一种杂交鹅掌楸LhWUS基因及其表达蛋白和应用

一种杂交鹅掌楸lhwus基因及其表达蛋白和应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种杂交鹅掌楸lhwus基因及其表达蛋白和应用。


背景技术：

2.杂交鹅掌楸(liriodendron sino-americanum p.c.yieh ex shang et z.r.wang)是我国著名林木育种家叶培忠教授利用人工杂交育成的种间杂种，其生长速度比中国鹅掌楸快，杂种优势十分明显。成年杂种鹅掌楸树体高大，其树形美观、叶形呈马褂状，花大且鲜艳，具有较高的观赏价值，是一种适用于庭园栽培、道路绿化、荒山荒地造林等多种用途的优良树种。在美国，北美鹅掌楸木材大量用作装饰用材、工业胶合板面材或芯材、造纸等。杂交鹅掌楸具有许多优越性，生长速度快是其一特点，了解并深度探究其快速生长的机制，培育筛选生长速度快的鹅掌楸是极为需要的，并且具有重要的理论和实践价值。目前鹅掌楸基因组已经完成了测序和发布，为深度挖掘鹅掌楸重要性状的调控基因奠定了基础。
3.植物干细胞是植物器官发育的源泉，其产生的子细胞具有持续分裂能力并能进行自我更新，是顶端生长过程中必不可少的。wox转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族。wox家族基因具备调节植物干细胞分裂、分化、动态平衡和植物器官发育等的能力。wuschel(wus)属于wox基因家族，是植物顶端分生组织维持与发育的重要作用因子。wus能使它周围的细胞具有干细胞的特征，该基因的表达与干细胞的形成和器官的发生有密切关系。wus基因通过与转录阻遏物结合来抑制分化，在植物生长点(shootapical meristem，sam)调控方面具有重要作用，使茎端分生组织中的干细胞保持未分化状态，既能保持干细胞的多能性特征，又能维持分生组织的形态以及功能的完整，在植物器官和组织的生长过程中对干细胞的维持和分化的调控起到极为重要的作用。在模式植物拟南芥中已发现家族成员，且这些基因在茎和根顶端分生区多功能干细胞维持、侧生器官发育、花器官形成、胚细胞发育等方面承担重要角色。在模式植物拟南芥茎尖分生组织内，wus和clv(clavata)之间形成一个反馈调节环，参与调控茎顶端分生组织干细胞的发育并且维持顶端分生组织干细胞分化与去分化的动态平衡。除此之外，wus/wox基因家族被报道参与植物细胞分裂素、赤霉素和生长素的调控，而这些植物激素在植物细胞发育过程中发挥着重要作用。wus基因之间存在反馈抑制调节模式，证明了wus基因可以诱导顶端分生组织的细胞，而且能够诱导clv3基因表达。这些结果表明wus基因在决定和维持植物形态方面起着关键作用，因此对wus基因的研究对植株的生长以及发育具有重要的意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种杂交鹅掌楸lhwus基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述基因的表达蛋白。本发明最后所要解决的另一技术问题在于提供所述杂交鹅掌楸lhwus基因的具体应用。为了解决上
述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
5.一种杂交鹅掌楸lhwus基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.所述的杂交鹅掌楸lhwus基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.含有所述的杂交鹅掌楸lhwus基因的表达盒、载体、宿主菌或细胞系。
8.进一步地，所述的载体是植物表达载体。
9.进一步地，所述的植物表达载体是pbi121。
10.所述的杂交鹅掌楸lhwus基因在加快植物的生长发育的应用。
11.进一步地，所述的杂交鹅掌楸lhwus基因在加快植物的生长发育的应用，包括以下步骤：
12.1)构建杂交鹅掌楸lhwus基因的载体；
13.2)将所构建的杂交鹅掌楸lhwus基因的载体转化到植物中；
14.3)培育筛选得到生长速度更快的转基因植物。
15.进一步地，步骤2)中所述的将所构建的杂交鹅掌楸lhwus基因的载体转化到植物中的方法为农杆菌介导法。
16.进一步地，所述的应用中，所述植物为拟南芥和杂交鹅掌楸。
17.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
