一种僵蚕提取物的制备方法及其应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及僵蚕醇提物bbe的提取及其应用。


背景技术：

2.肺癌是造成死亡人数最多的癌症，是男性癌症发病率和死亡率的主要原因，而在女性中，肺癌的发病率仅次于乳腺癌。肺癌在临床上根据组织学亚型，免疫组织学和遗传肿瘤特征主要分为小细胞肺癌(small-cell lung cancer，sclc)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，nsclc)两类，其中sclc约占15％，nsclc约占85％，其中，肺腺癌和肺鳞状细胞癌约占90％nsclc实体瘤。目前，肺癌的治疗方案通常建议在肺癌手术后进行辅助性化学化疗，其中顺铂(cisplatin,ddp)是使用最早和范围最广的铂类药物，但是由于这类药物无选择特异性，因此常伴随着许多与剂量依赖性成正相关的毒副作用。
3.中药在肺癌患者的治疗中具有显著的辅助作用，其可以增加常规治疗(手术治疗，化学治疗和放射治疗)的疗效，缓解耐药性，降低不良反应和毒副作用，减轻患者的痛苦并提高生活质量。因此，从传统中药中提取出抗肿瘤活性的物质，可以作为肺癌药物化疗的辅助治疗，从而增强药物疗效，减轻本类药物的毒副作用。
4.僵蚕是一种比较特殊的产品，它又名白僵蚕，是家蚕幼虫在吐丝前因感染白僵菌而发病致死的干涸硬化虫体，由于其体表密布白色菌丝和分生孢子，形似一层白膜，故名。已有研究证实临床上僵蚕对多种癌症有效，说明僵蚕分离物在肿瘤治疗中具有潜在作用，但其对肺癌的治疗作用及相关作用机制目前研究较少。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种僵蚕提取物及其制备方法，抑制小鼠lewis非小细胞肺癌(lewis lung cancer,llc)的体外增殖和迁移，并增强ddp的抗肿瘤作用，有效提高癌症患者的生存质量。
6.本发明提供了一种僵蚕醇提物，具有多种抗癌活性成分。
7.本发明提供了所述bbe的制备方法，包括以下步骤：
8.1)在95％酒精浸泡作用下，分离得到僵蚕初提物并制成浸膏；
9.2)僵蚕初提物(浸膏)使用石油醚和蒸馏水混合物(体积比例为1：1)进行萃取，收集水相进行浓缩，获得僵蚕醇提物bbe；
10.本发明提供了所述bbe在制备防治肺癌的药物中的应用。
11.本发明提供了所述bbe在制备抑制肺癌细胞增殖和迁移的药物中的应用。
12.本发明提供了一种可以增强ddp疗效的试剂在治疗肺癌的药物中的应用，所述试剂为所述bbe。
13.本发明提供了所述bbe在制备防治肺癌肿瘤生长和迁移的药物中的应用。
14.本发明提取了一种僵蚕醇提物，提取方法条件较为简单，原料成本低，总收率达到40％以上。经过体外细胞实验和动物实验发现，僵蚕醇提物可以抑制小鼠肺癌细胞llc的体
外增殖和迁移，与ddp联合使用，可明显增强ddp的抗肿瘤作用，可有效提高肿瘤患者的抗肿瘤效果。
附图说明
15.图1为bbe对llc细胞体外增殖的影响；
16.图2为bbe对llc细胞体外迁移的影响；
17.图3为bbe对llc荷瘤小鼠肿瘤生长的影响；
18.图4为bbe对llc荷瘤小鼠肿瘤增殖的影响。
具体实施方式
19.本发明提供了一种僵蚕醇提物，含有多种活性成分；
20.本发明提供了所述僵蚕醇提物的制备方法，包括以下步骤：
21.1)将僵蚕粉碎过滤后，在95％乙醇作用下浸泡收集上清液，浓缩后获得初提物浸膏；
22.2)将油醚：蒸馏水1：1的比例进行混合后，对初提物进行萃取，取水相，进行浓缩，获得bbe。
23.在本发明中，步骤1)中需要使用95％酒精中浸泡僵蚕粉末36h，并且需要每隔两个小时彻底搅拌一次，静置分层后取出上清液，再向下层滤渣中加10l95％酒精中浸泡36h，重复此操作，直到加入酒精后，上清液不再变色，合并浸提液，三层滤纸过滤三次除杂。
24.在本发明中，步骤2)中石油醚：蒸馏水的比例为1：1。需要反复萃取三次以彻底去除酒精和不溶于水的油脂等残留，最后收集水相进行浓缩。
