一种嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵产物及其在化妆品中的应用的制作方法

1.本发明属于化妆品发酵原料技术领域，具体涉及嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法、发酵产物及其在化妆品中的应用。


背景技术：

2.嗜热栖热菌(thermus thermophilus)是一种耐热菌，已在多种生物技术领域中广泛利用。对其进行发酵，能够产生热稳定性的超氧化物歧化酶(sod)和b族维生素。超氧化物歧化酶具有强大的抗氧化能力，能够避免生物体的氧化损伤，赋予皮肤抵抗自由基的能力，从而延缓皮肤衰老。b族维生素可以缓解皮肤炎症反应，抵抗紫外线损伤，促进细胞再生，同时还是多种酶和辅酶分子结构的一部分，可促进氨基酸的代谢以保持皮肤健康。嗜热栖热菌发酵产物中包含特定的酶，可以催化高温下紫外线损伤引起的自由基的去除反应，能够预防或治疗与紫外线和红外自由基相关的损伤，修复皮肤损伤，减少皱纹，改善皮肤完整性，深层保湿，滋养，提高弹性。
3.纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)是一种安全、耐酸、耐热的益生菌，具有抗菌、抗癌和溶栓等多种活性。纳豆芽孢杆菌的发酵产物富含多胺，多胺能够参与细胞自噬的调控，对该过程起促进作用，从而抑制各种因素导致的色素沉着和细胞衰老，起到焕亮肌肤以及抗衰的作用。研究发现利用纳豆芽孢杆菌发酵黄芪，其发酵物能促进hdf细胞中i型前胶原的合成，并在人原代表皮角化细胞和人真皮成纤维细胞培养实验中表现出显著刺激透明质酸的产生。纳豆芽孢杆菌在发酵过程中能产生大量的纳豆激酶和维生素k，具有很强的保健作用。
4.目前，纳豆芽孢杆菌的发酵物大多应用于食品行业中，在化妆品行业中的应用较少，其发酵物的护肤功效有待进一步的开发和研究。另外，尚无嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵及其应用的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的是提供一种嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法，以使嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌能相互促进，最大程度地获得两种益生菌发酵所产生的有益物质。
6.本发明的另一目的是提供一种嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵产物，该发酵产物富含抗氧化、抗皱等活性组分。
7.本发明的第三目提供所述嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵产物在化妆品中的应用。
8.本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
9.一种嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法，所述方法包括以下步骤：
10.s1先对嗜热栖热菌进行高温条件下的一次或者多次增菌液体发酵，让其处于指数
生长期；
11.s2然后让发酵液的温度从高温变为低温后，添加纳豆芽孢杆菌进行二次发酵；
12.优选地，在温度从高温变为低温的1天内，添加纳豆芽孢杆菌进行二次发酵，这样能使嗜热栖热菌充分发酵同时避免发酵过度，此外，也能避免发酵物放置时间过长导致的污染及变质问题；
13.优选地，所述高温为60-65℃，所述低温为30-35℃。
14.在一些方式中，步骤s1中至少进行两次增菌发酵；步骤s2中添加纳豆芽孢杆菌前至少进行一次或者多次增菌发酵。例如，嗜热栖热菌进行三次增菌发酵，具体过程为：
15.s1-1一级发酵：将嗜热栖热菌菌种液接种于一级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量4m3/h，60-65℃培养12小时；
16.s1-2二级发酵：将一级种子液接种于二级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量12m3/h，60-65℃培养12小时；
17.s1-3三级发酵：将二级种子液接种于三级发酵罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量50m3/h，60-65℃培养14小时。培养结束后将温度降低到30℃左右，待用。