18.本发明前期已通过生物信息学工具对鹅掌楸wox家族序列进行分析，从鹅掌楸基因组数据库中选取了wus基因进行克隆，通过测序和同源比较，成功克隆出wus基因，并命名为lhwus。对克隆到的lhwus基因构建过表达载体，转化拟南芥验证其功能。将转lhwus基因的拟南芥植株和野生型植株同时放在相同生长环境中培养，表型观察发现转lhwus基因植株茎秆的高度和粗度均显著高于野生型拟南芥植株，转基因鹅掌楸与对照组相比，植株更高大，茎秆更粗壮，且叶面积更大，叶片展幅更大。上述结果表明lhwus基因可以加快拟南芥的生长发育能力，可见该基因在鹅掌楸和其它植物生产、育种中将有广泛的用途，本发明可应用于加快植物的生长发育，缩短植物的生长发育进程，因此本发明具有良好的应用前景。
附图说明
19.图1为lhwus基因pcr扩增产物图；注：m：marker dl2000；a：pcr产物；
20.图2为lhwus基因表达载体单克隆菌液pcr电泳结果图；注：m：marker dl2000；1-6：菌液pcr产物；
21.图3为lhwus基因表达载体质粒图谱图；
22.图4为转lhwus基因拟南芥植株pcr鉴定电泳结果图；注：m：marker dl2000；h2o：ddh2o；wt：野生型拟南芥dna；plasmid：质粒dna；1-9：转wus基因拟南芥植株dna；
23.图5转lhwus基因杂交鹅掌楸植株pcr鉴定电泳结果图；注：m：marker dl2000；h2o：ddh2o；wt：对照组鹅掌楸dna；plasmid：质粒dna；1-12：转wus基因杂交鹅掌楸植株dna；
24.图6为转lhwus基因拟南芥植株与野生型植株茎秆生长高度对比图，左：野生型拟南芥；右：转wus基因拟南芥；
25.图7为转lhwus基因拟南芥植株与野生型植株茎秆生长粗度对比图，左：野生型拟南芥；右：转wus基因拟南芥；
26.图8为转lhwus基因杂交鹅掌楸植株与对照组植株生长对比图左：对照组杂交鹅掌
strand cdna synthesis kit(+gdna wiper)。实验中rna使用量按照说明书最大量5μg，具体步骤如下：
36.1)rna模板变性：
37.在rnase-free离心管中配制如下混合液：2μl rnase-free ddh2o、6μl total rna。65℃，加热5min后，迅速置于冰上骤冷2min。
38.2)基因组dna的去除：8μl上一步的混合液、2μl 5
×
gdna wiper mix。移液器轻吹打混匀，42℃加热2min。
39.3)配制第一链cdna合成反应液：10μl上一步的混合液；2μl 10
×
rt mix；2μl hiscipt iii enzyme mix；1μl oligo(dt)20vn；5μl rnase-free ddh2o。用移液器轻吹打混匀。
40.4)按照下列反应条件进行第一链cdna合成反应：
41.37℃ 45min；85℃5sec；4℃∞。
42.产物可立即用于pcr反应，或在-20℃保存。
43.实施例2：克隆目的基因片段、片段回收、连接转化及测序
44.基于杂交鹅掌楸转录组数据中筛选的wus基因序列，利用oligo7.0设计引物，使用vazyme公司的max super-fidelity dna polymerase试剂进行pcr，从而获得目的基因lhwus，进行连接转化测序，最后进行比对分析。引物序列如下：
45.wus-c1-f：5
′‑
atggaacctcaacaaccgcagcagcagcta-3
′
，
46.wus-c1-r：5
′‑
tcacgtggagtcgggttctccagagtagga-3
′
。
47.1.pcr扩增体系：
48.使用的是vazyme公司的max super-fidelity dna polymerase试剂，依据说明书按下列组分配制pcr反应液，50μl反应体系：18μl ddh2o；25μl 2
×
phanta max buffera；1μl dntp mix(10mm each)；2μl上游引物(10μm)；2μl下游引物(10μm)；1μl cdna；1μl phanta max super-fidelity dna polymerase。
49.2.pcr反应条件：95℃3min；95℃15sec，63℃15sec，72℃ 30sec，35cycles；72℃5min；4℃∞。
50.3.目的基因片段回收
