修饰猪支架及其制备方法与流程

修饰猪支架及其制备方法
1.【相关申请交叉引用】
2.本技术要求对2020年5月26日提交的美国系列申请62/704,724享有优先权，其内容全文并入本文。


背景技术：

3.细胞外基质(ecm)是为细胞创造微环境并为组织提供形状和强度的分泌分子(brew，dinakarpandian，&nagase，2000；young，holle，&spatz，2016)。由细胞外基质(ecm)创建的生物支架在治疗各种医疗条件方面变得越来越普遍(hussey，dziki和badylak，2018)。市售支架的来源多种多样；多种物种和组织类型已成功加工成生物支架，包括猪小肠粘膜下层，牛心包，猪膀胱和人类真皮(agmon&christman，2016)。
4.在大多数市售ecm中，结构成分主要是胶原蛋白，其中大多数包括i型胶原蛋白(badylak，freytes，&gilbert，2009)。根据源材料和组织类型，将存在其他原纤维胶原蛋白种类，iii，v和xi型，以及非原纤维胶原蛋白形式iv和viii型(theocharis，skandalis，gialeli和karamanos，2016)。除了胶原蛋白含量外，ecm还可以包含几种粘附分子(badylaket等人，2009)，例如弹性蛋白，纤连蛋白和层粘连蛋白，它们使每种组织类型具有与组织功能相关的独特ecm。ecm的第3个主要结构成分(badylak等人，2009)是蛋白聚糖(pg)，一种与一种或多种糖胺聚糖(gag)结合的基础蛋白。一些常见的细胞外蛋白聚糖是聚集聚糖、杂草聚糖和癸科林多糖，与其他结构分子一样，蛋白聚糖含量因源材料和组织类型而异(theocharis等人，2016年)。
5.ecm中的功能成分是一系列细胞因子，它们通过自分泌，并列和旁分泌信号传导促进其功能(wallner，1998)。功能性细胞因子可根据作用分为几类；有生长因子，白细胞介素和金属蛋白酶(timp)的组织抑制剂(engin，2017；hussey，2018年；theocharis，2016；kim，2011)。生长因子是指导细胞活性的信号蛋白，存在于全身，有助于组织的正常功能。常见的生长因子包括：血管内皮生长因子(vegf)，胰岛素样生长因子(igf)，血小板衍生生长因子(pdgf)和转化生长因子β(tgfβ)(kim，2011；泰帕尔，1997年)。白细胞介素是一组主要负责免疫系统细胞通讯的蛋白质，对于控制免疫和炎症反应至关重要。已经确定了50多种白细胞介素(brocker，2010)。timp通过抑制基质金属蛋白酶的活性来帮助调节组织的功能，基质金属蛋白酶是可以降解各种基质蛋白的酶集合(brew，2000)。所有功能分子相互作用以维持组织中的正常和修复活动(schultz，2011)。
6.研究已经探索了多种分子在伤口愈合过程中的作用。broughton和li都提供了生长因子和ecm蛋白和大分子在伤口愈合过程中参与的广泛概述(broughton，2006；li，2007)。dinh等人发表的一篇针对伤口愈合的生长因子的综述总结了表明tgfβ，pdgf，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和表皮生长因子在伤口愈合中都起关键作用的工作(dinh，2015)。bao等人的一项研究中研究了vegf作为细胞有丝分裂原，趋化性剂和血管通透性诱导剂的多种作用(bao，2009)。研究还检查了胶原蛋白在伤口修复中的重要作用(brett，2008；madden，1971)。透明质酸被证明在炎症和基质合成期间的伤口愈合中起着至关重要
的作用(aya，2014；chen，1999)。2种纤连蛋白(grinnell，1981；sethi，2002年)和层粘连蛋白(malinda，2008；ishihara，2018)已被证明可以结合关键的生长因子并增强伤口愈合和细胞活性。
7.当创建用于愈合受损组织的生物支架时，许多因素影响最终支架的有效性；源材料、组织类型、组织来源的质量、组织部位、供体年龄、回收过程、脱细胞、制造过程和灭菌。
8.胎盘膜，在胎儿发育过程中具有保护和营养的关键作用，提供了许多独特的性质，使其成为生物支架的理想来源组织(shaifurra，islam，asaduzzama，&shahedurr，2015)。为此，自1900年代初以来，人胎盘膜(例如羊膜和/或绒毛膜组织)已被用于各种类型的重建外科手术。膜用作基质材料，通常称为生物敷料或伤口覆盖物。通常，人胎盘膜在剖宫产后恢复并经过最低限度的处理，因此制造过程不会改变膜的原始相关特性，这些特性与膜用于重建、修复或更换的效用有关。
9.胎盘膜的主要功能是为胎儿提供生理屏障以防止干燥(mamede等人，2012)和免疫屏障。胎盘膜组织表现出抗菌特性，因为存在β-3防御素，可防止微生物在上皮表面定植(chopra&thomas，2013；niknejad等人，2008年)。抗炎特性，基于白细胞介素-4(il-4)，白细胞介素-10(il-10)，timp-1，timp-2和timp-4的存在(hortensius&harley，2016；mamede等人，2012)，胎盘膜也有利于组织愈合。胎盘膜显示出上皮化的临床证据(dua，gomes，king和maharajan，2004；subrahmanyam，1995；ward&bennett，1984)以及愈合而不留下疤痕的潜力(leavitt等人，2016)。
10.用于生物支架的源材料的质量可以证明具有挑战性，因为所有天然存在的材料都具有一些固有的可变性(cardinal，2015)。这种挑战在人类来源材料中尤为普遍。个体之间遗传表达的变异已被充分记录(genomes project等人，2010年；international hapmap等人，2010)，并且遗传变异已在单个个体的组织中得到证实(o'huallachain，karczewski，weissman，urban，&snyder，2012)。除了遗传变异性外，组织还可能受到多种环境和行为风险因素的影响。例如，恢复的人类羊膜组织会受到母亲生活方式的影响(day等人，2015)。细胞色素p450酶的表达增加，是负责代谢有毒化合物的酶家族，是人体组织中氧化应激的标志物(strolin-benedetti，brogin，bani，oesch，&hengstler，1999)。人类胎盘组织已被证明吸烟者(huuskonenet al.，2016)，吸毒者(paakki等人，2000)，bmi＞30的母亲(dubois等人，2012)，糖尿病患者(mcrobie，glover，&tracy，1998)和酒精使用者(collier，tingle，paxton，mitchell和keelan，2002)的细胞色素p450水平增加。母龄和胎龄已被证明会改变细胞色素p450(collier等人，2002)和生长因子(lopez-valladares等人，2010)在人胎盘组织中的表达。
11.尽管与人胎盘产品相关的广泛变异性，在过去十年中，对与此类产品相关的愈合特性的认识不断提高导致需求增加，从而推动市场增长。然而，本领域仍然需要具有高临床效率的伤口愈合治疗，以克服市售人类来源产品的不一致。
【发明概要】