18.在一些方式中，添加纳豆芽孢杆菌前进行2次纳豆芽孢杆菌的增菌发酵，具体过程包括：
19.s2-1一级发酵：将纳豆菌菌种液接种于一级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量3m3/h，30-35℃培养14小时；
20.s2-2二级发酵：将一级纳豆菌种子液接种于二级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量9m3/h，30-35℃培养14小时。
21.在一些方式中，所述方法还包括：步骤s3对步骤s2二次发酵后获得的产物进行分离纯化；其中，包括离心除菌步骤。
22.进一步，所述纳豆芽孢杆菌的菌株为cicc10023，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为cicc10023；所使用嗜热栖热菌hb27购于美国模式菌种收集中心(atcc)，保藏号为baa-163。
23.本发明的另一方面，提供通过上述发酵方法获得的发酵产物及其应用。
24.通过上述方法获得的发酵产物中有超氧化物歧化酶(sod)、b族维生素、多胺、多酚、还原性谷胱甘肽等多种活性成分。与专利cn 108517345 b中公布的组合菌发酵产物相比，本发明的发酵产物中活性成分含量更高，其中，多酚含量提高了227.9％，还原性谷胱甘肽含量提高了283.7％，并且含有较高水平的纳豆激酶。
25.本发明所述的发酵产物具有皮肤抗皱、保湿、提亮以及祛黄的功效，可以应用于化妆品中。所述化妆品一般为皮肤护理试剂，如溶液、悬浮液、面膜、乳液、霜剂、膏状、凝胶、干粉、湿粉、喷剂等。
26.在一些方式中，所述化妆品为水、精华、乳液、面霜、眼霜、面膜液中的一种。例如，所述化妆品为一种精华水，该精华水以所述发酵产物为主要有效成分，并配有保湿剂、增稠剂和防腐剂等其他辅助成分。
27.优选地，化妆品中所述发酵产物的浓度或含量为0.5％～20％。该浓度或含量下的所述发酵产物可以发挥更好的功效，当浓度或含量低于0.5％时，效果较差，浓度高于20％，所述化妆品不能发挥更好的功效，且浓度过高不仅会提高成本，也容易刺激皮肤，尤其是对
于敏感性皮肤人群。
28.在一些方式中，所述精华水包括：0.5％～20％权利要求5所述的发酵产物、1％-5％丁二醇、0.1％-1％甜菜碱、0.001％-0.05％透明质酸钠、0.01％-0.1％黄原胶以及0.5％～1％化妆品防腐剂pe9010。
29.本发明的优势在于：本发明将嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵，两种益生菌共同发酵，能相互促进，最大程度的保护两者产生的活性成分。经本发明提供的嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵能获得含有多酚、纳豆激酶、还原性谷胱甘肽等活性成分的发酵产物，该发酵产物用于人体皮肤，具有提亮、保湿和抗衰老的功效，且安全无刺激性。
附图说明
30.图1角质形成细胞中炎症因子il-1α、il-6、tnf-α表达量，bc：控制组；nc：阴性对照组；pc：阳性对照组，用地塞米松处理；发酵产物-5％：实验组，用5％发酵产物进行处理。
31.图2细胞内活性氧(ros)含量。
32.图3成纤维细胞collagen iv和elastin基因表达量。
33.图4黑色素细胞中黑色素含量。
34.图5使用含低浓度双菌发酵产物的精华水时皮肤科医生临床评估结果。
35.图6使用含高浓度双菌发酵产物的精华水时皮肤科医生临床评估结果。
36.图7皮肤颜色l值测定结果。
37.图8皮肤颜色ita
°
值测定结果。
38.图9皮肤经表皮失水率测定结果。
39.图10皮肤角质层水分含量测定结果。
40.图11使用含低浓度双菌发酵产物的精华水时受试者对肌肤状态的自我评估。
41.图12使用含高浓度双菌发酵产物的精华水时受试者对肌肤状态的自我评估。
42.图13受试者使用含高浓度双菌发酵产物的精华水的28天前后的皮肤对比图。
具体实施方式
43.下面通过具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
44.本发明中：纳豆芽孢杆菌的菌株为cicc10023，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：cicc10023；所使用嗜热栖热菌hb27购于美国模式菌种收集中心(atcc)，保藏号是：baa-163。
45.首先，本发明对嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法的具体参数进行了优化。在嗜热栖热菌以及纳豆芽孢杆菌的增菌发酵时，进行搅拌频率、通氧量以及培养温度和时间等条件的优化，获得最优的增菌发酵工艺参数，优化后的条件见下述实施例1。
