选自19种microRNA亚型作为生物标志物的肝癌检测的制作方法

选自19种microrna亚型作为生物标志物的肝癌检测
技术领域
1.本发明涉及利用微小核糖核酸作为生物标志物的癌症检测领域。具体地，本发明涉及一种由血浆microrna亚型组合、afp蛋白和/或dcp蛋白的组合中的一种或多种标志物作为肝癌标志物以及相应的诊断肝癌、特别是早期肝癌的新试剂和新方法。更具体的，所述的microrna亚型组合包含11个家族(mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p)中的19个亚型的一个或多个。


背景技术：

2.原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是全世界最常见的恶性肿瘤之一，也是慢性肝病患者最常见的死亡原因，是我国癌症死因的第二位，严重威胁我国人民的生命和健康(sung et al.,2021)。
3.明确的肝癌诊断经常需要以组织学确认为基础，组织可以通过针穿刺或活检来取样。肝穿刺或活检的最常见的风险是出血，因为肝癌肿瘤内通常含有丰富的血管。在很多情况下，一般不必要进行组织活检或者穿刺。
4.肝癌长期生存率低的主要原因，在于肝癌高危人群的筛查没有大规模普及，早期诊断率低，导致70％～80％的患者在确诊时就已经是中晚期，如果能够早期发现和早期诊断，可以施行肝切除术和肝移植等根治性治疗手段，可以明显改善肝癌患者的预后。
5.目前对于原发性肝癌的常规筛查和监测指标主要包括血清甲胎蛋白(afp)和肝脏超声检查。中国临床肿瘤学会(csco)发布的《原发性肝癌诊疗指南(2020)》指出“afp阳性是指afp≥400ng/ml，且排除慢性或者活动性乙肝、肝硬化、睾丸或卵巢胚胎源性肿瘤以及妊娠等，高度怀疑肝癌”，但是在实际诊疗过程中发现，有约30％的肝癌患者血清afp始终为阴性，而且在一些慢性乙肝、肝硬化等肝癌的高危人群中afp也会升高。afp筛查诊断肝癌的敏感性在25％～65％左右,特异性在80％～94％左右。在而在肝癌早期检测性能更低。dcp又称pivka-ii，是伴随肝癌特异产生的异常凝血酶原。有研究报道，dcp≥40mau/ml诊断早期肝癌的灵敏度和特异性分别为64％和89％，在极早期(bclc 0期)和早期(bclc a期)肝癌汇总，dcp检出肝癌的比例分别为55.6％和61.1％。因此，开发比afp蛋白与dcp蛋白更为准确的肝癌诊断标志物具有较大的临床实际意义。
6.microrna(mirna)是一类小的内源性非编码rna分子，大小为17-25个核苷酸。这些mirna通常可以靶向一个或者多个mrna，通过翻译水平的抑制或者断裂靶标mrna来调节基因的表达。mirna比mrna在作为肿瘤标志物方面具有更大的优势，因为他们通常更为稳定。
7.mirna是从pri-mirna产生的，pri-mirna被rnase iii drosha加工为含有茎环结构的前体mirna，然后在dicer的作用下，前体mirna在细胞质中被进一步切割产生成熟的mirna。microrna在成熟过程中会产生iso-mirnas(mirna亚型)，根据位置不同可以分为3’、5’和中间的突变类型三类。iso-mirnas产生的机制大概有两种，一种是drosha或者dicer酶在microrna成熟过程中切割位置偏移导致的；另一种是转录后修饰产生的。有研究表明
iso-mirnas在稳定性和表达丰度等与成熟microrna都有不同，也会调控不同的下游信号途径。
8.在之前的多项研究或专利中，已经有人报道了与癌症相关的microrna的表达差异，但这些研究或专利受限于检测技术或实验设计，绝大部分都仅限于对家族水平的microrna进行检测，没有对同一家族下的不同iso-mirna进行区分。
9.高通量测序技术为研究iso-mirna提供了强有力的工具，随着测序技术的更新发展，可以在相对较短的时间和可控的成本下，获得样本中的全iso-mirna表达谱。目前，已经发现了很多人类疾病的致病机制与iso-mirna有关，如胶质瘤、妊娠毒血症、亨廷顿舞蹈症、血脂异常、ii型糖尿病和癌症等。已报道的iso-mirna在人类癌症中的表达失调突出了这些生物分子作为诊断或预后生物标志物的潜在应用价值。但是，这些研究存在着部分缺陷，比如筛选的iso-mirna数量有限，实验的样本量小或者缺乏独立的验证实验。因此，在hcc患者的血液中发现具有诊断价值的iso-mirna生物标志物，利用这些生物标志物联合应用来准确的诊断早期肝癌患者，是一个未被满足的医疗需求。
10.本发明建立在iso-mirnas水平上，鉴定出成熟microrna的亚型，并且计算出其原始表达丰度，建立模型筛选出了可以作为肝癌标志物的iso-mirna，并与afp蛋白和dcp蛋白联合作为新的肝癌诊断标志物。
11.相关文献可参考：
12.1.sung,h.,ferlay,j.,siegel,r.l.,laversanne,m.,soerjomataram,i.,jemal,a.,&bray,f.(2021).global cancer statistics 2020:globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in 185countries.ca:a cancer journal for clinicians,71(3),209-249.
13.2.allemani c,matsuda t,di carlo v,harewood r,matz m,m,bonaventure a,valkov m,johnson cj,est
è
ve j,ogunbiyi oj,azevedo e silva g,chen wq,eser s,engholm g,stiller ca,monnereau a,woods rr,visser o,lim gh,aitken j,weir hk,coleman mp；concord working group.global surveillance of trends in cancer survival 2000-14(concord-3):analysis of individual records for 37 513 025patients diagnosed with one of 18cancers from322population-based registries in 71countries.lancet.2018mar17；391(10125):1023-1075.