51.将pcr产物在1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，获得预期目的片段，结果如图1所示，使用tsingke公司的dna凝胶回收试剂盒，对目的片段进行回收纯化，步骤如下：1)在吸附柱ec中，加入250μl buffer bl，12000g离心1min，活化硅胶膜。2)在365nm长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的dna条带切下，尽量切除不含dna的凝胶，得到凝胶体积越小越好，将含有目的dna条带的凝胶放入2ml离心管中。3)加入500μl的buffer gl。4)65℃空气浴6min，每2min上下颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化，溶液呈淡黄色(若胶块体积较大，适当添加buffer gl至溶液呈淡黄色)。5)将溶液转入吸附柱ec中，12000g离心1min，弃废液，将吸附柱ec放回空收集管。6)在吸附柱ec中加入700μl buffer w2，12000g离心1min，弃废液；重复一次。7)将吸附柱ec放回空收集管中，12000g离心2min。8)取出吸附柱ec，放入干净的1.5ml离心管中，20～25℃开盖静置2min，在吸附柱膜中央部位加入50μl 65℃预热的eluent，20～25℃静置2min，12000g离心2min，可再洗脱一次提高产量。
52.4.目的基因片段连接、转化及测序
53.将目的基因片段与克隆载体pclone007 blunt vector kit(tsingke tsv-007b)，进行连接反应。10μl反应体系如下：3μl回收的目的片段、1μl pclone007 blunt vector、1μl 10
×
topo mix、5μl ddh2o。
54.所有溶液直接加入管中后，用移液器吸打混匀，室温(22-30℃)反应5min即可完成反应。
55.将连接产物转入大肠杆菌菌株中trelieftm5α(tsingke tsc01)。具体步骤如下：1)从-80℃超低温冰箱取出100μl感受态细胞，置于冰上融化，加入连接产物10ul，轻轻混匀，冰上静置5min；2)42℃水浴热激45s，迅速移至冰浴，静置2min；3)不加培养液取合适体积菌液直接涂布在含amp的lb固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。
56.检测重组质粒，将得到的阳性克隆进行测序分析。结果显示，lhwus基因编码区长度为798bp，包含完整的开放阅读框(orf)，序列如seq id no.1所示，所编码的蛋白序列如seq id no.2所示，含有265个氨基酸。
57.实施例3：表达载体构建
58.本发明所用大肠杆菌为dh5α(tiangen)；表达载体为pbi121。根据pbi121质粒图谱特点和wus基因编码区的特性，设计构建wus基因过表达质粒图谱(图2)具体过程如下：
59.1、通过同源重组技术构建lhwus基因过表达载体
60.以实施例1中获得的基因片段为模板，进行pcr扩增，引物序列如下：
61.lhwus-f：5
′‑
gagagaacacgggggactctagaatggaacctcaacaaccg-3
′
，
62.lhwus-r：5
′‑
gatcggggaaattcgagctccgtggagtcgggttct-3
′
。
63.50μl反应体系如下：2
×
phanta max buffera 25μl；dntp mix(10mm each)1μl；上游引物(10μm)2μl；下游引物(10μm)2μl；含有目的片段的质粒1μl；phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl；ddh2o 18μl。反应程序：预变性95℃，3min；95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；4℃，∞。对扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，获得目的片段。
64.2、pbi121载体质粒双酶切反应
65.使用xbai和saci限制性内切酶进行pbi121载体质粒双酶切反应，双酶切反应体系如下：1μg pbi121质粒、2μl cutsmart buffer、1μl xbai、1μl saci、ddh2o up to 20μl。
66.吸打混匀，37℃水浴，双酶切反应4h后，进行热失活反应。
67.3.重组反应
68.使用vazyme公司的ii one step cloning kit进行重组反应，于冰上配置以下反应体系：4μl pbi121质粒线性化片段，2μl wus基因回收片段，4μl 5