46.进一步地，本发明对双菌发酵过程进行了优化，具体包括：
47.(1)对比筛选了双菌发酵工艺对产品成分的影响，发现使用先纳豆芽孢杆菌再嗜热栖热菌发酵方式，未检测到纳豆激酶(低于仪器检测灵敏范围)，但使用先嗜热栖热菌后纳豆芽孢杆菌的发酵方式有纳豆激酶的产生。因此，选取先嗜热栖热菌后纳豆芽孢杆菌的发酵方式。
48.(2)对比筛选了双菌发酵中发酵培养基对发酵活性成分的影响，发现利用营养培
养基和鹰嘴豆粉进行发酵，其发酵产物中的纳豆激酶含量较高，高于利用大豆粉的发酵工艺。
49.除此之外，发明人对双菌发酵过程的温度、时间等其他工艺参数也进行了优化。进一步优化了后续发酵产物的处理过程，主要为分离纯化过程，包括活性炭脱色、离心除菌等。
50.优化获得最佳的发酵方法后，发明人通过细胞实验测定了发酵产物的抗炎、抗衰、美白等活性。
51.接着，以所述发酵产物为主成分(活性成分)，制成精华水，进行临床护肤实验。通过临床实验进一步证实了所述发酵产物具有提亮美白、保湿和抗衰老的护肤功能。
52.本技术提供了最优的嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法。通过该方法能获得活性成分高(包括多酚、纳豆激酶、还原性谷胱甘肽等)的发酵产物，此外，嗜热栖热菌发酵还能产生热稳定性的b族维生素和超氧化物歧化酶(sod)等其他有益成分。纳豆芽孢杆菌也能产生多胺等其他有益成分。将含有这些活性成分及有益成分的所述发酵产物用于护肤，起到了很好的提亮美白、保湿和抗衰老作用且无刺激。因此，所述发酵产物能应用于化妆品中，尤其是用于皮肤抗皱、保湿、提亮或者祛黄的护肤品。
53.实施例1嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法(1)
54.嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌的双菌发酵的具体方法如下。嗜热栖热菌的发酵过程分为三个阶段，分别是一级发酵、二级发酵和三级发酵。一级发酵：将嗜热栖热菌菌种液接种于一级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量4m3/h，60-65℃培养12小时。二级发酵：将一级种子液接种于二级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量12m3/h，60-65℃培养12小时。三级发酵：将二级种子液接种于三级发酵罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量50m3/h，60-65℃培养14小时。
55.纳豆芽孢杆菌的发酵过程分为两个阶段，即一级发酵和二级发酵。一级发酵：将纳豆菌菌种液接种于一级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量3m3/h，30-35℃培养14小时。二级发酵：将一级纳豆菌种子液接种于二级种子罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量9m3/h，30-35℃培养14小时。
56.完成上述发酵过程后，进行双菌发酵过程：将嗜热栖热菌的二级种子液或三级种子液接种到双菌发酵罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量50m3/h，60-65℃培养14小时。培养结束后将温度降低到30℃左右。再将二级纳豆菌种子液接种于该双菌发酵罐中，搅拌100-150转/分钟，通氧量50m3/h，30-35℃下培养18小时。双菌发酵结束后，用连续流高速离心机，对发酵液进行离心分离，得到发酵上清液。用烘烤过的活性炭对发酵上清液进行搅拌脱色。脱色结束后，用滤布粗过滤掉大颗粒活性炭，再用连续流离心机进行离心，得到澄清的上清液，即发酵产物。
57.随后加入防腐体系(0.5％-1％对羟基苯乙酮，2％-4％1,3-丁二醇，0.5％-1％1,2-己二醇)，均匀搅拌。过滤除菌后罐装成25kg/桶半成品。对半成品进行取样检验，检验合格后，对半成品进行封盖，并入库保存。
58.其中，嗜热栖热菌发酵过程使用的培养基为营养培养基(1l培养基中含有10-15g胰蛋白胨、10-15g酵母粉、0.1-0.3g无水硫酸镁、0.3-0.6g磷酸二氢钾、10-15g硫酸铵、0.03-0.06g氯化钙和少量氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠)，纳豆芽孢杆菌发酵过程使用的