12.根据一方面，提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约70pg/mg的量存在。根据一实施方式，
所述至少一种细胞因子是mif的，其以小于约50pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约75pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约175pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约3pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约82pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约7pg/mg的量存在。根据一实施方式，脱水猪胎盘膜用生物负荷降低步骤、洗涤剂漂洗步骤和病毒灭活步骤处理。
13.根据一方面，提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子，用于增加伤口部位的血管形成。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约70pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约3pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。
14.根据一方面，提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子来调节细胞生长和分裂。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约75pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约82pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约7pg/mg的量存在。
15.根据一方面，提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种抑制基质金属蛋白酶活性的细胞因子。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述细胞因子是timp-2，其以小于约175pg/mg的量存在。
16.根据一方面，提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种用于炎症调节的细胞因子。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述细胞因子是mif，其以小于约50pg/mg的量存在。
17.根据一方面，提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子，用于刺激胶原蛋白的产生。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。
18.提供一种处理缺陷的方法。该方法包括向缺陷施用本文提供的猪支架的步骤。该缺陷可以是部分厚度伤口、全厚度伤口、压疮、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道或破坏伤口、手术伤口、伤口裂开、擦伤、撕裂伤、二度烧伤、皮肤撕裂、引流伤口或其任意组合。
19.提供一种伤口敷料。伤口敷料包括本文提供的猪支架。根据一个实施例，猪支架包括限定一个或多个开窗的表面。
20.【发明详述】
21.下面将参照其示例性实施例更全面地描述本公开。这些示例性实施例的描述使得本公开将是彻底和完整的，并将向本领域技术人员充分传达公开的范围。实际上，本公开可以以许多不同的形式体现，而不应被解释为仅限于本文中阐述的实施例；相反，提供这些实施例使得本公开将满足适用的法律要求。
22.如说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”、“the”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。如说明书和所附权利要求中使用的，词语“任选”或“任选”是指随后描述的事件或情况可以或不可能发生。
23.本文所用的术语“出生组织”包括但不限于哺乳动物出生组织的元件，例如，例如胎盘膜(羊膜和绒毛膜)、华通氏胶、脐带、脐动脉、脐静脉和羊水。
24.本文所用的术语“商业化的ecm产品”是由猪小肠粘膜下源材料组成的商业化细胞外基质产物。
25.如本文所用，术语“开窗(fenestration)”和“开窗(fenestrated)”可以互换使用，并且指代基于胎盘膜的构造物，其已被进一步修改以在构建体中包括至少一个或多个预先排列的通孔(fenestrations)。这样的孔允许渗出物穿过结构。此外，孔的数量和大小是预先确定的，以确保开窗间隔适当，以便为伤口产生的渗出物通过构建体提供足够的机会，同时保持足够的结构表面积以有效治疗伤口。
26.本文所用的术语“胎盘膜”是指完整的、完整的胎盘膜，包括从哺乳动物例如例如猪或人获得的羊膜和绒毛膜层。
27.本文所用的术语“膜”是指至少一个胎盘膜、至少一个羊膜、至少一个绒毛膜膜或其任意组合。本文所指的膜可以从哺乳动物例如猪或人中获得。
28.本文所用的术语“猪(pig)”和“猪(porcine)”可以互换使用。
29.如本文所用，术语“猪支架”和“粉末基结构”是指施加在哺乳动物身体的受伤区域上或周围的结构体。
30.本文所用的术语“缺陷”和“伤口”可以互换使用，并且指需要治疗的区域例如哺乳动物身体的受伤区域。
31.本文所用的术语“去细胞化”是指通过该过程将全部或基本上全部完整的细胞和细胞核从胎盘膜中除去，留下源自原始胎盘膜的胎盘细胞外基质。
32.本文所用的术语“胎盘细胞外基质”是指去细胞化的胎盘膜，其中全部或基本上全部的完整细胞和细胞核从胎盘膜中除去，留下由细胞外大分子组成的三维网络，例如胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白和纤连蛋白，它们在用于患者体内时提供结构和生化支持。
33.本文所用的术语“支架”是指去细胞化的细胞外基质结构，其允许患者的细胞浸润并帮助损伤组织的级联愈合和再生。本文提供的支架包括来源于出生组织的细胞外基质，例如猪胎盘膜或其它哺乳动物胎盘膜。
34.如本文所用，术语“天然”是指在从哺乳动物(例如猪)获得组织之后，但在受本文提供的制备步骤之前的状况。
35.本公开提供了一种细胞外基质支架，其由哺乳动物出生组织制备。本公开特别提供了一种由猪出生组织制备的猪支架。然而，本文提供的方法和用途可以应用于任何哺乳动物来源的出生组织以形成适合再生目的的支架。合适的哺乳动物包括但不限于人、牛、
马、山羊或绵羊。