×
ce ii buffer，2μl exnase ii，8μl ddh2o。使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心收集管底。37℃反应30分钟(pcr仪)；反应结束降至4℃。
69.4.重组产物转化
70.使用tiangen公司的大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化：1)取感受态细胞置于冰浴中，2)向感受态细胞悬液中加入重组产物10μl，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。3)将离心管置于42℃水浴中放置90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管。4)向离心管中加入900μl无菌的lb培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，150rpm的摇床振荡培养45min，使菌体复苏。5)将离心管内容物混匀，4000rpm离心2分钟，弃
去部分培养液后悬浮菌液，涂布于含有卡那霉素的lb固体琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养16h。
71.5.阳性克隆筛选及测序
72.从筛选平板上挑取单菌落进行pcr检测及测序验证，使用vazyme公司的2x rapid taq master mix试剂进行pcr反应，25μl体系如下：8.5μl ddh2o，12.5μl 2x rapid taq master mix，1μl上游引物(10μm)，1μl下游引物(10μm)，2μl菌液。
73.反应程序：95℃，3min；95℃，15s，56℃，15s，72℃，1min，35个循环；72，5min，16℃，∞。菌液pcr检测为阳性的菌液(图3)，送至擎科生物公司(南京)测序鉴定，正确，获得含有lhwus基因的表达载体。
74.实施例4：wus基因通过农杆菌介导法转化拟南芥
75.1.冻融法转化农杆菌
76.采用液氮冻融法将构建好的lhwus过表达载体转入农杆菌菌株gv3101(唯地)构建转lhwus基因拟南芥植株。具体过程如下：1)冰浴融化农杆菌感受态细胞，每管加入1-5μl(100ng)回收纯化的重组质粒，轻吸打混匀，置于冰上，冰浴静置5min。2)液氮速冻5min，37℃热激5min，迅速置于冰上5min。3)加入700μl无抗生素的lb液体培养基，28℃，振荡培养2-4h。4)6000rpm离心1min收菌，吸去部分上清。5)留取适量菌液，轻轻混匀，涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基上。6)28℃倒置培养30-48h，至长出单菌落。7)菌液pcr检测阳性克隆，4℃保存备用。
77.2.拟南芥花序侵染
78.将pcr检测过的阳性单克隆菌液扩大培养，摇菌培养至od 0.6-0.8时，采用花序浸泡法将目的基因转入野生型拟南芥中。具体过程如下：1)将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用含有5％蔗糖的1/2ms溶液悬浮；2)在浸泡前，加入浓度为0.05％的silwetl-77，晃出泡沫；3)将拟南芥的地上部分未开放的花序在农杆菌悬浮溶液中浸泡15～30sec，期间轻轻晃动；4)将浸泡过的拟南芥平放至托盘上，用保鲜膜覆盖保湿，避光24h；5)取下保鲜膜，正常条件下培养至种子成熟，成熟后停止浇水。
79.3.t2代转基因拟南芥株系的获得
80.将pcr检测过的阳性单克隆菌液扩大培养，摇菌培养至od 0.6-0.8时，采用花序浸泡法将目的基因转入野生型拟南芥中。t1代拟南芥成熟后，收集种子并编号，将t1代种子和野生型拟南芥种子分别放入灭菌过的离心管中，先用灭菌水浸没清洗数次，再用1％的次氯酸钠消毒处理15min；静置后将上清液汲除，用无菌水清洗4-5次，再加入0.1％的琼脂糖，用移液枪将重悬的拟南芥种子点到含有卡那霉素的1/2ms固体培养基上培养；4℃低温春化72h，再移到光照培养箱中培养10d后，观察转基因植株和野生植株生长情况；选取生长状态良好的阳性转基因苗和拟南芥野生苗移栽到营养土中培养，培养两周后取叶片，提取dna，进行pcr检测(图4)，筛选阳性转化拟南芥植株，后续获得t2代转基因植株。表型观察结果显示(图6，图7)，转lhwus基因植株茎秆的高度和粗度均显著高于野生型拟南芥植株，由此表明过表达鹅掌楸lhwus基因可以加快拟南芥的生长发育。