培养基为纳豆菌基础培养基(1l培养基中含有5-10g鹰嘴豆粉、15-20g胰蛋白胨、10-15g牛肉浸粉、5-6g氯化钠和5-8g硫酸铵)。双菌发酵过程使用的培养基为95％的上述营养培养基和5％的上述纳豆菌基础培养基。
59.实施例2嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法(2)
60.嗜热栖热菌发酵过程使用的培养基为营养培养基(配方同实施例1)，纳豆芽孢杆菌发酵过程使用的培养基为纳豆菌基础培养基-1(1l培养基中含有5-10g大豆粉，其他配方同实施例1)。双菌发酵过程使用的培养基为95％的上述营养培养基和5％的上述纳豆菌基础培养基-1。
61.实施例3嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法(3)
62.嗜热栖热菌发酵过程使用的培养基为营养培养基(配方同实施例1)，纳豆芽孢杆菌发酵过程使用的培养基为纳豆菌基础培养基-1(1l培养基中含有5-10g大豆粉，其他配方同实施例1)。双菌发酵过程使用的培养基为80％的上述营养培养基和20％的上述纳豆菌基础培养基-1。
63.实施例4嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法(4)
64.双菌发酵时先接种二级纳豆菌种子液进行发酵，再接种嗜热栖热菌的三级种子液进行再发酵。其他同实施例1。
65.实施例5发酵产物成分测定
66.按下述方法测定实施例1-4最终得到的发酵产物的活性或活性成分含量，检测结果如下表1。
67.(1)采用福林酚法测定多酚含量。
68.(2)采用双缩脲法测定多肽含量。
69.(3)采用考马斯亮兰法测定蛋白质含量。
70.(4)采用微量还原型谷胱甘肽测试盒法测定还原性谷胱甘肽含量。
71.(5)采用纤维蛋白法测定纳豆激酶含量。
72.表1通过实施例1-4获得发酵产物的测定结果
[0073][0074]
由表1数据可知：
①
通过实施例1-4的发酵方法均可以获得多酚含量、蛋白以及多肽含量高的发酵产物。其中，多酚具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗动脉硬化、抗诱变、抗肿瘤等多种生物学活性，尤其是其抗氧化作用显著，因而被广泛应用于化妆品领域，例如专利cn104473825b中将龙眼果壳多酚用于制备多酚美白化妆品。
[0075]
②
实施例1的发酵产物中纳豆激酶的含量最高且明显高于实施例2和实施例3，说
明相对于使用大豆粉培养基，通过鹰嘴豆粉培养基可以获得更多的纳豆激酶。然而，实施例4中未检测到纳豆激酶，说明在进行双菌发酵时，需先进行嗜热栖热菌发酵再进行纳豆芽孢杆菌杆菌发酵，而不能先进行纳豆芽孢杆菌杆菌发酵再进行嗜热栖热菌发酵。可能是由于先进行纳豆芽孢杆菌发酵再进行嗜热栖热菌发酵时，纳豆芽孢杆菌发酵产生的纳豆激酶容易在嗜热栖热菌发酵时被破坏掉，也可能是由于嗜热栖热菌发酵后的产物更有利于纳豆芽孢杆菌利用，能产生更多的纳豆激酶，其具体原因仍有待进一步研究。
[0076]
纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，是纳豆最主要的生理活性成分，具有溶解血栓、降低血粘度、改善血液循环、软化和增加血管弹性等作用。
[0077]
③
实施例1和实施例3的方法可以获得还原性谷胱甘肽含量更高的发酵产物。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物，以还原型(即gsh)和氧化型(gssg)两种形态广泛存在于生物体内，是主要的抗氧化剂，被广泛用作药品、健康食品和化妆品等的产品、原料或中间体。还原性谷胱甘肽具有抗氧化性，能清除自由基。
[0078]
另外，嗜热栖热菌是一中耐热菌，其发酵温度高，而纳豆芽孢杆菌需要在较低温度下进行发酵，故难以同时进行发酵。发明人尝试在较高温度下或较低温度下同时进行两种菌的发酵以及折中取中间温度进行发酵，都未取得好的发酵效果。
[0079]
综上，实施例1的发酵方法具有最优的效果，适用于进行嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌的组合发酵。
[0080]
进一步，发明人测定了按中国专利201810358237.5(cn 108517345 b)实施例1嗜热栖热菌和酵母菌组合发酵方法(1)制备发酵产物，并测定多酚、还原性谷胱甘肽以及纳豆激酶含量。结果表明，本发明实施例1的发酵产物中有效成分含量远高于专利cn108517345b的，其中，多酚含量提高了379.4％，还原性谷胱甘肽含量提高了241.4％，并具有较高水平的纳豆激酶。