36.猪胎盘为细胞外基质支架提供了独特的源材料，同时克服了与人胎盘相关的固有挑战。猪胎盘中不存在严重影响人类来源组织的可用性和质量的社会因素(例如肥胖、烟草、酒精和药物消费)。相比之下，专门育种的母猪的生活完全规范，母猪的年龄、日粮、运动方案/活动水平和医疗保健完全由种猪控制，从而减少了猪胎盘起始材料的变异性。例如，与广泛采用的人类胎盘膜年龄标准不同，该标准涵盖所有育龄妇女，无论年龄大小，母猪从一岁到大约六岁进行繁殖，这对应于16至35岁的人类年龄范围。母猪在妊娠约114天时分娩仔猪。低母龄和胎龄的组合减少了猪组织中存在应激标志物(例如细胞色素p450酶)的机会。
37.本文提供的猪支架和方法旨在通过提供克服本文所述的与人胎盘相关的固有挑战的替代源材料来解决当前人胎盘膜市场中未满足的需求。除了猪源材料没有可能影响人类产品的相同年龄、健康和生活方式问题之外，目前的猪支架允许宿主细胞渗透支架和受影响的区域(例如缺陷)，沉积胶原蛋白，并轻松快速地重塑缺陷。
38.本文提供的猪支架可以帮助哺乳动物缺陷如伤口或溃疡的级联愈合或愈合过程。在愈合过程中，猪支架可能会被哺乳动物的身体完全吸收。提供了无菌处理胎盘膜制备猪支架的方法。根据一实施方式，猪胎盘细胞外基质由胎盘膜制备，胎盘膜保持完整，因为胎盘膜保留羊膜和绒毛膜膜层以及任何中间层。根据一实施方式，胎盘膜的处理方式使得除华通氏胶外的所有天然层都被保留。
39.本文提供的猪支架可以配制成基于膜的构建体。根据一实施方式，猪支架包括一层或多层猪胎盘膜，包括完整的、完整的胎盘膜或一层或多层分离的羊膜或绒毛膜。根据一实施方式，猪胎盘膜包括本文提供的脱水、去细胞化的猪胎盘细胞外基质。根据另一实施方式，本文提供的猪支架也可以配制成粉末、凝胶、液体或喷雾剂。
40.根据一实施方式，当配制成基于膜的支架时，选择待加工以形成支架的胎盘膜可以进行处理以提供用于递送多种抗生素、抗炎剂、生长因子和/或其它特化蛋白质或小分子。此外，所得的基于膜的支架可以与基质(无菌纱布、无菌聚合物材料或其他组织或生物材料)结合或覆盖，以增加猪支架的强度，用于缝合或延长植入物的寿命。
41.如本文所述的支架可以通过根据本文提供的任何或所有步骤处理哺乳动物的出生组织来生产，应用于出生组织。根据具体实施方式，如本文所述的猪支架可以通过根据本文提供的步骤处理猪出生组织来生产。
42.提供猪支架。根据一实施方式，猪支架包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其包括一种或多种胶原蛋白i、胶原蛋白iii、胶原蛋白iv、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、透明质酸和硫酸化糖胺聚糖。根据一实施方式，胶原蛋白i、胶原iii、胶原蛋白iv、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、透明质酸和硫酸化糖胺聚糖中的一种或多种以不同于未根据本文提供的一个或多个处理步骤处理的天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，猪支架包括四种主要的细胞外基质组分：胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和硫酸化糖胺聚糖(sgags)。
43.根据一实施方式，猪支架包括至少一种或多种细胞因子，其以不同于在未修饰、未加工或天然猪出生组织中发现的细胞因子的量存在。这些细胞因子包括但不限于嗜酸性粒细胞趋化因子-1、epo、fgf-21、半乳糖凝集素-9、ifnb、igf-2、il-21、il-28b、pigf-2、scf、ang-1、il-17f、mif、opg、pdgf-bb、rantes、tgfa、timp-1、timp-2、vegf、饰胶蛋白聚糖、
gasp-1、igfbp-5、il-15、il-22、胰岛素、ip-10、mcp-1、ncam-1、tweak r、ccl3l1、ifna、il-1a、il-1ra、il-13、il-17a、il-18、mig、mip-1b、pecam-1、il-1b、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12p40p70、gm-csf，ifng，tgf-β1和tnfa。
44.提供一种猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。
45.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约70pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约75pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约80pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约85pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约90pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约95pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约100pg/mg的量存在。
46.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约50pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约40pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约30pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约20pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约10pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约5pg/mg的量存在。
47.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约75pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约80pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约85pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约90pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约95pg/mg的量存在。