技术实现要素：

14.具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。
15.1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p的一个或多个mirna的检测试剂。
16.2.根据项1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，或至少11个mirna的检测试剂。
17.3.根据项1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p,
mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的检测试剂。
18.4.根据项1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的一个或多个mirna的检测试剂。
19.5.根据项1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个mirna的检测试剂。
20.6.根据项1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的mirna检测试剂。
21.7.根据项1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测所述一个或多个mirna的亚型的检测试剂。
22.8.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mirna亚型的检测试剂。
23.9.根据项7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p亚型的检测试剂；优选地，所述mir-let-7b-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:1和seq id no:2。
24.10.根据项7-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-144-3p亚型的检测试剂；优选地，所述mir-144-3p亚型有两个，其序列分别为seq id no:5和seq id no:6。
25.11.根据项7-10任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-15a-5p亚型的检测试剂；优选地，所述mir-15a-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:8和seq id no:9。
26.12.根据项7-11任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-451a亚型的检测试剂；优选地，所述mir-451a亚型有两个，三个，四个，五个或六个，其序列分别选自seq id no:13-18；优选地，所述mir-451a亚型包含seq id no:14,seq id no:16,seq id no:17和seq id no:18。
27.13.根据项7-12任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自seq id no:1-9,11-12,14和16-18的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或全部15个mirna的检测试剂；优选地，包含检测seq id no:1-9,11-12,14和16-18的全部15个mirna的检测试剂。
28.14.根据项7-13任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自seq id no:1-19的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或全部19个mirna检测试剂。
29.15.根据项1-14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述mirna检测试剂是用于第
二代测序的检测试剂。
30.16.根据项1-15任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的mirna提取试剂。
31.17.根据项1-16任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测甲胎蛋白(afp)的检测试剂。
32.18.根据项1-17任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测异常凝血酶原(dcp)的检测试剂。
33.19.根据项17或18所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白检测试剂是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式荧光法的一种或多种检测的检测试剂；优选地，所述蛋白检测试剂是用于流式荧光法的检测试剂。
34.20.根据项17-19任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的蛋白提取试剂。
35.21.根据项1-20任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌(bclc a期)或极早期肝癌(bclc 0期)。
36.22.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含检测样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p的一个或多个mirna的浓度。
37.23.根据项22所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，或至少11个mirna的浓度。
38.24.根据项22所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的浓度。
39.25.根据项22-24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的一个或多个mirna的浓度。
40.26.根据项22-24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个mirna的浓度。
41.27.根据项22-24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的浓度。
42.28.根据项22-27任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的所述一个或多个mirna的亚型的浓度。
43.29.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含检测样本中的mirna亚型的浓度。
44.30.根据项28或29所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-let-7b-5p亚
型的浓度；优选地，所述mir-let-7b-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:1和seq id no:2。
45.31.根据项28-30任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-144-3p亚型的浓度；优选地，所述mir-144-3p亚型有两个，其序列分别为seq id no:5和seq id no:6。
46.32.根据项28-31任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-15a-5p亚型的浓度；优选地，所述mir-15a-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:8和seq id no:9。
47.33.根据项28-32任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-451a亚型的浓度；优选地，所述mir-451a亚型有两个，三个，四个，五个或六个，其序列分别选自seq id no:13-18；优选地，所述mir-451a亚型包含seq id no:14,seq id no:16,seq id no:17和seq id no:18。
48.34.根据项28-33任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测选自seq id no:1-9,11-12,14和16-18的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或全部15个mirna的浓度；优选地，包含检测seq id no:1-9,11-12,14和16-18的全部15个mirna的浓度。
49.35.根据项28-34任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测选自seq id no:1-19的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或全部19个mirna的浓度。
50.36.根据项22-35任一项所述的方法，其特征在于，所述mirna浓度的检测是用第二代测序的检测方法。
51.37.根据项22-36任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括针对血浆或血清样本的mirna提取。
52.38.根据项22-37任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测甲胎蛋白(afp)的浓度。
53.39.根据项22-38任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测异常凝血酶原(dcp)的浓度。
54.40.根据项38或39所述的方法，其特征在于，所述蛋白检测是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式荧光法的一种或多种方法检测；优选地，用流式荧光法检测。
55.41.根据项38-40任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括针对血浆或血清样本的蛋白提取。
56.42.根据项22-41任一项所述的方法，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌(bclc a期)或极早期肝癌(bclc 0期)。
57.43.根据项22-42任一项所述的方法，其特征在于，所述样本为血浆或血清样本。
58.44.根据项22-43任一项所述的方法，其特征在于，所述样本的afp蛋白浓度小于20ng/ml。
59.45.根据项22-44任一项所述的方法，其特征在于，所述样本的dcp蛋白浓度小于40mau/ml。
60.46.根据项22-45任一项所述的方法，其特征在于，所述样本与对照样本相比，选自let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgagtt(seq id no:13))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))，或其任意组合的iso-mirna的单位浓度/含量上调；可选地，其单位浓度/含量比对照样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
61.47.根据项46所述的方法，其特征在于，所述对照样本为正常人的样本，或所述对照样本为无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本。
