0080]
r：catttccttcaccagaacac(seq id no.8)；
[0081]
fizz1：
[0082]
f：atgccaactttgaataggatg(seq id no.9)；
[0083]
r：cttgaccttattctccacgat(seq id no.10)；
[0084]
gapdh：
[0085]
f：tcaacgaccccttcattgacc(seq id no.11)；
[0086]
r：cttcccgttgatgacaagcttc(seq id no.12)。
[0087]
13、免疫印迹分析
[0088]
在ripa缓冲液中加入蛋白酶鸡尾酒抑制剂进行原代细胞培养。用抗诱导型一氧化氮(inos；1:500，细胞信号技术目录#13120)、抗精氨酸酶-1(1:1000，santa cruz biotechnology，catalog#sc-271430)、anti-mbp(1:500，millipoma，catalog#mab382)、
anti-mag(1:500，santa cruz biotechnology，catalog#c0217)对细胞裂解物进行western blot分析。这些蛋白质条带用image lab(odyssey clx，li-cor，america)分析和量化，标准化目标蛋白质到gapdh(1:10000，蛋白技术目录#10494)或β-actin(1:10000，蛋白技术，目录#66009)条带。
[0089]
14、免疫细胞荧光和免疫细胞荧光染色
[0090]
细胞或组织切片固定、渗透，并与初级抗体——anti-sox10(1:200,r&d systems,catalog#af2864)，anti-cc1(1:200,millipore,catalog#op80)，anti-iba1(1:200,abcam,catalog#ab48004)，anti-gfap(1:200,abcam,catalog#ab4674)，anti-olig2(1:200,millipore,catalog#ab9610)，anti-mbp(1:50,abcam,catalog#ab7349)，anti-nf200(1:200,milliporesigma,catalog#n4142)，anti-neurofilament-h(nf-h)，nonphosphorylated(clone smi32,1:400,biolegend,catalog#801701)，anti-caspase3(1:100,millipore,catalog#ab3623)overnight at 4℃，followed by incubation with tritc-conjugated or fitc-conjugated secondary antibody(1:200,jackson immunoresearch)在4℃的环境中过夜，然后与tritc结合或fitc结合的二级抗体孵育(1:200,jackson immunoresearch)然后用hoechst33342(1:1000，sigma-aldrich)在室温下反染2h。荧光图像是用荧光显微镜(dragonfly 200,andor,england)捕捉到的，并用image-pro plus(media cybernetics)进行量化。
[0091]
15、lfb和组织染色
[0092]
取eae和束缚小鼠的脑或脊髓，切成连续的石蜡切片(4lm)。采用luxol fast blue(lfb)试剂盒(servicebio，g1030)进行lfb染色。苏木素-伊红染色，切片在盐酸-乙醇中浸泡几秒钟，然后在1％氨水中浸泡几秒钟，然后放入伊拉克红染料中1-3分钟。最后用乙醇脱水5min，二甲苯透明处理5min。
[0093]
16、活性氧产生的测量
[0094]
应用活性氧类检测试剂盒检测细胞内活性氧的产生。用10μmol/l2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)在37℃的无血清培养基中培养20min。然后，用无血清培养基洗涤细胞三次。采用流式细胞仪(beckman coulter，kraemer boulevard brea，ca，usa)在488nm的激发波长和525nm的发射波长下对样品进行分析。
[0095]
17、线粒体膜电位测量
[0096]
根据制造商的说明书，用jc-1(mce，hy-k0601，monmouth junction,nj,usa)基质金属蛋白酶试剂盒测定线粒体膜电位的变化。简要地说，处理细胞收集和冲洗冷pbs一次。然后将细胞悬浮于200μl培养液和1μl jc-1染色液的混合液中，在37℃的黑暗条件下悬浮20min。然后用冷染色液冲洗细胞三次。jc-1可以作为胞浆jc-1单体存在，也可以作为线粒体j-聚集体存在，这取决于基质金属蛋白酶。相应处理后，用上述jc-1染色，荧光显微镜观察(n1-e,nikon,japan)。
[0097]
18、brdu
[0098]
将brdu(5-bromo-2-deoxyuridine，10μmol/l；sigma)加入培养基中，培养6小时后标记增殖细胞。细胞经4％pfa固定后，用1x pbs冲洗3次5min，用0.3％triton x-100渗透10min，然后在2n hcl中培养30min，用0.1mol/l硼酸钠中和25min。最后，细胞与初级抗brdu(1:100，sigma-aldrich)在4℃过夜培养，如上述免疫细胞荧光染色所示。
[0099]
19、统计分析
[0100]
资料分析采用单因素方差分析，多组采用tukey事后测验，两组采用t检验。使用非参数mann-whitney检验对eae模型进行分析，比较两组间的差异。数据表示为平均值
±
sem。p《0.05具有统计学意义。
[0101]
二、实验结果
[0102]
图1中的a图显示eae进展和干预的时间过程的示意图，图1中的临床评分、h&e染色、免疫荧光等结果显示，mgh2治疗能够显著减轻eae的进展。
[0103]
图2中的a图显示研究中使用的行为测试方案的示意图，治疗组小鼠在旷场实验(oft)中进入中心区域次数明显多于对照组，埋珠实验(mbt)没有明显差异，明暗箱实验(ldt)中治疗组小鼠在明场中探索时间更多，蔗糖偏好实验(spt)治疗组更偏好蔗糖水，而且悬尾实验(tst)中治疗组不动时间更少。说明治疗组小鼠焦虑、抑郁样行为表现比对照组更轻。mgh2可以显著改善eae小鼠的行为。
[0104]
图3结果可见各脑区治疗组小胶质细胞(iba1+细胞)和星形胶质细胞(gfap+细胞)都有所下降，即神经炎症降低。
[0105]
图4中的a图为24小时束缚应激模型，b图为示意图，显示行为测试在3个不同的组，以测试mgh2治疗的效果。图4结果显示，mgh2治疗改善24小时束缚诱发的抑郁样行为。
[0106]
图5结果显示，mgh2可减轻24小时束缚应激后海马和胼胝体的炎症反应。
[0107]
图6中的a图显示体外小胶质细胞极化研究的示意图。图6结果显示mgh2可以影响小胶质细胞的极化和抑制氧化应激。
[0108]
图7为体外mgh2浓度的确定。bv2在不同浓度的mgh2中的细胞活力。
[0109]
图8结果显示，脑白质髓鞘和轴突在24小时束缚应激后不发生改变。
[0110]
图9中的a图为海马不同区域的h&e染色的代表性脑切片。约束组和mgh2处理组海马和cc浸润细胞数量的定量分析结果显示，经24小时束缚应激后，mgh2处理可减少浸润细胞的数量。
[0111]
图10中的a图为体外培养opc功能研究的示意图，图10结果显示，mgh2处理不影响体外培养opcs的增殖，凋亡和分化。
[0112]
综上所述，纳米氢化镁通过抑制ms模型小鼠小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化，改善中枢神经系统脱髓鞘损伤情况，进而改善小鼠抑郁焦虑样行为，推测在人体亦或可以得到相同的效果，即纳米氢化镁抑制ms患者中枢神经系统小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化，进而改善此类患者的抑郁焦虑样表现。
[0113]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。