48.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约175pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约150pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约125pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约100pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约75pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约50pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约25pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约12pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约6pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约3pg/mg的量存在。
49.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约3pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约10pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约20pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约40pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约80pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子
是vegf，其以至少约150pg/mg的量存在。
50.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约25pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约20pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约15pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约7pg/mg的量存在。
51.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约82pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约100pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约200pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约300pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约400pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约500pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约600pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约700pg/mg的量存在。
52.根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约7pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约10pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约100pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约200pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约300pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约400pg/mg的量存在。
53.根据一实施方式，脱水猪胎盘膜用生物负荷降低步骤、洗涤剂漂洗步骤和病毒灭活步骤处理。
54.提供猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子，用于增加伤口部位的血管形成。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约70pg/mg、75pg/mg、80pg/mg、85pg/mg、90pg/mg、95pg/mg或100pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约3pg/mg、10pg/mg、20pg/mg、40pg/mg、80pg/mg或150pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg、25pg/mg、20pg/mg、15pg/mg或7pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是上述量的一种或多种饰胶蛋白聚糖、vegf和pigf-2的组合。
55.提供猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子来调节细胞生长和分裂。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约75pg/mg、80pg/mg、85pg/mg、90pg/mg或95pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约82pg/mg、100pg/mg、200pg/mg、300pg/mg、400pg/mg、500pg/mg、600pg/mg或700pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约7pg/mg、10pg/mg、100pg/mg、200pg/mg、300pg/mg或400pg/mg的量存在。根据一实施方式，所述至少一种细胞因子是前述量的pdgf-bb、tgf-β1或igf-2中的一种或多种的组合。
56.提供猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至
少一种抑制基质金属蛋白酶活性的细胞因子。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述细胞因子是timp-2，其以小于约175pg/mg、100pg/mg、50pg/mg、25pg/mg、12pg/mg、6pg/mg或3pg/mg的量存在。
57.提供猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种用于炎症调节的细胞因子。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，细胞因子是mif，其以小于约50pg/mg、40pg/mg、30pg/mg、20pg/mg、10pg/mg或5pg/mg的量存在。