62.48.根据项22-47任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含一个回归模型或者随机森林模型；可选地，所述回归模型是：分数(score)＝03326098177036255*dcp+0.042144370918784584*afp+0.14156146908461528*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))+0.007842422227289102*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))+0.01689391781488717*mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))-0.008460932914774653*mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))+0.0030534457929552086*let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))+0.09595159865376575*mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))+0.19985985511080592*mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))+2.151539105584064*mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))+0.024563672095013485*mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))+2.9356127524420734*mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))+0.09961643177138646*mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))+0.5793208271327767*mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))+0.04683039647479648*let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))+1.7704820604928486*mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))+0.025941348791831433*mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))-0.9013556106043934，所述样本的分数(score)比对照样本的分数(score)高时判定为肝癌。
63.本发明的一方面，提供了一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p的一个或多个mirna的检测试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，或至少11个mirna的检测试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的检测试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的一个或多个mirna的检测试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个mirna的检测试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的mirna检测试剂。
64.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测所述一个或多个mirna的亚型的检测试剂。本发明的一方面，提供了一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mirna亚型的检测试剂。
65.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p亚型的检测试剂。在一些实施例中，所述mir-let-7b-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:1和seq id no:2。
66.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mir-144-3p亚型的检测试剂。在一些实施例中，所述mir-144-3p亚型有两个，其序列分别为seq id no:5和seq id no:6。
67.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mir-15a-5p亚型的检测试剂。在一些实施例中，所述mir-15a-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:8和seq id no:9。
68.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测mir-451a亚型的检测试剂。在一些实施例中，所述mir-451a亚型有两个，三个，四个，五个或六个，其序列分别选自seq id no:13-18。在一些实施例中，所述mir-451a亚型包含seq id no:14,seq id no:16,seq id no:17和seq id no:18。
69.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测选自seq id no:1-9,11-12,14和16-18的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或全部15个mirna的检测试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含检测seq id no:1-9,11-12,14和16-18的全部15个mirna的检测试剂。
70.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测选自seq id no:1-19的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或全部19个mirna检测试剂。
71.在一些实施例中，mirna检测试剂是用于第二代测序的检测试剂。
72.在一些实施例中，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的mirna提取试剂。
73.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测甲胎蛋白(afp)的检测试剂。
74.在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测异常凝血酶原(dcp)的检测试剂。
75.在一些实施例中，蛋白检测试剂是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式荧光法的一种或多种检测的检测试剂。在一些实施例中，蛋白检测试剂是用于流式荧光法的检测试剂。
76.在一些实施例中，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的蛋白提取试剂。
77.在一些实施例中，所述肝癌为早期肝癌(bclc a期)或极早期肝癌(bclc0期)。
78.本发明的一方面，提供了一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含检测样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p的一个或多个mirna的浓度。在一些实施例中，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，或至少11个mirna的浓度。在一些实施例中，所述方法包含检测所述样本中的mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的浓度。在一些实施例中，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的一个或多个mirna的浓度。在一些实施例中，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个mirna的浓度。在一些实施例中，所述方法包含检测所述样本中的mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的浓度。
79.在一些实施例中，所述方法包含检测所述样本中的所述一个或多个mirna的亚型的浓度。本发明的一方面，提供了一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含检测样本中的mirna亚型的浓度。
80.在一些实施例中，所述方法包含检测mir-let-7b-5p亚型的浓度。在一些实施例中，所述mir-let-7b-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:1和seq id no:2。
81.在一些实施例中，所述方法包含检测mir-144-3p亚型的浓度。在一些实施例中，所述mir-144-3p亚型有两个，其序列分别为seq id no:5和seq id no:6。
82.在一些实施例中，所述方法包含检测mir-15a-5p亚型的浓度。在一些实施例中，所述mir-15a-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:8和seq id no:9。
83.在一些实施例中，所述方法包含检测mir-451a亚型的浓度。在一些实施例中，所述mir-451a亚型有两个，三个，四个，五个或六个，其序列分别选自seq id no:13-18。在一些实施例中，所述mir-451a亚型包含seq id no:14,seq id no:16,seq id no:17和seq id no:18。
84.在一些实施例中，所述方法包含检测选自seq id no:1-9,11-12,14和16-18的至
少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或全部15个mirna的浓度。在一些实施例中，所述方法包含检测seq id no:1-9,11-12,14和16-18的全部15个mirna的浓度。
85.在一些实施例中，所述方法包含检测选自seq id no:1-19的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或全部19个mirna的浓度。
86.在一些实施例中，mirna浓度的检测是用第二代测序的检测方法。
87.在一些实施例中，所述方法还包括针对血浆或血清样本的mirna提取。
88.在一些实施例中，所述方法包含检测甲胎蛋白(afp)的浓度。
89.在一些实施例中，所述方法包含检测异常凝血酶原(dcp)的浓度。
90.在一些实施例中，蛋白检测是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式荧光法的一种或多种方法检测。在一些实施例中，蛋白检测是用流式荧光法检测。
91.在一些实施例中，所述方法还包括针对血浆或血清样本的蛋白提取。
92.在一些实施例中，所述肝癌为早期肝癌(bclc a期)或极早期肝癌(bclc0期)。
93.在一些实施例中，所述样本为血浆或血清样本。
94.在一些实施例中，所述样本的afp蛋白浓度小于20ng/ml。
95.在一些实施例中，所述样本的dcp蛋白浓度小于40mau/ml。
96.在一些实施例中，所述样本与对照样本相比，选自let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgagtt(seq id no:13))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))，或其任意组合的iso-mirna的单位浓度/含量上调。在一些实施例中，所述iso-mirna的单位浓度/含量比对照样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。在一些实施例中，所述对照样本为正常人的样本。在一些实施例中，所述对照样本为无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本。