25.本发明提供了一种抑制小鼠肺癌细胞llc增殖和迁移的试剂在制备防治肺癌的药物中的应用，所述试剂为bbe。
26.下面结合实施例对本发明提供的一种僵蚕醇提物bbe及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
27.材料说明
28.实验动物：8周左右c57雄性小鼠，购自北京斯贝福生物技术有限公司(许可证号：scxk(京)2019-0010)，小鼠的饲养和处理严格遵照国家健康指南研究所指导的动物实验程序。
29.细胞：小鼠lewis非小细胞肺癌细胞。
30.试剂：常规购买途径购买获得。
31.设备：普通商品途径购买获得。
32.实施例1
33.僵蚕醇提物的提取方法
34.(1)选择个体较大的僵蚕放在烘箱内，于50℃烘烤16h后，用粉碎机将其彻底粉碎至粉末状，过100目筛除杂。取10kg僵蚕粉末于10l95％酒精中浸泡36h(每隔两个小时彻底搅拌一次)，静置分层后取出上清液，再向下层滤渣中加10l95％酒精中浸泡36h，重复此操作，直到加入酒精后，上清液不再变色，合并浸提液，三层滤纸过滤三次除杂，将滤液置于旋转蒸发仪上进行旋干浓缩，并置于通风橱抽干残留酒精，获得僵蚕初提物(浸膏)。
35.(2)取200g僵蚕初提物(浸膏)放置于1000ml的分液漏斗中，按照石油醚：蒸馏水1：1的比例各加入500ml萃取。反复萃取三次以彻底去除酒精和不溶于水的油脂等残留，收集水相，将其于旋转蒸发仪上旋转蒸发浓缩，通风橱抽干残留液体，获得僵蚕醇提物(bombys batryticatus ethanol extract)，下文简称bbe，用dmem培养基溶解，配制成bbe母液(1g/ml)。
36.本提取方法条件较为简单，原料成本低，并能快速获得纯净提取物。
37.实施例2
38.僵蚕醇提物对小鼠肺癌细胞llc(lewis)的体外抑制作用
39.小鼠肺癌细胞llc购买自武汉普诺赛公司，此细胞株为半贴壁半悬浮状，上皮细胞样。生长培养条基为dmem+10％fbs+1％p/s，传代比例为1：2-1：4，冻存液条件为50％基础培养基+40％fbs+10％dmso。细胞培养传代至第四代进行后续实验。
40.(1)僵蚕醇提物对llc细胞活力的影响
41.实验分组及方法：llc细胞于实验前一天以0.5
×
104/孔密度接种至96孔板，将bbe母液按照梯度浓度进行稀释后加入细胞。最终实验分组为0mg/ml组、2.5mg/ml组、5mg/ml组、10mg/ml组、20mg/ml组、40mg/ml/组和80mg/ml组。各组细胞在培养24h、36h、48h和60h后采用cck8法检测细胞活力。实验结果为所有数据均以平均值
±
标准误表示。两组均数比较采用独立样本的student’s t检验，多组均数多重比较采用one-wayanova及newman-student-keuls检验分析。统计分析采用spss19.0软件，双侧p《0.05认为差异有统计学意义。
42.结果
43.僵蚕醇提物呈浓度依赖性抑制llc细胞增殖(见图1)。测得僵蚕醇提物的ic50为37.5mg/ml，因此后续实验分别选定20mg/ml(低浓度)，30mg/ml(中浓度)和40mg/ml(高浓度)作为后续实验药物浓度。
44.(2)僵蚕醇提物对llc细胞迁移的影响实验分组及方法：对照组(0mg/ml)、低剂量组(20mg/ml)、中剂量组(30mg/ml)和高剂量组(40mg/ml)。llc细胞于实验前一天以1
×
104/孔的密度接种至6孔板，以保证细胞在第二天长满。用直尺和10μl枪头制造出划痕，更换低血清培养基(dmem+2％fbs)继续培养，分别于0h、24h和48h进行拍照观察。使用image j软件分析每个时间点划痕的宽度或划痕的面积。
45.结果
46.僵蚕醇提物可以明显抑制llc细胞的迁移能力(见图2)。结果表明中浓度和高浓度的bbe对llc细胞的迁移能力均有抑制作用，但两组之间无明显差异。
47.实施例3
48.僵蚕醇提物联合顺铂对llc荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用
49.llc荷瘤小鼠模型的建立