58.提供猪支架，其包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质以形成猪支架。猪支架包括至少一种细胞因子，用于刺激胶原蛋白的产生。猪支架包括至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。根据一实施方式，所述细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg、25pg/mg、20pg/mg、15pg/mg或7pg/mg的量存在。
59.本文提供的任何猪支架可以包括限定一个或多个开窗的表面。
60.还提供伤口敷料。伤口敷料包括本文提供的猪支架。根据一实施方式，伤口敷料可以包括限定一个或多个开窗的表面。根据一实施方式，伤口敷料可以与基质或非粘附性二次敷料(无菌纱布、无菌高分子材料或其它组织或生物材料)组合或覆盖，以增加猪支架的强度，用于缝合或增加植入物的寿命。
61.提供了一种猪支架的制备方法。根据一实施方式，处理猪胎盘膜以形成猪支架的步骤包括用去垢剂溶液处理猪胎盘膜，该洗涤剂溶液包括至少一种蛋白酶。根据一实施方式，洗涤剂溶液还包括至少一种阴离子洗涤剂。根据一实施方式，处理猪胎盘膜以形成猪支架的步骤包括用病毒灭活溶液处理猪胎盘膜，该病毒灭活溶液包括至少一种碱溶液。根据一实施方式，碱溶液包括每克猪胎盘膜中约1ml至约50ml的约0.1m至约3.0m氢氧化钠的量。
62.根据一实施方式，提供了一种猪支架的制备方法。该方法包括从母猪收集出生组织的步骤，包括脐带、胎盘膜(羊膜和绒毛膜)和羊水。根据一实施方式，该方法包括从母猪收集出生组织的步骤，包括脐带、胎盘膜(羊膜和绒毛膜)和羊水。根据一实施方式，母猪不经过基因改造以停止或减少功能性α-1,3-半乳糖基转移酶基因的表达。根据一实施方式，胎盘膜包括附着的脐带。对潜在的出生组织捐献者进行筛选和测试，以排除任何可能存在健康风险的捐献者。根据一实施方式，出生组织是从一个或多个后代如婴儿或仔猪的足月分娩中回收的。根据一实施方式，该方法任选地包括通过本领域技术人员已知的方法冲洗出生组织的步骤，包括脐带和胎盘膜(羊膜和绒毛膜)。根据一实施方式，该方法还包括将出生组织，包括脐带和胎盘膜(羊膜和绒毛膜)放置在运输容器中的步骤。
63.根据一实施方式，该方法任选地包括通过本领域技术人员已知的方法冷冻脐带和胎盘膜的步骤。根据一实施方式，脐带和胎盘膜可以保持冷冻，直到需要进一步处理。根据一实施方式，该方法还包括从冰箱中取出冷冻的袋装脐带和胎盘膜并在冰箱中解冻的步骤。根据一实施方式，该方法还包括在环境温度下解冻脐带和胎盘膜的步骤。根据一实施方式，该方法任选地包括将任何保留的、冷冻的羊水置于容器中的步骤。
64.根据一实施方式，该方法包括用水冲洗脐带和胎盘膜。根据一实施方式，该方法包括引流脐带和胎盘膜。根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜与脐带分离。
65.根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜分割成碎片的步骤。根据一个实施例，旋转切割机或其它合适的刀具用于切割碎片。当配制成基于膜的构建体时，出生组织可以被切
割成各种尺寸、厚度和形状。胎盘膜片最好具有足够的尺寸和形状，以应用于哺乳动物患者身体上或体内的伤口上或周围。胎盘膜厚度可能因应用、膜类型和膜层数而异。
66.根据一实施方式，该方法包括从胎盘膜中除去华通氏胶和多余的液体以产生清洁胎盘膜的步骤。
67.根据一实施方式，该方法包括用生物负荷降低溶液处理胎盘膜的步骤。根据优选的实施方式，所述生物负荷降低溶液是氯化钠。根据一实施方式，该方法包括每克胎盘膜加入约1ml至约100ml的0.1m至约5m氯化钠溶液的步骤。根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜浸入氯化钠溶液中约15分钟至约8小时的步骤。根据一实施方式，该方法包括在约20rpm至约100rpm下将氯化钠溶液中的胎盘膜摇动约15分钟至约8小时的步骤。
68.根据一实施方式，所述方法包括倾析氯化钠的步骤。根据一实施方式，该方法包括用水冲洗胎盘膜的步骤。根据一实施方式，胎盘膜用水冲洗一次。根据一个实施例，冲洗步骤用水进行多次。根据一实施方式，将胎盘膜用水冲洗约2次至约5次。
69.根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜置于约1ml至约100ml洗涤剂溶液中的步骤。根据一实施方式，洗涤剂以约0.1％至约10％w/v的浓度存在。根据一实施方式，洗涤剂溶液包括至少一种离子洗涤剂。根据具体实施方式，洗涤剂溶液包括至少一种阴离子洗涤剂。根据具体实施方式，洗涤剂溶液包括至少一种阴离子洗涤剂和至少一种蛋白酶。根据一实施方式，洗涤剂溶液含有磷酸盐，其磷含量为约7.5％。根据一实施方式，洗涤剂溶液包括磷酸盐、碳酸盐、直链烷基芳基磺酸钠和至少一种蛋白酶。根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜浸入洗涤剂溶液中约15分钟至约8小时的步骤。根据一实施方式，该方法包括在洗涤剂溶液中以约20rpm至约100rpm摇动胎盘膜约15分钟至约8小时的步骤。
70.根据一实施方式，所述方法包括倾析洗涤剂溶液的步骤。根据一实施方式，该方法包括用水冲洗胎盘膜的步骤。根据一实施方式，胎盘膜用水冲洗一次。根据一实施方式，胎盘膜用水冲洗多次。根据一实施方式，将胎盘膜用水冲洗约2次至约5次。
71.根据一实施方式，该方法包括用病毒灭活溶液处理胎盘膜的步骤，例如，例如氢氧化钠、过氧化氢、乙醇或超临界二氧化碳。根据优选的实施方式，所述病毒灭活溶液是氢氧化钠。根据一实施方式，该方法包括每克胎盘膜添加或引入约1ml至约50ml的约0.1m至约3.0m氢氧化钠的步骤。根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜浸入氢氧化钠中约1分钟至约120分钟的步骤。根据一实施方式，该方法包括在约20rpm至约100rpm下摇动胎盘膜氢氧化钠中的胎盘膜约1分钟至约120分钟的步骤。然后可以倾析氢氧化钠。根据一实施方式，添加氢氧化钠、摇匀和倾析的步骤可以根据需要重复多次，以使胎盘膜中存在的任何病毒灭活以产生基本上没有病毒的胎盘膜。根据一实施方式，加入氢氧化钠、振荡和倾析的步骤可以重复一次。根据一实施方式，加入氢氧化钠、摇晃和倾析的步骤可以重复多达五次。根据优选的实施方式，该方法包括每克胎盘膜加入或引入约5ml至约15ml的0.25m氢氧化钠的步骤。根据优选的实施方式，该方法包括加入或引入约10ml的0.25m氢氧化钠约20分钟，振荡、倾析和重复该过程一次的步骤。根据该优选实施方式，所得猪支架基本上没有病毒，但保留了大部分细胞外基质组合物，包括相当大比例的糖胺聚糖。根据一实施方式，该方法包括用水冲洗胎盘膜的步骤。
72.根据一实施方式，该方法包括每克胎盘膜添加或引入约1ml至约50ml缓冲溶液的步骤。根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜浸入缓冲溶液中的步骤。根据一实施方式，该
