异柯里拉京在制备抗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用

1.本发明属于药剂技术领域，具体涉及异柯里拉京在制备抗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征，简称prrs，别名猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种猪传染病，猪是prrsv唯一已知的天然宿主。20多年来，猪繁殖和呼吸综合征一直是世界范围内最具经济意义的猪疾病之一。据有关调查，prrs可使美国养猪业造成巨大经济损失。该病的主要临床症状是妊娠母猪繁殖障碍、新生仔猪高死亡率、不同年龄段猪呼吸困难。1987年，美国最早发现该病，欧洲地区在1990年也报道存在该病。高致病性猪繁殖与呼吸综合征简称hp-prrsv，于2006年在我国突然暴发，由于 其发病率高和死亡快的特点，对我国养猪业造成严重打击。2012年起，prrsv nadc30-like毒株开始在我国广泛流行 ，2017年我国首次报道nadc34-like prrsv，该毒株与美国prrsv流行株1-4-4新型变异株属于同一分支。近几年来，很多中药及中药单体都表现出比较明显的抗prrsv作用，中药正逐渐成为控制猪繁殖和呼吸综合征病毒的有效替代品。
3.异柯里拉京具有抑制胆碱酯酶、抗氧化、助消化、抗糖尿病、降血脂、降血压的活性。专利cn108434167a异柯里拉京在制备抗流感病毒药物中的应用中公开了从青果中提取异柯里拉京具有较强的抗流感病毒和艾滋病毒，在50μg/ml浓度下的抑制率高达90.01%。现有研究表明，异柯里拉京可与na活性位点中高度保守的残基结合，意味着异柯里拉京可能对各种流感菌株有效，且不易产生耐药性。也有研究公开了，从热带植物叶下珠的水提取物中分离纯化获得异柯里拉京及柯里拉京，在测试二者对clone-9和hepg2细胞系的体外肝保护活性时，二者均能显著降低ccl4诱导的ast、alt和gsh升高，从而发现二者均具有较强得肝保护活性。但未见异柯里拉京在抗猪繁殖与呼吸综合征的研究。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的缺点，本发明提供异柯里拉京在制备抗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：异柯里拉京在制备抗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用，所述异柯里拉京的结构式为：。
6.本发明所述异柯里拉京为紫地榆、余甘子、叶下珠等中药的提取物，是多种植物的
主要活性成分之一，化学式为c
27h22o18
，结构式为异 1-o-没食子酰-3，6-（r）-o-六羟基联苯酰-α-d-葡萄糖，是柯里拉京的α异构体看，具有抗氧化、助消化、降血脂、降血压、提高免疫力等功效。现有技术发现异柯里拉京可用于制造抗流感病毒、抗艾滋病、护肝或抗hsv-1病毒的药物。本发明提取出天然的异柯里拉京，首次将其作为潜在的抗猪繁殖与呼吸综合征药物。
7.所述异柯里拉京的提取方法，包括如下步骤：将紫地榆粉碎，按照1g：30ml的料液比用95%的乙醇浸泡，在45℃、120r/min搅拌下提取4次，每次提取0.5h，滤去提取物中不溶杂质，清液减压蒸馏浓缩至浓稠膏状物；将浓稠膏状物加水，超声30min，然后按照液液比为1：1加入石油醚进行萃取，将萃取后的水相中加入体积比为1：1的乙酸乙酯及逆行萃取至乙酸乙酯有机相清亮，合并有机相，蒸馏浓缩得到有机萃提物；将有机萃提物使用hplc进行分离、制备；所述hplc的色谱条件为：选用c18色谱柱，规格为10
×
250mm，5μm，waters 966紫外可见光检测器，检测波长254nm和350nm，柱温30℃，进样体积200μl，流动相为甲醇（b）和0.5%甲酸水（d），流量5.00ml/min，梯度洗脱：0-30min，b10%
→
35%；30-40min，b35%
→
100%；40-50min，b100%
→
100%；50-51min，b100%
→
10%，洗脱时间51min。
8.作为本发明的优选实施方式，所述异柯里拉京提取自紫地榆、余甘子、叶下珠等中药材。