97.在一些实施例中，所述方法包含一个回归模型或者随机森林模型；可选地，所述回归模型是：分数(score)＝03326098177036255*dcp+0.042144370918784584*afp+0.14156146908461528*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))+
0.007842422227289102*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))+0.01689391781488717*mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))-0.008460932914774653*mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))+0.0030534457929552086*let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))+0.09595159865376575*mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))+0.19985985511080592*mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))+2.151539105584064*mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))+0.024563672095013485*mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))+2.9356127524420734*mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq idno:14))+0.09961643177138646*mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))+0.5793208271327767*mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))+0.04683039647479648*let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))+1.7704820604928486*mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))+0.025941348791831433*mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))-0.9013556106043934，所述样本的分数(score)比对照样本的分数(score)高时判定为肝癌。
附图说明
98.图1为本发明用于鉴定至少一个肝细胞癌目标血浆，特别是存在极早期肝癌(bclc 0期)和早期肝癌(bclc a期)的iso-mirna组合的筛选，蛋白检测，模型训练和模型验证阶段的实验设计流程图。
99.图2为确定本发明用于诊断肝细胞癌，特别是极早期肝癌(bclc 0期)和早期肝癌(bclc a期)患者的血液中的iso-mirna和afp蛋白与dcp蛋白联合组成的肝癌标志物的主要方法步骤图，其中对照组包括了健康人，慢性肝炎和肝硬化患者。
100.图3说明了包含本发明用于确定至少一个肝细胞肝癌目标血浆的优选iso-mirna组合(mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7)))，与afp蛋白和dcp蛋白联合检测的线性回归模型的诊断性能。
101.a图面为训练集(n＝598)中肝细胞癌组与对照组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.868)相比，含有iso-mirna组合的模型
在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.960)。
102.b图面为验证集中(n＝469)中肝细胞癌组与对照组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.850)相比，含有iso-mirna组合的模型在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.969)。
103.图4说明了包含本发明用于进一步区分肝细胞癌患者血浆和健康人、肝炎患者和肝硬化患者的血浆的优选iso-mirna组合(mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa (seq id no:3))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7)))，与afp蛋白和dcp蛋白联合检测的线性回归模型的诊断性能。
104.a图面为验证集(n＝598)中肝细胞癌组与健康人组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.858)相比，含有iso-mirna组合的模型在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.979)。
105.b图面为验证集中(n＝469)中肝细胞癌组与肝炎患者组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.857)相比，含有iso-mirna组合的模型在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.966)。
106.c图面为验证集(n＝469)中肝细胞癌组与肝硬化患者组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.819)相比，含有iso-mirna组合的模型在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.969)。
107.图5说明了包含本发明用于进一步区分不同bclc分期的至少一个目标血浆的优选iso-mirna组合(mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7)))，与afp蛋白和dcp蛋白联合检测的线性回归模型的诊断性能。
id no:2))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7)))，与afp蛋白和dcp蛋白联合检测的线性回归模型的诊断性能。
114.a图面为验证集(n＝469)中dcp＜40mau/ml的血浆样本与对照组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.606)相比，含有iso-mirna组合的模型在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.943)。
115.b图面为验证集中(n＝469)中dcp≥40mau/ml的血浆样本与对照组比较时含有iso-mirna组合的诊断性能的roc曲线图。与afp和dcp联合检测(auc＝0.833)相比，含有iso-mirna组合的模型在区分肝细胞癌组血浆和对照组血浆时具有显著高的诊断准确性(auc＝0.967)。
116.图8说明了包含不同数量的本发明的优选iso-mirna组合(mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7)))，与afp蛋白和dcp蛋白联合检测时的线性回归模型的诊断性能。
117.发明详述
118.本发明的目的之一为提供基于mirna标志物组合诊断肝癌的方法及试剂盒。为解决现有早期肝癌诊断技术中存在的灵敏度低的不足之处，本发明提供了一种包含mirna检测的产品，以及mirna特征标记在制备肝癌筛查及诊断试剂或试剂盒中的应用。在一些实施例中，其产品包含用于检测mirna含量的引物、探针、检测试剂及试剂盒。在一些实施例中，通过从血浆样本中提取并检测一个或多个mirna的表达水平，能够判断待检个体是否患有肝癌。本方法安全、无创，且具有较高的灵敏度和特异性，能够有效地用于肝癌早期诊断。
119.本发明的一方面，依据如下发现为基础，即基于具有高诊断准确度的肝细胞癌诊断标志物，肝细胞癌是可以被可靠的区分和诊断的。具体的，这里定义的肝癌诊断标志物包含表达量被上调和下调的人类mirna亚型的组合。在一些实施例中，标志物还包含afp蛋白和/或dcp蛋白。在一些实施例中，通过分析血浆样本中mirna亚型整体的表达模式和/或单个mirna亚型的表达模式，联合检测afp蛋白和dcp蛋白，所述的肝癌诊断标志物可以在极早期(bclc 0期)或者早期(bclc a期)诊断肝细胞癌，使得肝细胞癌患者的血浆与健康人、肝炎患者以及肝硬化患者的血浆被区分开来。
120.本发明的一方面，提供了一种新的肝细胞癌(特别是极早期肝细胞癌(bclc 0期)和早期肝细胞癌(bclc a期))的标志物，从而提供一种新的肝细胞癌诊断方法。
121.本发明的一方面，提供了一类肝细胞癌诊断标志物，其包含一个或多个iso-mirna分子的组合。在一些实施例中，所述标志物还包含afp蛋白。在一些实施例中，所述标志物还包含dcp蛋白。
122.本发明的一方面，提供了一种确定肝癌诊断标志物的方法，其包含检测一个或多个iso-mirna。在一些实施例中，还包含检测afp蛋白。在一些实施例中，还包含检测dcp蛋白。
123.本发明的一方面，提供了一种检测肝癌的方法。在一些实施例中，所述方法包括比对在目标血浆和对照血浆中的一个或多个iso-mirna的表达水平，从而检测肝癌。在一些实施例中，所述方法包括检测目标血浆的一个或多个iso-mirna的表达水平，通过与对照表达值的比对从而检测肝癌。
124.本发明的一方面，提供了一种用来计算肝癌患病风险的软件，其特征在于，利用对本文所述的各个生物标志物的测定数值来计算肝癌患病风险。
125.本发明的一方面，提供了一种用于诊断肝细胞癌(例如极早期肝细胞癌(bclc 0期)或早期肝细胞癌(bclc a期))的试剂盒。
126.本发明的一方面，提供了一种用于区分肝细胞癌患者(例如极早期肝细胞癌(bclc 0期)或早期肝细胞癌(bclc a期))的血浆和健康人血浆的试剂盒。
127.本发明的一方面，提供了一种用于区分肝细胞癌患者(例如极早期肝细胞癌(bclc 0期)或早期肝细胞癌(bclc a期))的血浆和肝炎患者血浆的试剂盒。
128.本发明的一方面，提供了一种用于区分肝细胞癌患者(例如极早期肝细胞癌(bclc 0期)或早期肝细胞癌(bclc a期))的血浆和肝硬化患者血浆的试剂盒。
129.本发明的一方面，提供了一种用于肝细胞癌诊断的试剂盒，其包含检测一个或多个iso-mirna的试剂。在一些实施例中，还包含检测afp蛋白的试剂。在一些实施例中，还包含检测dcp蛋白的试剂。
130.在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna包含选自表1的iso-mirna。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna包含选自表1中的1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，或19个iso-mirna。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna包含选自表1中的至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或至少19个iso-mirna。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna包含选自表1中的至多1个，至多2个，至多3个，至多4个，至多5个，至多6个，至多7个，至多8个，至多9个，至多10个，至多11个，至多12个，至多13个，至多14个，至多15个，至多16个，至多17个，至多18个，或至多19个iso-mirna。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna包含表1的全部19个iso-mirna。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna包含表1中的seq id no:1-9,11-12,14和16-18这15个iso-mirna。