[0081]
实施例6细胞活性实验
[0082]
对实施例1获得的发酵产物进行进一步的细胞活性实验，包括抗炎、抗氧化、抗衰、美白等，具体实验过程或方法为：
[0083]
(1)抗炎
[0084]
采用uvb刺激角质形成细胞的皮肤炎症模型，通过检测前促炎因子tnfα、il-1α和il-6的分泌情况来评价发酵产物的抗炎功效。
[0085]
实验结果如图1所示。与阴性对照组(nc)相比，实验组(发酵产物5％)能显著抑制uvb照射下细胞产生的炎症因子tnf-α、il-1α和il-6，表明具有抗炎功效并对于uvb的损伤有一定的防护作用。与阳性对照组(pc，地塞米松)相比，实验组对il-6的抑制效果更好。
[0086]
(2)抗氧化
[0087]
以角质形成细胞为测试对象，用一定剂量的uvb(300mj/cm2)照射，建立体外uvb损伤细胞模型，通过检测细胞内活性氧(ros)含量的变化来评价发酵产物的抗氧化功效。
[0088]
实验结果如图2所示。与阴性对照组相比，实验组能显著抑制uvb刺激产生的ros，具有抗氧化功效。
[0089]
(3)抗衰
[0090]
以成纤维细胞为测试对象，通过细胞内collagen vi和elastin基因表达量，评价发酵产物的抗衰老功效。
[0091]
实验结果如图3所示。与阴性对照组相比，实验组中成纤维细胞抗衰相关基因collagen iv和elastin基因表达量显著性上升。
[0092]
(4)美白
[0093]
以黑色素细胞为测试对象，通过细胞内的黑色素含量评价发酵产物的美白功效。
[0094]
实验结果如图4所示，由图可知，实验组(发酵产物-1％)中黑色素细胞的黑色素含量显著下降，且与阳性对照组(光甘草定)相比也有显著的下降，说明1％发酵产物具有美白功效，并且美白效果优于光甘草定。
[0095]
综上，所获的发酵产物具有显著的抗炎、抗氧化、抗衰和美白功效。
[0096]
实施例7临床实验
[0097]
取实施例1获得的发酵产物为主成分配置成精华水，该精华水中除主成分外，剩余成分由保湿剂(1％-5％丁二醇、0.1％-1％甜菜碱、0.001％-0.05％透明质酸钠)、增稠剂(0.01％-0.1％黄原胶)、0.5％-1％化妆品防腐剂9010以及水组成，无其他功效物。下述低浓度(样品a组)和高浓度(样品b组)中的主成分含量分别为5％和20％。
[0098]
1、实验方法
[0099]
本发明选取受试者60人，分为两组，每组30人，分别用于测试低、高两种浓度精华水。受试者早晚洁面后使用两种产品，再进行后续护肤及防晒，连续28天。在使用产品前、使用7天后以及28天后，进行皮肤状态检测。其中，包括利用皮肤颜色测定仪cl400检测皮肤颜色、利用皮肤水分流失测定仪tw300检测皮肤经表皮失水率、利用皮肤水分测定仪cm825检测皮肤角质层水分含量、经皮肤科医生进行临床评估以及受试者自我评估等方式，提供了该双菌发酵产物在两种浓度下的提亮、抗衰方面的应用依据。
[0100]
皮肤评价的具体指标以及方法如下：
[0101]
①
皮肤科医生临床评估
[0102]
在使用产品前、使用7天后和28天后，让受试者清洁面部，在21
±
1℃、相对湿度50
±
5％rh环境下静候30分钟后进行皮肤科医生的临床评估，并对所得数据利用统计学方法进行显著性水平的检验。
[0103]
②
皮肤颜色、皮肤经表皮失水率、皮肤角质层水分含量指标的临床测定
[0104]
在使用产品前、使用7天后和28天后，让受试者清洁面部，在21
±
1℃、相对湿度50
±
5％rh环境下静候30分钟后进行脸颊区域皮肤颜色、皮肤经表皮失水率、皮肤角质层水分含量的测定，并对所得数据利用统计学方法进行显著性水平的检验。
[0105]
③
受试者自我评估
[0106]
在使用产品前、使用7天后和28天后，让受试者清洁面部，在21
±
1℃、相对湿度50
±
5％rh环境下静候30分钟后进行自我评估问卷调查，并对所得数据利用统计学方法进行显著性水平的检验。
[0107]
2、实验结果
[0108]
①
皮肤科医生临床评估结果如图5(低浓度)和图6(高浓度)，使用低、高两种浓度的双菌发酵产物的精华水7天和28天后，受试者眼角皱纹、额头皱纹、全脸皱纹均有显著改善，皮肤弹性和皮肤紧致度均显著提升，且28天后的变化率均大于7天后的。另外，对比图9和图10的结果可知，高浓度的效果均优于低浓度的。该结果说明添加双菌发酵物的精华水
均有抗皱、增加皮肤弹性的功效，且高浓度时的效果更优，使用时间越长效果越好。
[0109]
②