9.一种抗猪繁殖与呼吸综合征的药物，所述药物的有效成分包括异柯里拉京。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过建立体外prrsv感染marc-145模型，使用ctg法测定异柯里拉京对marc-145细胞的tc0和tc
50
分别为260μg/ml和770.43μg/ml，对比现有的天然中药对marc-145细胞的tc0和tc
50
，本发明所述异柯里拉京对marc-145细胞的毒性相对较小，安全浓度较高。同时本发明采用了三种不同的给药方式进行异柯里拉京对prrsv病毒体外抑制作用的探索，即药和病毒共同孵育后感染细胞为直接杀灭病毒、先加药后加病毒为阻断病毒吸附细胞、先加病毒后加药为抑制病毒胞内复制，发现，异柯里拉京能够显著的直接杀灭prrsv、阻断prrsv吸附marc-145细胞和抑制prrsv在细胞中复制增殖，其体外抗prrsv效果显著强于利巴韦林。因此，本发明公开异柯里拉京在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物具有潜在的应用价值，为抗prrsv药物的开发提供新的思路，对中草药的开发和利用具有一定的意义。
附图说明
11.图1为本发明实施例2所述异柯里拉京对marc-145增殖的影响图。图1a为不同异柯里拉京药液浓度下marc-145细胞的化学发光值对比图。图1b为不同异柯里拉京药液浓度下对marc-145细胞的抑制率。
12.图2为本发明实施例2所述利巴韦林对marc-145增殖的影响图。图2a为不同利巴韦林浓度下marc-145细胞的化学发光值对比图。图2b为不同利巴韦林浓度下对marc-145细胞的抑制率。
13.图3为本发明实施例3所述异柯里拉京对prrsv病毒的杀灭作用的对比图。图3a为本发明实施例3中不同异柯里拉京药液浓度下marc-145细胞的化学发光值。图3b为本发明
实施例3中不同异柯里拉京药液浓度对prrsv病毒的杀灭率。
14.图4为本发明实施例3中不同异柯里拉京药液浓度对prrsv的杀灭作用细胞图。
15.图5为本发明实施例3中所述利巴韦林对prrsv病毒的杀灭作用的对比图。图5a为本发明实施例3中不同利巴韦林浓度下marc-145细胞的化学发光值。图5b为本发明实施例3中不同利巴韦林浓度对prrsv病毒的杀灭率。
16.图6为本发明实施例4所述异柯里拉京对prrsv病毒的阻断作用的对比图。图6a为本发明实施例4中不同异柯里拉京药液浓度下marc-145细胞的化学发光值。图6b为本发明实施例4中不同异柯里拉京药液浓度对prrsv病毒的阻断率。
17.图7为本发明实施例4中所述利巴韦林对prrsv病毒的阻断作用的对比图。图7a为本发明实施例4中不同利巴韦林浓度下marc-145细胞的化学发光值。图7b为本发明实施例4中不同利巴韦林浓度对prrsv病毒的阻断率。
18.图8为本发明实施例5所述异柯里拉京对prrsv病毒的抑制作用的对比图。图8a为本发明实施例5中不同异柯里拉京药液浓度下marc-145细胞的化学发光值。图8b为本发明实施例5中不同异柯里拉京药液浓度对prrsv病毒的抑制率。
19.图9为本发明实施例5中所述利巴韦林对prrsv病毒的抑制作用的对比图。图9a为本发明实施例5中不同利巴韦林浓度下marc-145细胞的化学发光值。图9b为本发明实施例5中不同利巴韦林浓度对prrsv病毒的抑制率。
20.图10为本发明实施例6中prrsv n基因mrna相对表达变化图。
21.图11为本发明实施例6中prrsv感染marc-145细胞后tnf-α mrna表达变化图。
22.图12为本发明实施例6中prrsv感染marc-145细胞后iκbα mrna表达变化图。
23.图13为本发明实施例6中prrsv感染marc-145细胞后p65 mrna表达变化图。
24.图14为本发明实施例6中prrsv感染marc-145细胞后il-6 mrna表达变化图。
25.图15为本发明实施例6中prrsv感染marc-145细胞后il-8 mrna表达变化图。
26.其中，图中ykllj为异柯里拉京药液，rib为利巴韦林。
具体实施方式