131.表1：各个mirna亚型及其序列
132.所属mirna家族mirna亚型(iso-mirna)序列核酸序列号let-7b-5ptgaggtagtaggttgtgtggttseqidno:1let-7b-5ptagtaggttgtgtggttseqidno:2
mir-101-3ptacagtactgtgataactgaaaseqidno:3mir-130a-3pcagtgcaatgttaaaagggcacseqidno:4mir-144-3ptacagtatagatgatgtacttseqidno:5mir-144-3ptacagtatagatgatgseqidno:6mir-145-5pttttcccaggaatcccseqidno:7mir-15a-5ptagcagcacataatggtttgtgseqidno:8mir-15a-5ptaggagcacataatggtttgtgseqidno:9mir-18a-5paaggtgcatctagtgcagatseqidno:10mir-191-5paacggaatcccaaaagcagctseqidno:11mir-223-3ptttgtcaaataccccaseqidno:12hsa-mir-451aaaaccgttaccattactgagttseqidno:13hsa-mir-451acgttactattactgagttseqidno:14hsa-mir-451aattaccattactgagttseqidno:15hsa-mir-451acgttaccattactgatttseqidno:16hsa-mir-451aaaccgttaccattactgagttseqidno:17hsa-mir-451aaaaccgttaccattactgatttseqidno:18mir-652-3paatggcgccactagggttgtgseqidno:19
133.在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna分子在肝癌患者的血浆中与在无肝癌个体的对照血浆中存在表达差异。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna分子在肝癌患者的血浆中与对照血浆相比，表达量上调。在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna分子在肝癌患者的血浆中与对照血浆相比，表达量下调。
134.在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna分子在肝癌患者的血浆中与对照血浆相比，表达量上调，所述的iso-mirna分子选自let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgagtt(seq id no:13))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))，和其任意组合。在一些实施例中，所述的对照血浆来自健康人、肝炎患者或者肝硬化患者。
135.在一些实施例中，所述的肝细胞癌为极早期肝癌(bclc 0期)或者早期肝癌(bclc a期)。
136.在一些实施例中，为了避免扩增产生的误差，还可设置内参和/或外参。
137.在一些实施例中，所述的试剂盒中还包括：特异性检测内参基因和外参基因的检测试剂.在一些实施例中，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人hsa-mir-16-5p的逆转录引物、扩增引物和探针。在一些实施例中，所述的特异性检测外参基因的检测试剂是针对人cel-mir-39-5p的逆转录引物、扩增引物和探针。
138.在一些实施例中，针对每一mirna或内参的探针连接有特定的荧光基团。
139.在一些实施例中，该试剂盒中还包括：阴性质控品和/或阳性质控品。
140.在一些实施例中，该试剂盒中还包括：rna提取试剂，逆转录反应试剂，pcr扩增试剂和/或使用说明书。
141.在一些实施例中，所述的检测试剂是rna逆转录引物、dna扩增引物和dna探针。
142.在一些实施例中，所述的试剂盒中还可包含rna提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、无rna酶的纯水、阴性质控品、阳性质控品等。
143.可选的，所述用于提取rna的试剂为trizol试剂、磁珠法抽提rna所用的试剂、柱法抽提rna所用的试剂。
144.在一些实施例中，所述的试剂盒中逆转录试剂包括：检测所述mirna组合中的各mirna的逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系。
145.所述逆转录酶可以为m-mlv逆转录酶或amv逆转录酶。
146.所述逆转录反应体系可以包括：逆转录缓冲液、dntps、无rna酶的纯水，rna酶抑制剂，及对照或提取出的rna。
147.在一些实施例中，所述的核酸扩增试剂可以包括：正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核酸扩增反应体系。
148.所述核酸扩增酶可以为dna扩增酶；
149.所述定量核酸扩增反应体系可以包括定量缓冲液、dntps、纯水，及逆转录得到的cdna。
150.在一些实施例中，所述的阴性质控品可以为正常人血浆、无肝癌的慢性乙肝患者血浆、牛血清白蛋白溶液或生理盐水溶液；阳性质控品可以为经过测定为阳性的早期肝癌患者血浆，或为特定拷贝数的mirna寡核苷酸。
151.在一些实施例中，所检测的样本可选自组织、全血、血浆、血清、尿液和粪便。优选地，所述的样本选自组织、全血、血浆和血清；更优选地，所述样本选自血浆或血清。
152.本发明还进一步提供了肝脏肿瘤诊断相关血浆小分子核酸的检测方法，包括以下步骤：
153.(1)血浆标本中rna的提取：
154.取待测病人血浆、阴性对照血浆、阳性对照血浆、合成的外参基因的mimic，按照所选用的rna抽提试剂盒的标准操作方法，或使用的核酸抽提试剂盒的说明书，抽提血浆标本中的rna；
155.(2)用上述试剂盒进行检测：
156.对内参、外参和所述mirna组合同时进行定量测定。将提取的rna加入至预混合的含有逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系的反应管中，进行逆转录；然后使用cdna加入至含有正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核酸扩增反应体系的定量核
酸扩增反应管中，进行扩增，使用荧光定量pcr检测仪进行检测。
157.(3)通过模型联合分析循环系统中多个特定的小分子核酸，用以判断肝癌发生的可行性。
158.在一些实施例中，所述的检测还包括一个线性回归模型或者随机森林模型。
159.在一些实施例中，回归模型的公式如下：
160.score＝03326098177036255*dcp+0.042144370918784584*afp+0.14156146908461528*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))+0.007842422227289102*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))+0.01689391781488717*mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))-0.008460932914774653*mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))+0.0030534457929552086*let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))+0.09595159865376575*mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))+0.19985985511080592*mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))+2.151539105584064*mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))+0.024563672095013485*mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa (seq id no:3))+2.9356127524420734*mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))+0.09961643177138646*mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))+0.5793208271327767*mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))+0.04683039647479648*let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))+1.7704820604928486*mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))+0.025941348791831433*mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))-0.9013556106043934
161.模型中的score分数在至少一种肝癌血浆中的值相对于至少一种对照血浆中的值相比被上调。
162.在一些实施例中，所述的一个或多个iso-mirna分子在肝癌患者的血浆中与对照血浆相比，表达量上调，所述的iso-mirna分子选自let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgagtt(seq id no:13))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))，和其任意组合。
no:7))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
178.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
179.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
180.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
181.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
182.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
183.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，
id no:14))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
191.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
192.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
193.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
194.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
195.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
196.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少