81.实施例5wus基因通过农杆菌介导法转化杂交鹅掌楸
82.1.冻融法转化农杆菌
83.本发明使用的农杆菌菌株为eha105(唯地)，采用液氮冻融法将构建好的wus过表
达载体转入农杆菌。具体过程如下：1)冰浴融化农杆菌感受态细胞，每管加入1-5μl(100ng)回收纯化的重组质粒，轻吸打混匀，置于冰上，冰浴静置5min。2)液氮速冻5min，37℃热激5min，迅速置于冰上5min。3)加入700μl无抗生素的lb液体培养基，28℃，振荡培养2-4h。4)6000rpm离心1min收菌，吸去部分上清。5)留取适量菌液，轻轻混匀，涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基上。6)28℃倒置培养30-48h，至长出单菌落。7)菌液pcr检测阳性克隆，4℃保存备用。
84.2.农杆菌介导、通过体胚发生实现鹅掌楸植株遗传转化
85.挑含有目的基因的农杆菌单菌落，接种到5ml的lb液体培养基中，于28℃、180r/min振荡培养数小时后，以1：40扩大培养，扩大到所需od值即可，用一定体积的ms液体培养基重悬菌液，备用。取继代培养的杂交鹅掌楸愈伤组织放在含有as预培养培养基上培养数天，侵染时间根据愈伤生长状态调整，然后共培养；侵染后愈伤接着至于加cef和目的基因载体相对应的抗生素的培养基上培养，定期更换培养基，直至长出新愈伤。对愈伤进行pcr检测，筛选出pcr检测的阳性愈伤，并进行体胚诱导。体胚苗长至3-4cm高时，取叶片提取dna，进行pcr检测(图5)，筛选出阳性转化植株，并对转基因植株进行表型观察。
86.3.过表达wus基因的杂交鹅掌楸表型观察
87.表型观察结果显示(图8)，转lhwus基因的杂交鹅掌楸与对照组相比，植株更高大，茎秆更粗壮，且叶面积更大，叶片展幅更大，由此表明lhwus基因可以加快鹅掌楸的生长发育，过表达lhwus基因可缩短杂交鹅掌楸植株的生长发育进程。

技术特征：
1.一种杂交鹅掌楸lhwus基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸lhwus基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸lhwus基因的表达盒、载体、宿主菌或细胞系。4.根据权利要求3所述的含有杂交鹅掌楸lhwus基因的载体，其特征在于，所述的载体是植物表达载体。5.根据权利要求4所述的含有杂交鹅掌楸lhwus基因的载体，其特征在于，所述的植物表达载体是pbi121。6.权利要求1所述的杂交鹅掌楸lhwus基因在加快植物的生长发育中的应用。7.根据权利要求6所述的杂交鹅掌楸lhwus基因在加快植物的生长发育中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)构建杂交鹅掌楸lhwus基因的载体；2)将所构建的杂交鹅掌楸lhwus基因的载体转化到植物或植物细胞中；3)培育筛选得到生长速度更快的转基因植物。8.根据权利要求7所述的杂交鹅掌楸lhwus基因在加快植物的生长发育中的应用，其特征在于，步骤2)中所述的将所构建的杂交鹅掌楸lhwus基因的载体转化到植株中的方法为农杆菌介导法。9.根据权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或杂交鹅掌楸。

技术总结
本发明公开了一种杂交鹅掌楸LhWUS基因及其表达蛋白和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明基于杂交鹅掌楸转录组数据，克隆获得杂交鹅掌楸LhWUS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所表达蛋白如SEQ ID NO.2所示。将克隆的LhWUS基因构建过表达载体，转化拟南芥获得T2代种子，表型观察表明过表达LhWUS基因可以加快植株的生长发育，在杂交鹅掌楸中过表达LhWUS基因也可缩短植株的生长发育进程，可见该基因在鹅掌楸和其它植物生产、育种中将有广泛的用途。本发明可应用于缩短植物的生长发育进程，并进一步在植物生长发育中有较广泛的应用，因此本发明具有良好的应用前景。因此本发明具有良好的应用前景。因此本发明具有良好的应用前景。


技术研发人员：陈金慧 刘思芹 施季森 郝兆东 成铁龙 陆叶
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2022.09.16
技术公布日：2023/8/16