方法包括在缓冲溶液中以约20转/转速至约100转/分摇动胎盘膜约1分钟至约120分钟的步骤。然后可以倾析缓冲溶液。根据优选的实施方式，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。根据一实施方式，该方法包括在缓冲溶液处理后测量胎盘膜ph的步骤。根据一实施方式，加入缓冲溶液、摇晃和倾析的步骤可以重复，直到胎盘膜的ph值在约6.8和约7.2之间。
73.根据一实施方式，该方法包括用水冲洗胎盘膜的步骤。根据一实施方式，胎盘膜用水洗涤一次。根据一个实施例，冲洗步骤用水进行多次。根据一实施方式，将胎盘膜用水冲洗约2次至约5次。
74.当制备基于膜的构建体时，胎盘膜可以是湿的或脱水的。根据一实施方式，胎盘膜可以通过本领域已知的任何方法脱水，包括但不限于化学脱水(例如有机溶剂)、冻干、干燥、烘箱脱水和风干。根据优选的实施方式，该方法包括向胎盘膜添加或引入醇以覆盖胎盘膜的整个表面(即，浸没胎盘膜)的步骤。根据一实施方式，该方法包括每克胎盘膜添加或引入约1ml至约100ml酒精的步骤。根据一实施方式，胎盘膜完全浸没在酒精中约10分钟至约24小时。酒精可以是任何酒精安全的，适合与胎盘膜接触。根据具体实施方式，所述醇为乙醇。根据一实施方式，该方法包括从胎盘膜倾析或排出酒精的步骤。
75.根据一实施方式，该方法包括将胎盘膜铺展到干燥台(例如delrin干燥台)上的步骤。根据一实施方式，胎盘膜可以用微纤维或类似物擦拭。胎盘膜可以以完全脱水胎盘膜的方式扩散，同时确保不存在皱纹或气泡。
76.当制备基于膜的构建体时，该方法包括将胎盘膜切割成预定或所需尺寸的步骤。根据一实施方式，用旋转切割机或其它合适的仪器将胎盘膜切成一定尺寸。根据一个实施例，切割是用手术刀刀片进行的。
77.根据另一实施方式，该方法包括在胎盘膜中形成一个或多个(例如，多个)开窗的步骤。因此，所得的脚手架包括限定一个或多个开窗的表面(例如，通孔)。根据一实施方式，胎盘膜可以用手术刀刀片或其它装置开窗，与一个或多个开窗适当间隔，以提供足够的机会使伤口产生的渗出物通过胎盘膜，同时还要保持足够的胎盘膜表面积以有效地治疗诸如伤口或溃疡的缺陷。
78.本文提供的处理方法导致哺乳动物支架，其包括去细胞化的胎盘外基质，例如去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其来源于胎盘膜。
79.根据一实施方式，所述方法包括将切割的脚手架放置在一种或多种包装材料中的步骤。
80.根据一个实施例，所述方法包括对包装支架进行终端灭菌的步骤。根据一实施方式，终端灭菌的方法可以是电子束照射、γ照射、过氧乙酸处理、汽化过氧乙酸(vpa)处理、它们的任意组合、或本领域已知的任何其他终端灭菌方法。
81.根据另一实施方式，所述支架被配制成粉末基结构。在制备粉末基结构时，支架可以是湿的或脱水的。根据一实施方式，支架可以通过本领域已知的任何方法脱水，包括但不限于化学脱水(例如有机溶剂)、冻干、干燥、烘箱脱水和空气干燥。在一个实施例中，该方法包括将支架切割成多个条带的步骤。根据一实施方式，支架条随后可被放入磨机中并研磨成粉末以形成基于粉末的构建物。根据一实施方式，支架可由整个胎盘膜或其一部分组成，其可被放入磨机中并研磨成粉末以形成粉末基结构。根据一实施方式，基于粉末的构建物随后可以以所需浓度放置到适当的容器或小瓶中。根据一实施方式，制备粉末基结构的方
法包括在小瓶内冻干研磨/研磨的粉末基结构体以除去残留水分的一个或多个步骤。然后，对含有粉末基结构的小瓶进行最终灭菌。根据一实施方式，终端灭菌的方法可以是电子束照射、γ照射、过氧乙酸处理、汽化过氧乙酸(vpa)处理、它们的任意组合、或本领域已知的任何其他终端灭菌方法。
82.还提供一种治疗缺陷的方法。根据一个实施例，该方法包括提供本文提供的猪支架的步骤。然后将猪支架施用(例如，放置在缺陷上或周围)。该缺陷可能是软组织缺陷，包括伤口，例如烧伤、割伤或擦伤。根据一实施方式，所述缺陷选自部分厚度伤口、全厚度伤口、压疮、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道或破坏伤口、手术伤口、裂开伤口、擦伤、撕裂伤、二度烧伤、皮肤撕裂和引流伤口。该缺陷也可能是任何溃疡。根据一实施方式，伤口可以是哺乳动物身体上或体内任何部位的手术部位。猪支架可以放置在手术部位或由患者的肌肉组织或皮肤固定到位。缝合线或订书钉也可用于将基于膜的猪支架固定到位。猪支架可以在治疗期间在应用部位水合。猪支架也可以用作植入物。猪支架也可用于覆盖可以放置在哺乳动物体内或体内的植入物或其他装置。
83.根据一实施方式，本文提供的猪支架可与一般外科手术结合使用，以帮助级联愈合、减少粘连和减轻疼痛/炎症。此类一般外科手术包括但不限于乳房重建、疝气修复/腹壁重建/筋膜重建和血管旁路移植部位。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用作止血剂或生物胶水。
84.根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于治疗、减少和预防瘢痕形成。这种疤痕形成可能是创伤或外科手术的结果。外科手术包括任何可能导致疤痕的手术。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于神经外科手术，以帮助神经再生或修复，充当硬脑膜替代品、神经导管、神经包膜或与动脉瘤修复联合使用。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于骨科手术(例如，与肌肉、韧带和肌腱的运动相关损伤；骨相关手术(例如，脊柱)、全关节置换、椎板切除术(抗粘连屏障)、肌腱/韧带修复、神经修复、骨关节炎、软骨修复和骨移植)。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于结直肠手术，例如结肠吻合术或瘘管修复术。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于美容手术中作为皮肤填充剂或帮助皮肤皱纹减少、皮肤表面重铺、皮肤年轻化和其它美容目的。
85.根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于与心包贴片、心脏瓣膜小叶或血管移植物联合用于心血管手术。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于肺病学的肺修复。
86.根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于治疗和减少现有疤痕(例如，疤痕修订)。特别地，本文提供的猪支架可用于改善或减少疤痕的出现，恢复皮肤功能和纠正皮肤变化(毁容)，例如由受伤、伤口或先前手术引起的皮肤变化。根据一实施方式，本文中描述的猪支架可用作敷料，以帮助愈合和预防诸如与癌症切除相关的疤痕(例如，moh手术)。