200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
197.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
198.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
199.在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
200.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
201.在一些实施例中，肝癌样本中的mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
202.在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(afp)的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(afp)的单位浓度/含量比正常样本中的甲胎蛋白(afp)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
203.在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(afp)的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(afp)的单位浓度/
含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本中的甲胎蛋白(afp)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
204.在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(dcp)的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(dcp)的单位浓度/含量比正常样本中的异常凝血酶原(dcp)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
205.在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(dcp)的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(dcp)的单位浓度/含量比无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本中的异常凝血酶原(dcp)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
206.在一些实施例中，肝癌分期采用巴塞罗那肝癌临床分期系统(barcelona clinic liver cancer(bclc)，见下方表a)。在一些实施例中，所述早期肝癌包括巴塞罗那分期的a期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括巴塞罗那分期的0期和a期。
207.表a：巴塞罗那肝癌临床分期
[0208][0209]
在一些实施例中，肝癌分期采用中国肝癌的分期方案(china liver cancer staging，cnlc)，包括：cnlcⅰa期、ⅰb期、ⅱa期、ⅱb期、ⅲa期、ⅲb期、ⅳ期，具体如下：
[0210]
cnlcⅰa期：体力活动状态(performance status，ps)评分0～2分，肝功能child-pugh a/b级，单个肿瘤、直径≤5cm，无血管侵犯和肝外转移。
[0211]
cnlcⅰb期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，单个肿瘤、直径＞5cm，或2～3个肿瘤、最大直径≤3cm，无血管侵犯和肝外转移。
[0212]
cnlcⅱa期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，2～3个肿瘤、最大直径＞3cm，
无血管侵犯和肝外转移。
[0213]
cnlcⅱb期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，肿瘤数目≥4个、肿瘤直径不论，无血管侵犯和肝外转移。
[0214]
cnlcⅲa期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，肿瘤情况不论、有血管侵犯而无肝外转移。
[0215]
cnlcⅲb期：ps 0～2分，肝功能child-pugh a/b级，肿瘤情况不论、血管侵犯不论、有肝外转移。
[0216]
cnlcⅳ期：ps 3～4，或肝功能child-pugh c级，肿瘤情况不论、血管侵犯不论、肝外转移不论。
[0217]
在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(cnlc)的ⅰa期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(cnlc)的ⅰb期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(cnlc)的ⅰa期和ⅰb期。
[0218]
在一些实施例中，所述试剂盒包含游离核酸提取试剂。在一些实施例中，所述游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
[0219]
在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离dna。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离rna。
[0220]
可采用各种本领域已知的技术来检测所述的iso-mirna的存在或表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如聚合酶链式反应技术(pcr)，southern印迹法，原位杂交法，dna序列分析等，这些方法也可结合使用。
[0221]
本发明还提供了用于在分析物中检测所述的iso-mirna的存在表达情况的试剂。作为一种优选方式，可以采用其特异性扩增引物或特异性探针，通过rcr法来确定所述mirna的量。针对mirna的特异性引物和探针的设计是本领域人员熟知的技术。
[0222]
定义
[0223]
除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在此描述的实施方式可以包括一个或多个数值范围(例如，大小、浓度、时间、温度)。除非上下文另外明确指明，数值的范围将被理解为包含该范围内的所有数值，包括所述范围内的数值的子集(一个或多个)，直至下限单位的十分之一。如本文所用，冠词“一个”、“一种”和“所述”同等地涉及单数或复数的含义，除非上下文另有规定。
[0224]
当术语“包含”被用于本发明说明书或权利要求书中时，除非上下文要求，其应理解为意在指包括陈述的步骤或元件或实体或者陈述的步骤组合或元件组合或实体组合，但不排除任何其它的步骤或元件或实体或步骤组或元件组或实体组。为了实现本发明的目的，术语“由
……
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。
[0225]
如本文所用，“待测样本”、“待测样品”、“分析物”或“待测核酸(如dna，rna)样品”是指待检测的样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。本发明中，所述的待测样本可以是：血浆，血清等。
[0226]
如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。
具体实施方式
[0227]
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体介绍。具体实施例不代表对本发明保护范围的限制，其他人根据本发明理念所作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0228]
本发明将根据特定的实施方式进行，并将附参考图加以描述，但是本发明不受其限制，仅收到权利要求书的限制。本文所附的参考图只是示意性的，而非限制性的。
[0229]
实施例1：
[0230]
a.收集血液样本和制备血浆：
[0231]
本发明中的实验已经得到了伦理委员会的批准。本发明的肝癌标志物的筛选阶段、模型训练阶段和模型验证阶段的实验设计流程图如图1所示。使用包含本发明中保护的肝癌标志物来鉴别肝癌患者的血浆样本的主要方法步骤如图2所示。
[0232]
本发明中使用的样本来自多家合规医院，共采集了1067例满足后续实验标准的血液样本。这些样本的疾病情况分布信息如表2所示，另外如无特殊说明的，本实验中的肝炎患者和肝硬化患者90％以上均同时患有不同程度的乙肝。
[0233]
表2.受试者疾病分组情况
[0234]
疾病分组数量肝癌患者403健康人228肝硬化患者119肝炎患者311其他肝脏疾病患者6合计1067
[0235]
在进行肝癌标志物筛选和模型建立和模型验证的过程中，所有样本被划分为训练集(n＝598)和验证集(n＝469)两组，两组中样本的受试者特征分布如表3所示。
[0236]
表3.训练集和验证集中受试者特征分布
[0237][0238]
b.血液处理和rna提取：
[0239]
1.抽取外周血于edta保存管中，2小时内，将edta管在1300g，4度条件下离心10分钟。然后将血浆转移到新的ep管中，在3000g，4度条件下离心15分钟以除去残留的细胞碎片，然后将上清转移到新的ep管中，-80℃保存。
[0240]
2.使用norgen小rna提取试剂盒，按照厂家提供的说明书提取小rna，使用qubit microrna定量试剂盒，在qubit 4.0(赛默飞世尔)仪器上对microrna进行定量检测其浓度。
[0241]
c.rna文库制备和测序：
[0242]
使用neb等商业化公司或自研的小rna文库制备流程，首先在rna的两端分别加上3’端接头和5’端接头，然后进行逆转录得到cdna分子，之后进行pcr扩增和纯化得到最终文库。经过质检后使用华大/illumina等公司的二代高通量测序仪进行测序。
[0243]
d.数据分析和候选iso-mirna标志物筛选：
[0244]
使用生物信息学手段对测序数据进行分析，包括去除接头、将reads比对到iso-mirna数据库上，此外还可以通过umi(unique molecular identifiers)对比对后数据进行去重，然后依据每百万microrna reads中的个数对每个iso-mirna的表达量进行矫正。
[0245]
t检验或卡方检验和wilcoxon检验被用于肝癌组合健康组、肝炎组和肝硬化组之间的比较，所有的p值都是双侧的。此外，我们同时使用递归特征消除和基于树模型的特征选择的方法对所有iso-mirna进行特征筛选。经过筛选，我们得到了属于11个microrna家族的19个microrna亚型可作为肝癌标志物，其在hcc组和对照组(包含健康人、肝炎患者和肝硬化患者)之间的表达倍数变化和p-value如表4所示：
[0246]
表4.19个microrna亚型在hcc组和对照组中的表达差异
[0247][0248][0249]
e.afp蛋白和dcp蛋白检测：
[0250]
使用流式荧光法，基于luminex平台对所有样本中的afp蛋白和dcp蛋白的含量进行检测。具体过程包括标准曲线的建立，样本荧光值检测和荧光值与浓度换算等过程。
[0251]
f.在含有598个样本的训练集中建立一个包含15个iso-mirna的组合与afp蛋白和dcp蛋白联合的肝癌标志物的线性回归模型：
[0252]
598个样本被用作训练集来建立一个包含15个iso-mirna的组合与afp蛋白和dcp蛋白联合的线性回归模型，建立过程基于python 3.9.7版本开发，使用了公开机器学习库sklearn中的linearregression，cross_val_score等工具，同时使用了pandas、numpy和scipy等python工具库。被诊断患有肝癌的预测概率被用作代替标志物组合来建立接受者操作特征曲线(roc曲线)。roc曲线下面积(auc)被用于评价标志物的诊断性能。python的sklearn工具库中的roc_auc_curve工具和auc_score工具被用于进行roc曲线和auc的分析。