27.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
28.本发明实施例中使用的细胞维持液由2%胎牛血清、2%双抗和96%dmem培养液组成的。
实施例1
29.本发明实施例所述异柯里拉京的提取方法，包括如下步骤：（1）将紫地榆粉碎至40目，称取300g紫地榆粉末，按照1g：30ml的料液比用95%的乙醇浸泡，在45℃、120r/min搅拌下提取4次，每次提取0.5h，滤去提取物中不溶杂质，清液在60℃减压蒸馏浓缩至浓稠膏状物；（2）将称取浓稠膏状物50g加500ml蒸馏水，超声30min，然后按照液液比为1：1加入石油醚进行萃取至上层有机相澄清透亮，将石油醚萃取水相合并，将合并后的水相中加入体积比为1：1的乙酸乙酯及逆行萃取至乙酸乙酯有机相清亮，合并有机相，60℃下负压蒸馏
145细胞的2倍tc0为最大药物浓度，使用细胞维持液将异柯里拉京2倍比梯度稀释成5个浓度异柯里拉京药液，即260
µ
g/ml、130
µ
g/ml、65
µ
g/ml、32.5
µ
g/ml和16.25
µ
g/ml，将各浓度异柯里拉京药液与prrsv病毒稀释液（200 tcid50）等体积混合，于37℃、5%co2培养箱中孵育2h，期间多次缓慢颠倒混匀，按100
µ
l/孔加至24h长满marc-145细胞的96孔板中，每个药物浓度设置8个复孔。同时，设置正常marc-145细胞对照组、空白对照组、prrsv病毒对照组，于37℃、5%co2培养箱孵育2h，吸掉孔内prrsv病毒与异柯里拉京药物混合液，用pbs洗2遍，加入维持液100
µ
l/孔，于37℃、5%co2培养箱培养一定时间，每天观察marc-145细胞cpe情况。待prrsv病毒对照病变达到90%以上时，用cell titer-glo化学发光法检测细胞活性。
38.同时测定阳性对照浓度为12.5
µ
g/ml、25
µ
g/ml、50
µ
g/ml、100
µ
g/ml和200
µ
g/ml的利巴韦林对prrsv的杀灭作用。
39.本实施例使用不同浓度的异柯里拉京药液与prrsv（100 tcid50）混合孵育2h后感染细胞。由图3可知，药物组细胞活性极显著高于prrsv组（p《0.0001或p《0.01），在浓度为16.25-260
µ
g/ml范围内，异柯里拉京对prrsv的杀灭率随药物浓度升高而升高，浓度为260
µ
g/ml对prrsv病毒的杀灭率最高，为101.33%。经spss 26分析异柯里拉京对prrsv病毒杀灭作用的ec
50
=56.46
µ
g/ml，si》13.64。由图4可知，浓度为16.25-65
µ
g/ml范围内，marc-145细胞均出现皱缩、脱落病变；浓度为130和260
µ
g/ml下，marc-145细胞状态正常。由图5可知，利巴韦林组细胞活性在50-200
µ
g/ml范围内极显著高于prrsv组（p《0.01），200
µ
g/ml浓度的杀灭率最高，为7.14%。异柯里拉京对prrsv的杀灭率高于利巴韦林。
实施例4
40.本实施例用于异柯里拉京对prrsv病毒的阻断作用的测定。
41.以异柯里拉京对marc-145细胞的tc0为最高药物浓度，使用细胞维持液2倍比梯度稀释成5个浓度异柯里拉京药液，即260
µ
g/ml、130
µ
g/ml、65
µ
g/ml、32.5
µ
g/ml和16.25
µ
g/ml，于24h长满marc-145细胞的96孔板中加入各浓度异柯里拉京药液，100
µ
l/孔，每个浓度设8个复孔。同时设正常细胞对照组、空白对照组和病毒对照组，于37℃、5%co2培养箱中孵育2h，吸掉药液，pbs洗涤2遍，除了细胞对照外，每孔加入100
µ
l prrsv病毒稀释液（100 tcid
50
），于37℃、5%co2培养箱中孵育2h，吸掉病毒液，pbs洗涤2遍，加入细胞维持液，100
µ
l/孔，于培养箱培养一定时间，每天观察细胞cpe情况，待病毒对照病变达到90%以上时，用cell titer-glo化学发光法检测细胞活性。
42.同时测定阳性对照浓度为12.5
µ
g/ml、25
µ
g/ml、50
µ
g/ml、100
µ
g/ml和200
µ
g/ml的利巴韦林对prrsv的阻断作用。
43.本实施例先使用不同浓度药液孵育marc-145细胞2h，去掉药液后再孵育prrsv（100 tcid