50.实验选用6-8周左右c57小鼠(n＝24，18-22g)，适应性饲养1周后按体重将小鼠随机分为以下5组(n＝10)：模型组(model)；僵蚕醇提物组(1440mg/kg/day bbe)；顺铂组(dpp，2mg/kg/2day)；低剂量僵蚕醇提物+顺铂组(900mg/kg/day bbe-low dose,bbel+dpp)；高剂量僵蚕醇提物(1440mg/kg/day bbe-high dose,bbeh+dpp)。实验第一天，五组小鼠在左前腋下皮下注射200μl llc细胞悬液(pbs稀释至1
×
107/ml)。大约一周后，当大多数
小鼠皮下移植瘤生长至50mm3时，开始用ddp和bbe处理各个实验组，其中dpp溶解在pbs中进行腹腔注射，1次/2天，bbe用pbs稀释后进行灌胃给药，1次/天，连续给药31天(bbe的给药剂量按照药典查询的人体用量进行换算)。
51.在开始给药后，每3天称量各组小鼠的体重，同时测量肿瘤的体积。31天后，小鼠腹腔注射0.1％戊巴比妥钠，小鼠麻醉后，眼眶静脉采血，以3,000r/min速度离心10分钟，收集上清保存于-80℃冰箱。取血后颈椎脱臼法处死小鼠，剥离肿瘤和脾脏，并称重。将瘤组织在液氮中迅速冷冻，保存于-80℃好冰箱，用于后续基因和蛋白表达检测。
52.结果
53.1.僵蚕醇提物抑制llc荷瘤小鼠肿瘤的生长
54.与模型组相比，bbe组小鼠的肿瘤生长明显受到抑制，说明bbe具有体内抗肿瘤作用。与ddp组相比，bbe+dpp联合用药后，bbe对肿瘤的抑制作用具有剂量依赖性(图3)，可以增强ddp的化疗作用。
55.2.僵蚕醇提物抑制肿瘤组织增殖
56.用western blot技术检测细胞增殖抗原(proliferation marker protein ki-67,ki67)、增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclearantigen,pcna)、凋亡抑制因子survivin蛋白表达情况(图4)。与模型组相比，bbe和dpp均可降低ki67、pcna和survivin蛋白表达，而bbe和dpp联合使用可以明显增强dpp对三种蛋白表达的抑制作用，同时bbe对蛋白表达的抑制作用具有剂量依赖性。
57.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种僵蚕醇提物(bombyx batryticatus extraction,bbe)，其特征在于含有多种抗癌活性成分。2.根据权利要求1所述bbe的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在95％酒精浸泡作用下，分离得到僵蚕初提物；2)僵蚕初提物使用石油醚和蒸馏水混合物进行萃取，收集水相进行浓缩，获得僵蚕醇提物bbe。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，石油醚和蒸馏水体积比为1：1。4.权利要求1所述bbe在制备防治非小细胞肺癌的药物中的应用。5.权利要求1所述bbe在制备抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移的药物中的应用。6.权利要求1所述bbe在增强ddp抗肿瘤作用中的应用。7.一种抑制小鼠lewis肺癌细胞体内和体外增殖的试剂在治疗非小细胞肺癌中的应用，所述试剂为权利要求1所述bbe。

技术总结
本发明提供了一种僵蚕醇提物的制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供一种僵蚕醇提物，提取方法条件较为简单，原料成本低，并且总收率达到40％左右。经过体外细胞实验和动物实验发现，僵蚕醇提物可以抑制小鼠肺癌细胞LLC的体外增殖和迁移，与DDP联合使用，可明显增强DDP的抗肿瘤作用，可有效提高肿瘤患者的抗肿瘤效果。的抗肿瘤效果。


技术研发人员：齐恒田 赵繁荣 谢玉良 尹延彦 杨焱焱 席晨垄 李春燕 孙文泽 祝田田
受保护的技术使用者：新乡医学院
技术研发日：2022.07.07
技术公布日：2023/8/16