皮肤颜色l测定结果如图7所示，使用低、高两种浓度的精华水28天后，受试者面部皮肤的皮肤颜色l均具有显著提高(p《0.05)，且在使用7天后高浓度组受试者面部的皮肤均皮肤颜色l已显著提高(p《0.05)。皮肤颜色ita
°
值测定结果如图8所示，使用低、高两种浓度的双菌发酵产物的精华水7天和28天后，受试者面部皮肤的皮肤颜色ita
°
均显著提高(p《0.05)，且28天的皮肤颜色ita
°
明显高于7天的。该结果表面，含双菌发酵产物的精华水具有提亮肤色和皮肤美白的功效，且浓度越高，使用时间越长，其效果越好。
[0110]
皮肤经表皮失水率和皮肤角质层水分含量的测试结果如图9和图10所示。由图中结果可知，使用低、高两种浓度的精华水7天和28天后，受试者面部皮肤的皮肤经表皮失水率均显著降低(p《0.05)，皮肤角质层含量均显著升高(p《0.05)，另外，使用28天后的皮肤经表皮失水率低于7天后的，28天后的皮肤角质层水分含量高于7天后的。该结果说明低、高两浓度的精华水均能显著降低皮肤经表皮水分流失，提高皮肤角质层的含水量，且使用时间越长，效果越好。
[0111]
③
受试者对皮肤状态的自我评估效果如图11(低浓度)和图12(高浓度)所示，由图中结果可知，受试者使用低、高两种浓度的精华水后，肌肤整体状态、肌肤水润度、肌肤刺激状态、肌肤紧致度、肌肤皱纹、肌肤光泽度、肤色均匀度、肌肤柔嫩度、肌肤耐受度以及皮肤弹性均有所改善，且28天后的评分高于7天后的，高浓度的高于低浓度的。该结果说明受试者使用双菌发酵产物的精华水后，皮肤状态有所改善，特别是肤色、水润度和紧致度方面。
[0112]
④
如图13为一位受试者使用高浓度精华水28天的前后对比图。由图可知，与0天相比，28天时受试者的脸部细纹明显减少，尤其是额头和眼角处。此外，受试者皮肤泛红状况也有所改善。该结果进一步说明精华水的具有抗皱功效，且无刺激，能改善肌肤泛红。
[0113]
综上，低、高浓度双菌发酵产物的精华水均具有提亮美白、保湿和抗衰老的护肤功能，且高浓度的护肤效果更好，使用时间越长，效果越好。
[0114]
应当理解，上述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡是在本发明的技术思想下，在技术方案基础上所做的改动，均在本发明的保护范围之内。本发明中用到的物料和试剂等除特许说明外，均可从商业途径获得。

技术特征：
1.一种嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1先对嗜热栖热菌进行高温条件下的一次或者多次增菌液体发酵，让其处于指数生长期；s2然后让发酵液的温度从高温变为低温后1天内，添加纳豆芽孢杆菌进行二次发酵；其中，所述高温为60-65℃，所述低温为30-35℃。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中至少进行两次增菌发酵；步骤s2中添加纳豆芽孢杆菌前至少进行一次或者多次增菌发酵。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：s3对步骤s2二次发酵后获得的产物进行分离纯化；其中，包括离心除菌步骤。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌的菌株为cicc10023，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为cicc10023；所使用嗜热栖热菌hb27购于美国模式菌种收集中心(atcc)，保藏号为baa-163。5.一种如权利要求1-4之一所述的方法获得的发酵产物。6.一种如权利要求5所述的发酵产物在化妆品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化妆品用于皮肤抗皱、保湿、提亮或者祛黄。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵产物在所述化妆品中的浓度或含量为0.5％～20％。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化妆品为水、精华、乳液、面霜、眼霜、面膜液中的一种。

技术总结
本发明属于化妆品发酵原料技术领域，具体公开了一种嗜热栖热菌和纳豆芽孢杆菌组合发酵方法及其双菌发酵产物。所述双菌发酵产物的活性成分高，将其添加至化妆品中，具有提亮、保湿和抗衰老的功效且安全无刺激性。湿和抗衰老的功效且安全无刺激性。湿和抗衰老的功效且安全无刺激性。


技术研发人员：秦紫嫣 陶侃 朱蕙林 郭莉莉 崔佩
受保护的技术使用者：上海中翊日化有限公司
技术研发日：2022.06.01
技术公布日：2023/8/16