[0253]
图3的a图面显示了训练集中本发明提出的肝癌标志物的模型和依据afp以及dcp构建的模型的性能比较，表明包含iso-mirna肝癌标志物的诊断准确度(auc＝0.960)显著高于afp和dcp联合检测(auc＝0.868)。
[0254]
g.在含有469个样本的验证集中验证本发明提出的肝癌标志物的模型的性能。
[0255]
依据训练集样本构建的模型被用于在独立的验证集(469例样本)中对患有肝癌的概率进行预测，预测概率被用来建立roc曲线和计算auc。
[0256]
图3的b图面显示了验证集中本发明提出的肝癌标志物的模型和依据afp以及dcp构建的模型的性能比较，表明本发明提出的肝癌标志物的诊断准确度(auc＝0.969)显著高于afp和dcp联合检测(auc＝0.850)。
[0257]
本发明提出的肝癌标志物的模型和依据afp以及dcp构建的模型均可以区分肝癌组和健康人组、肝炎组、肝硬化组。根据图4所示，本发明提出的肝癌标志物的诊断准确度(肝癌vs健康人auc＝0.979，肝癌vs肝炎患者auc＝0.966，肝癌vs肝硬化患者auc＝0.969)显著高于afp和dcp联合检测(肝癌vs健康人auc＝0.858，肝癌vs肝炎患者auc＝0.857，肝癌vs肝硬化患者auc＝0.819)。
[0258]
此外，分析了不同模型对于不同bclc分期的肝癌患者和对照组的区分能力。本发明提出的肝癌标志物的模型和依据afp以及dcp构建的模型均可以区分不同分期的肝癌患者和对照组，但根据图5所示，本发明提出的肝癌标志物的诊断准确度(早期肝癌vs对照组auc＝0.974，中晚期肝癌vs对照组auc＝0.973)显著高于afp和dcp联合检测(早期肝癌vs对照组auc＝0.814，中晚期肝癌vs对照组auc＝0.957)。
[0259]
另外，分析了不同模型对于afp正常(afp《20ng/ml)和高afp组(afp≥20ng/ml)的肝癌患者和对照组的区分能力。本发明提出的肝癌标志物的模型和依据afp以及dcp构建的模型均可以区分不同分期的肝癌患者和对照组，但根据图6所示，本发明提出的肝癌标志物的诊断准确度(afp正常的肝癌组vs对照组auc＝0.940，高afp肝癌组vs对照组auc＝0.996)显著高于afp和dcp联合检测(afp正常的肝癌组vs对照组auc＝0.722，高afp肝癌组vs对照组auc＝0.924)。
[0260]
另外，分析了不同模型对于dcp正常(dcp《40mau/ml)和高dcp组(dcp≥40mau/ml)的肝癌患者和对照组的区分能力。本发明提出的肝癌标志物的模型和依据afp以及dcp构建的模型均可以区分不同分期的肝癌患者和对照组，但根据图7所示，本发明提出的肝癌标志
物的诊断准确度(dcp正常的肝癌组vs对照组auc＝0.943，高dcp肝癌组vs对照组auc＝0.967)显著高于afp和dcp联合检测(dcp正常的肝癌组vs对照组auc＝0.606，高dcp肝癌组vs对照组auc＝0.833)。
[0261]
最后，分析了使用不同数量的本发明中优选的microrna亚型标志物时，相比较于afp蛋白和dcp蛋白的诊断性能。根据图8所示，从只包含1个microrna亚型到全部15个microrna亚型，每种情况下本发明的联合检测肝癌标志物均可以获得显著高于afp蛋白或dcp蛋白的诊断性能。表5展示了从15种iso-mirna中选择从1个到15个microrna分别与蛋白组合时的模型的性能。从图8和表5中可看出，相比较于afp蛋白和dcp蛋白，从只包含1个microrna亚型到全部15个microrna亚型，每种情况下本发明的联合检测肝癌标志物均可以获得显著高于afp蛋白或dcp蛋白的诊断性能。
[0262]
表5.iso-microrna亚型与蛋白模型组合的诊断性能
[0263] 平均auc最大auc最小auc标准差模型数量afp+dcp0.8500645310.8500645310.850064531011-iso+afp+dcp0.8825827220.9142445910.860804160.013778946152-iso+afp+dcp0.8978570540.9380861730.8723651220.0154649411053-iso+afp+dcp0.9104876990.9434603960.8732356760.0147756284554-iso+afp+dcp0.9205445390.9488578330.8797938530.0132880813655-iso+afp+dcp0.9285500540.9511560960.8869323990.01160325930036-iso+afp+dcp0.9349594230.95398830.894755780.0099344150057-iso+afp+dcp0.9401466540.9549981430.9035773980.00835499564358-iso+afp+dcp0.9443680360.9559499490.9135597550.00689147564359-iso+afp+dcp0.9478314330.9569713990.9244939180.005561241500510-iso+afp+dcp0.9506856620.9575749840.932537840.004366764300311-iso+afp+dcp0.9530601680.9582482120.9393165570.003324554136512-iso+afp+dcp0.9550590110.958793760.9446791720.00242776745513-iso+afp+dcp0.9567497530.9592116260.9499257130.00169234410514-iso+afp+dcp0.95832250.9596294920.9555552980.0010538491515-iso+afp+dcp0.9598848550.9598848550.95988485501
[0264]
在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0265]
尽管在本技术中已经将权利要求阐述为特征的特定组合，但应该理解的是，本公开的范围还包括本文明确或隐含地公开的任何新颖特征或任何新颖特征组合或其任何概括，无论它是否涉及与任何权利要求中目前要求保护的相同的发明，并且无论它是否减轻了与本发明相同的技术问题中的任何一个或全部问题。申请人在此提供通知，在本技术或由此衍生的任何进一步申请的审查期间，新的权利要求可以被制定为这样的特征和/或特征的组合。
[0266]
尽管已经示出和描述了一些实施例，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的原理的情况下可以对这些实施例进行改变，本发明的范围在权利要求中限定。
[0267]
本领域技术人员会理解，在不脱离本发明的全部范围和精神的情况下，可对本申
请描述的部件、方法、步骤、结构、运动、配合进行修改(添加和/或去除)，本发明的范围和精神涵盖这样的修改以及其任何和全部等同物。

技术特征：
1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p的一个或多个mirna的检测试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，或至少11个mirna的检测试剂。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的检测试剂。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的一个或多个mirna的检测试剂。5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个mirna的检测试剂。6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的mirna检测试剂。7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测所述一个或多个mirna的亚型的检测试剂。8.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mirna亚型的检测试剂。9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-let-7b-5p亚型的检测试剂；优选地，所述mir-let-7b-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:1和seq id no:2。10.根据权利要求7-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-144-3p亚型的检测试剂；优选地，所述mir-144-3p亚型有两个，其序列分别为seq id no:5和seq id no:6。11.根据权利要求7-10任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-15a-5p亚型的检测试剂；优选地，所述mir-15a-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:8和seq id no:9。12.根据权利要求7-11任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测mir-451a亚型的检测试剂；优选地，所述mir-451a亚型有两个，三个，四个，五个或六个，其序列分别选自seq id no:13-18；优选地，所述mir-451a亚型包含seq id no:14,seq id no:16,seq id no:17和seq id no:18。13.根据权利要求7-12任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自seq id no:1-9,11-12,14和16-18的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少
7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或全部15个mirna的检测试剂；优选地，包含检测seq id no:1-9,11-12,14和16-18的全部15个mirna的检测试剂。14.根据权利要求7-13任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测选自seq id no:1-19的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或全部19个mirna检测试剂。15.根据权利要求1-14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述mirna检测试剂是用于第二代测序的检测试剂。16.根据权利要求1-15任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的mirna提取试剂。17.根据权利要求1-16任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测甲胎蛋白(afp)的检测试剂。18.根据权利要求1-17任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测异常凝血酶原(dcp)的检测试剂。19.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白检测试剂是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式荧光法的一种或多种检测的检测试剂；优选地，所述蛋白检测试剂是用于流式荧光法的检测试剂。20.根据权利要求17-19任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的蛋白提取试剂。21.根据权利要求1-20任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌(bclc a期)或极早期肝癌(bclc 0期)。22.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含检测样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,mir-652-3p的一个或多个mirna的浓度。23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，或至少11个mirna的浓度。24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-18a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,mir-451a,和mir-652-3p的浓度。25.根据权利要求22-24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的一个或多个mirna的浓度。26.根据权利要求22-24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的选自mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个mirna的浓度。