技术特征：
1.纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用，其特征在于，所述的纳米氢化镁通过抑制中枢神经系统小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化，并且通过抑制神经炎症反应改善患者的抑郁焦虑样表现。3.根据权利要求1所述的纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用，其特征在于，所述的炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状是指多发性硬化共病焦虑和抑郁症。4.根据权利要求1所述的纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用，其特征在于，所述的药物为口服制剂。5.纳米氢化镁在制备促进小胶质细胞转为m2极化状态的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的纳米氢化镁在制备促进小胶质细胞转为m2极化状态的药物中的应用，其特征在于，所述的纳米氢化镁通过抑制小胶质细胞m1极化，促进小胶质细胞m2极化。7.根据权利要求5所述的纳米氢化镁在制备促进小胶质细胞转为m2极化状态的药物中的应用，其特征在于，所述的促进小胶质细胞转为m2极化状态的药物是具备降低炎症，抑制氧化应激等神经保护作用的药物。8.纳米氢化镁在制备调节小胶质细胞极化及降低氧化应激水平的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的纳米氢化镁在制备调节小胶质细胞极化及降低氧化应激水平的药物中的应用，其特征在于，所述的纳米氢化镁降低小胶质细胞ros水平、减少线粒体损伤。

技术总结
本发明涉及医药技术领域，具体是纳米氢化镁在制备治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状的药物中的应用。本发明提供氢化镁在诱导和维持小胶质细胞选择性极化治疗炎症性脱髓鞘相关的焦虑-抑郁样症状中的应用。本发明还提供纳米氢化镁在制备促进小胶质细胞转为M2极化状态的药物中的应用。本发明研究发现新型药物氢化镁可以调节小胶质细胞极化及降低氧化应激水平，并且通过抗炎作用有效地改善EAE小鼠抑郁样表型，从而为多发性硬化共病抑郁症提供一种新的、安全的治疗选择。安全的治疗选择。


技术研发人员：曹莉 李政灏 张新 陈可夫 孙定亚 邵麒 俞仲望 程腾
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军军医大学
技术研发日：2022.10.09
技术公布日：2023/8/16