87.根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于治疗耳、鼻、口或喉咙中的缺陷，例如在治疗口腔瘘管或鼻中隔修复中。在一些实施方式中，本文提供的猪支架可用于治疗牙齿缺陷，例如在牙科植入物的包裹中、治疗晚期牙龈萎缩缺陷、软调色板重建、牙周缺陷或引导组织修复。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于治疗眼科病症(例如，眼表面修复、角膜炎、角膜溃疡/盾或紫苜)。根据一实施方式，本文提供的猪支架可用于治疗各种妇科或泌尿科应用，例如输尿管修复、子宫切除术、子宫纤维化、尿失禁或阴道脱垂。
88.尽管本发明的具体实施方式在此示示和详细描述，但本发明并不局限于此。以上
详细描述是作为本发明的示例性的提供，不应被解释为构成对本发明的任何限制。修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且所有不偏离本发明精神的修改都旨在包括在所附权利要求的范围中。
89.【实施例1：猪细胞因子检测与定量】
90.【天然猪胎盘膜与猪支架】
91.对以下细胞因子进行定量：(1)从分别从3个品种的3头母猪分离出的猪胎盘膜制备的猪支架；及(2)从同一3个不同品种的3头不同母猪中分离出的天然猪胎盘膜。猪支架样品按照本文提供的方法制备。
92.通过创建每个单独样品的裂解物来制备猪样品以进行定量。对于每个样品，将组织置于带有6ml裂解缓冲液的微量离心管中，该缓冲液含有来自美国佐治亚州norcross的raybiotech的蛋白酶抑制剂，并在4℃下温育过夜。将组织在4℃下匀浆2分钟。将微量离心管置于4℃下以10,400rpm的离心机中20分钟。将所得上清液移入微eppendorf管中。使用美国佐治亚州norcross的raybiotech的bca蛋白质定量试剂盒对上清液进行蛋白质定量，以评估上清液中蛋白质的总含量。在用于细胞因子定量之前，将样品稀释至标准浓度。
93.细胞因子定量利用来自美国佐治亚州norcross的raybiotech的阵列进行。阵列专门用于检测在根据本文提供的方法处理时用于生产猪支架的猪胎盘膜中存在的标准细胞因子。表1提供了使用阵列测试的每个细胞因子的最低检测水平(称为“lod”)和最大检测限(称为“max”)。
94.【表1】
95.[0096][0097]
基于elisa的阵列多重夹心定量阵列平台能够同时测定猪组织中通常存在的多种细胞因子的浓度。阵列利用一对细胞因子特异性抗体进行检测。捕获抗体首先与玻璃表面结合。与样品猪组织温育后，将目标细胞因子捕获在固体表面上。然后加入第二种生物素标记的检测抗体，该抗体可以识别靶细胞因子的不同表位。然后使用激光扫描仪通过添加链霉亲和素偶联的cy3等效染料来观察细胞因子-抗体-生物素复合物。
[0098]
在猪支架中检测到的每种细胞因子的定量结果在表2和表3中提供，分别针对9头母猪(母猪a-母猪i)。
[0099]
【表2】
[0100]
[0101]
[0102][0103]
【表3】
[0104]
[0105][0106]
在表4和表5中对于9头母猪(母猪j-母猪r)中的每一头提供了在天然猪胎盘膜中检测到的每种细胞因子的定量结果。
[0107]
【表4】
[0108]
[0109][0110]
【表5】
[0111]
[0112][0113][0114]
为了比较猪支架与天然猪胎盘膜的定量结果，将pg/ml浓度转换为以pg/mg为单位的质量质量比浓度，因为：(i)每个单独的样品在加工过程中具有唯一量的总蛋白质提取；
(ii)在放入阵列之前稀释所得蛋白质溶液。根据每头母猪已知起始组织的质量、蛋白质提取浓度和稀释体积，计算每个样品的起始组织质量中每种细胞因子的准确pg/mg浓度。这些计算的结果如表6至表9所示。
[0115]
【表6】
[0116]
[0117][0118]
【表7】
[0119]
[0120][0121]
【表8】
[0122]
[0123][0124][0125]
【表9】
[0126]
[0127][0128]
使用质量质量比值统计比较猪支架与天然猪胎盘膜的细胞因子浓度。在所有18个样品中可检测到的6种细胞因子的大多数样品处于阵列的最佳置信范围内，并显示出静态显著差异(p＜0.05)(见表10)。
[0129]
【表10】
[0130][0131]
用于从天然猪胎盘膜制造猪支架的过程大大增加了饰胶蛋白聚糖、血小板衍生生长因子-bb(pdgf-bb)和血管内皮生长因子(vegf)的浓度。相反，用于从天然猪胎盘膜创建猪构建体的过程大大降低了巨噬细胞迁移抑制因子(mif)，金属蛋白酶2的组织抑制剂(timp-2)和胎盘生长因子2(plgf-2)的浓度。已知这6种因素都会对皮肤伤口愈合产生影响。
[0132]
饰胶蛋白聚糖是一种蛋白聚糖，与i型胶原蛋白结合并在细胞外基质组装中发挥作用。一项调查饰胶蛋白聚糖在皮肤伤口愈合中的作用的研究发现，植入海绵的血管形成和纤维血管向内生长增加(jarvelainen，2006)。猪支架中饰胶蛋白聚糖浓度的增加通过增加伤口部位的血管形成，为放置后的伤口愈合提供了促进作用。
[0133]
pdgf-bb是已知调节细胞生长和分裂的生长因子。该蛋白的重组版本已成功治疗慢性伤口(wieman，1998)。一项检查细胞因子在非愈合和愈合的慢性腿部溃疡中的活性和浓度的研究发现，与未愈合的伤口相比，在愈合的伤口中观察到高浓度的pdgf(trengrove，2001)。多项研究表明，pdgf对血小板，角质形成细胞，巨噬细胞，内皮细胞和成纤维细胞有影响(barrientos，2008)，同时特别影响基质形成和重塑(heldin 1999；lederle，2006；
uutela，2004)。猪支架中pdgf-bb浓度的增加可能会影响在愈合反应中起作用的多种细胞类型。
[0134]
vegf是已知刺激新血管形成的生长因子。一项检查了不愈合和愈合的慢性腿部溃疡中细胞因子的活性和浓度的研究发现，与不愈合的伤口相比，在愈合的伤口中观察到高浓度的vegf(trengrove，2001)。研究表明，vegf对血小板，中性粒细胞，巨噬细胞，内皮细胞和成纤维细胞有影响(barrientos 2008)，同时特别影响血管生成(johnson，2014；jazwa，2006；thomas，1996)和肉芽组织形成(yerba 1996，nissen 1998)。猪支架中vegf浓度的增加可能会影响多种细胞类型的早期再生反应。
[0135]
mif是一种促炎细胞因子和先天免疫调节剂，在皮肤伤口愈合中具有复杂的作用。研究表明，mif可以引起修复和炎症反应(gilliver，2010)。研究表明，mif在早期炎症反应中起着重要作用，但在伤口愈合后期的较高水平可以抑制这一过程(ashcroft，2003；shimizu，2005)。猪支架中mif浓度的降低可能对伤口愈合过程中的炎症调节产生积极影响。
[0136]
timp-2是基质金属蛋白酶(mmp)活性的抑制剂，通过阻止mmp分解ecm蛋白在细胞外基质稳态中起重要作用。与其他timp不同，timp-2已被证明可以抑制内皮细胞的增殖(murphy，1993)。猪支架中timp-2浓度的降低可能允许抑制剂对mmp的作用，而不会对内皮细胞增殖产生负面影响。
[0137]