27.根据权利要求22-24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的mir-let-7b-5p,mir-101-3p,mir-130a-3p,mir-144-3p,mir-145-5p,mir-15a-5p,mir-191-5p,mir-222-3p,和mir-451a的浓度。28.根据权利要求22-27任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测所述样本中的所述一个或多个mirna的亚型的浓度。29.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含检测样本中的mirna亚型的浓度。30.根据权利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-let-7b-5p亚型的浓度；优选地，所述mir-let-7b-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:1和seq id no:2。31.根据权利要求28-30任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-144-3p亚型的浓度；优选地，所述mir-144-3p亚型有两个，其序列分别为seq id no:5和seq id no:6。32.根据权利要求28-31任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-15a-5p亚型的浓度；优选地，所述mir-15a-5p亚型有两个，其序列分别为seq id no:8和seq id no:9。33.根据权利要求28-32任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测mir-451a亚型的浓度；优选地，所述mir-451a亚型有两个，三个，四个，五个或六个，其序列分别选自seq id no:13-18；优选地，所述mir-451a亚型包含seq id no:14,seq id no:16,seq id no:17和seq id no:18。34.根据权利要求28-33任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测选自seq id no:1-9,11-12,14和16-18的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或全部15个mirna的浓度；优选地，包含检测seq id no:1-9,11-12,14和16-18的全部15个mirna的浓度。35.根据权利要求28-34任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测选自seq id no:1-19的至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，或全部19个mirna的浓度。36.根据权利要求22-35任一项所述的方法，其特征在于，所述mirna浓度的检测是用第二代测序的检测方法。37.根据权利要求22-36任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括针对血浆或血清样本的mirna提取。38.根据权利要求22-37任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测甲胎蛋白(afp)的浓度。39.根据权利要求22-38任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测异常凝血酶原(dcp)的浓度。40.根据权利要求38或39所述的方法，其特征在于，所述蛋白检测是用于选自elisa、化学发光、免疫荧光、和流式荧光法的一种或多种方法检测；优选地，用流式荧光法检测。41.根据权利要求38-40任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括针对血浆或血清样本的蛋白提取。
42.根据权利要求22-41任一项所述的方法，其特征在于，所述肝癌为早期肝癌(bclc a期)或极早期肝癌(bclc 0期)。43.根据权利要求22-42任一项所述的方法，其特征在于，所述样本为血浆或血清样本。44.根据权利要求22-43任一项所述的方法，其特征在于，所述样本的afp蛋白浓度小于20ng/ml。45.根据权利要求22-44任一项所述的方法，其特征在于，所述样本的dcp蛋白浓度小于40mau/ml。46.根据权利要求22-45任一项所述的方法，其特征在于，所述样本与对照样本相比，选自let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))，let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))，mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))，mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))，mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))，mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))，mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))，mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))，mir-18a-5p(序列:aaggtgcatctagtgcagat(seq id no:10))，mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))，mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))，hsa-mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgagtt(seq id no:13))，mir-451a(序列:cgttactattactgagtt(seq id no:14))，mir-451a(序列:attaccattactgagtt(seq id no:15))，mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))，mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))，mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))，mir-652-3p(序列:aatggcgccactagggttgtg(seq id no:19))，或其任意组合的iso-mirna的单位浓度/含量上调；可选地，其单位浓度/含量比对照样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述对照样本为正常人的样本，或所述对照样本为无肝癌但有肝炎或者肝硬化患者的样本。48.根据权利要求22-47任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含一个回归模型或者随机森林模型；可选地，所述回归模型是：分数(score)＝03326098177036255*dcp+0.042144370918784584*afp+0.14156146908461528*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatgtactt(seq id no:5))+0.007842422227289102*mir-144-3p(序列:tacagtatagatgatg(seq id no:6))+0.01689391781488717*mir-223-3p(序列:tttgtcaaatacccca(seq id no:12))-0.008460932914774653*mir-15a-5p(序列:tagcagcacataatggtttgtg(seq id no:8))+0.0030534457929552086*let-7b-5p(序列:tgaggtagtaggttgtgtggtt(seq id no:1))+0.09595159865376575*mir-191-5p(序列:aacggaatcccaaaagcagct(seq id no:11))+0.19985985511080592*mir-451a(序列:aaccgttaccattactgagtt(seq id no:17))+2.151539105584064*mir-451a(序列:cgttaccattactgattt(seq id no:16))+0.024563672095013485*mir-101-3p(序列:tacagtactgtgataactgaaa(seq id no:3))+2.9356127524420734*mir-451a(序列:
cgttactattactgagtt(seq id no:14))+0.09961643177138646*mir-130a-3p(序列:cagtgcaatgttaaaagggcac(seq id no:4))+0.5793208271327767*mir-15a-5p(序列:taggagcacataatggtttgtg(seq id no:9))+0.04683039647479648*let-7b-5p(序列:tagtaggttgtgtggtt(seq id no:2))+1.7704820604928486*mir-451a(序列:aaaccgttaccattactgattt(seq id no:18))+0.025941348791831433*mir-145-5p(序列:ttttcccaggaatccc(seq id no:7))-0.9013556106043934，所述样本的分数(score)比对照样本的分数(score)高时判定为肝癌。

技术总结
本发明涉及由选自19种血浆microRNA(miRNA)亚型，AFP蛋白，DCP蛋白的一种或多种生物标志物作为肝癌标志物的肝癌(特别是早期肝癌)检测方法以及相应的诊断肝癌的试剂盒。所述肝癌标志物中的microRNA亚型优选由11个miRNA家族(miR-let-7b-5p,miR-101-3p,miR-130a-3p,miR-144-3p,miR-145-5p,miR-15a-5p,miR-18a-5p,miR-191-5p,miR-222-3p,miR-451a,miR-652-3p)中的19个亚型的全部或者部分组成。所述的试剂盒和方法可以用于诊断肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌，或者区分肝细胞癌患者的血浆与无肝癌个体的血浆(譬如健康个体的血浆、肝炎患者的血浆、或肝硬化患者的血浆)。浆)。


技术研发人员：马士清 代晓转 王娜娜 刘军 陈一友
受保护的技术使用者：杭州诺辉健康科技有限公司
技术研发日：2022.09.05
技术公布日：2023/8/16