plgf-2是vegf亚家族成员的生长因子，在血管生成和血管生成中起关键作用，特别是在胚胎发生过程中。研究表明，plgf在伤口愈合过程中由角质形成细胞产生(failla，2000)，并刺激成纤维细胞产生胶原蛋白(arif，2020)。猪支架中plgf-2浓度降低，但不能完全去除，可能会刺激伤口愈合过程中胶原蛋白的产生。
[0138]
还注意到，用于制造猪支架的过程在统计学上显著地增加了转化生长因子-β1(tgf-β1)和胰岛素样生长因子-2(igf-2)的浓度，使得它们在猪支架的测定中可检测但低于检测水平或天然猪胎盘膜测定的最佳置信范围。已知这2种生长因子对皮肤伤口愈合有影响。2种细胞因子的比较见表11。
[0139]
【表11】
[0140][0141]
tgf-β生长因子超家族，包括tgf-β1，已知调节多种细胞功能，包括细胞生长、细胞增殖和细胞分化。一项研究检查了tgf-β1对伤口愈合各个方面的影响，并表明随着生长因子的应用，成纤维细胞的体外增殖增加(rolfe，2007)。第二项研究强调了tgf-β在刺激肉芽组织产生中的作用(singer，1999)。多项研究表明，tgf-β对血小板、角质形成细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞有影响(barrientos，2008)，同时特别影响细胞外基质的形成和重塑(tsunawaki 1988，riedel 2007)。猪支架中tgf-β1浓度的增加可能会影响多种细胞类型的愈合反应。
[0142]
igf-2是已知调节细胞生长的生长因子，特别是在胎儿发育期间。一项研究表明，在伤口愈合的大鼠模型中，igf-2表达从最初的损伤增加到损伤后10至15天(gartner，
1992)。第二项研究证实，igf-2在初始损伤后表达增加，并且在糖尿病动物中表达水平更高。该研究还将igf-2定位为愈合伤口的上皮(brown 1997)。猪支架中igf-2浓度的增加可能会影响上皮愈合。

技术特征：
1.猪支架，其包括：去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其中所述猪支架包含至少一种细胞因子，其以不同于天然猪胎盘膜的量存在。2.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约70pg/mg的量存在。3.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是mif，其以小于约50pg/mg的量存在。4.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约75pg/mg的量存在。5.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是timp-2，其以小于约175pg/mg的量存在。6.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约3pg/mg的量存在。7.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。8.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约82pg/mg的量存在。9.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约7pg/mg的量存在。10.根据权利要求1所述的猪支架，其中所述脱水猪胎盘膜采用生物负荷降低步骤、洗涤剂漂洗步骤和病毒灭活步骤进行处理。11.猪支架，其包括：去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其中所述猪支架包含至少一种细胞因子，用于增加伤口部位的血管形成。12.根据权利要求11所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是饰胶蛋白聚糖，其以至少约70pg/mg的量存在。13.根据权利要求11所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是vegf，其以至少约3pg/mg的量存在。14.根据权利要求11所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。15.猪支架，其包括：去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其中所述猪支架包含至少一种细胞因子以调节细胞生长和分裂。16.根据权利要求15所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是pdgf-bb，其以至少约75pg/mg的量存在。17.根据权利要求15所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是tgf-β1，其以至少约82pg/mg的量存在。18.根据权利要求15所述的猪支架，其中所述至少一种细胞因子是igf-2，其以至少约7pg/mg的量存在。
19.猪支架，其包括：去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其中所述猪支架包含至少一种抑制基质金属蛋白酶活性的细胞因子。20.根据权利要求19所述的猪支架，其中所述细胞因子是timp-2，其以小于约175pg/mg的量存在。21.猪支架，其包括：去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其中所述猪支架包含至少一种用于炎症调节的细胞因子。22.根据权利要求21所述的猪支架，其中所述细胞因子是mif，其以小于约50pg/mg的量存在。23.猪支架，其包括：去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其中所述猪支架包含至少一种用于刺激胶原蛋白生成的细胞因子。24.根据权利要求23所述的猪支架，其中所述细胞因子是pigf-2，其以小于约30pg/mg的量存在。25.处理缺陷的方法，该方法包括以下步骤：对缺陷施用根据权利要求1～24之任一项所述的猪支架。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述缺陷选自：部分厚度伤口、全厚度伤口、压疮、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道或破坏伤口、手术伤口、裂开伤口、擦伤、撕裂伤、二度烧伤、皮肤撕裂和引流伤口。27.伤口敷料，其包含根据权利要求1～24之任一项所述的猪支架。28.根据权利要求27所述的伤口敷料，其中所述猪支架包括限定一个或多个开窗的表面。

技术总结
本发明提供猪支架，包括去细胞化的猪胎盘细胞外基质，其经过处理以包括一种或多种与天然猪胎盘膜不同的量的细胞因子。还提供了治疗伤口的方法。伤口的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：康维德公司
技术研发日：2021.05.26
技术公布日：2023/8/16