50
）2h，后换维持液。由图6可知，用药组细胞活性极显著高于prrsv组（p《0.0001或p《0.01），异柯里拉京对prrsv的阻断作用在浓度为16.25-260
µ
g/ml范围内呈浓度依赖性，阻断率随浓度升高而升高，浓度为260
µ
g/ml浓度的阻断率最高，为86.07%，ec
50
=54.70
µ
g/ml，si》14.09。由图7可知，利巴韦林组细胞活性在50-200
µ
g/ml显著高于prrsv组（p《0.05或p《0.01），其对prrsv的阻断作用低于异柯里拉京，200
µ
g/ml的阻断率最高，为9.01%。
实施例5
44.本实施例用于异柯里拉京对prrsv病毒的抑制作用的测定。
45.在96孔板培养24h长满的marc-145细胞中，实验组和病毒对照组均加入prrsv病毒稀释液（100 tcid
50
），100
µ
l/孔，于培养箱中孵育2h，吸掉病毒液，pbs洗涤2遍，从左到右依次加入以tc0为最高药物浓度，用细胞维持液2倍比梯度稀释制成的异柯里拉京药液，即260
µ
g/ml、130
µ
g/ml、65
µ
g/ml、32.5
µ
g/ml和16.25
µ
g/ml，100
µ
l/孔，每个浓度设8个复孔，同时，设置正常细胞对照组、空白对照组和病毒对照组，于培养箱中孵育2h，吸掉药液，pbs洗涤2次，每孔加入细胞维持液100
µ
l，于37℃、5%co2培养箱中培养一定时间，每天观察细胞cpe情况。待病毒对照病变达到90%以上时，用cell titer-glo试剂测细胞化学发光值。
46.本实施例采用prrsv（100 tcid
50
）孵育marc-145细胞2h后，去掉病毒液，再上不同浓度药液的方式。由图8可知，用药组(异柯里拉京)细胞活性极显著高于prrsv组（p《0.001或p《0.0001或p《0.01）。异柯里拉京对prrsv的抑制作用在浓度为16.25-130
µ
g/ml范围内，呈浓度依赖性升高，抑制率在浓度为130
µ
g/ml时最高，为95.01%，ec
50
=23.51
µ
g/ml。由图9可知，与prrsv组相比，利巴韦林组细胞活性极显著高于prrsv组（p《0.01或p《0.0001），其对prrsv也有抑制作用，50
µ
g/ml浓度抑制率最高，为73.66%，ec
50
=36.176
µ
g/ml。由ec
50
值可知异柯里拉京对prrsv的抑制作用优于利巴韦林。
47.si为选择指数，是判断药物效果的安全范围，si为tc
50
/ec
50
，si大于1.00以上说明药物有效，指数越大药物安全范围越大。异柯里拉京对prrsv的杀灭、阻断、抑制作用的si值分别为si》13.64、si》14.09、si》32.76异柯里拉京的3种作用方式的抑制率均大于50%，选择指数si均大于1，说明异柯里拉京低毒高效，符合抗病毒兽药研发的要求，可做进一步研究。
48.根据实施例3-5可知，本发明所述异柯里拉京通过三种给药方式，证明了异柯里拉京可以通过过三个方面抗病毒：根据实施例3的药和病毒共同孵育感染细胞的给药方式证明了异柯里拉京可直接将prrsv病毒灭杀；根据实施例4的细胞中先加药后加病毒的给药方式证明了异柯里拉京能够阻断病毒吸附细胞，可以起到预防的作用，防治病毒吸附感染细胞；另外根据实施例5的细胞中先加病毒后加药的给药方式，异柯里拉京能够抑制病毒在细胞内复制，阻断病毒进一步感染细胞。
实施例6
49.运用rt-qpcr检测prrsv病毒在不同感染时间感染marc-145细胞的试验。
50.取贴壁培养的marc-145细胞6孔板，设置实验组(异柯里拉京+prrsv病毒)、病毒对照组、阳性对照（rib+prrsv病毒）组、细胞对照组，每组3孔重复。给药方式按照实施例5的给药方式进行处理，异柯里拉京的药物浓度为260μg/ml，分别在加样后0h、3h、12h、24h、48h、56h、64h、72h、80h、88h、96h、108h、120h收集各组细胞及上清，提取细胞总rna并反转录，利用rt-qpcr检测prrsv n、tnf-α、iκbα、p65、il-6、il-8 mrna的表达水平。
51.由图10可知，从prrsv n基因mrna的表达水平看，在56-120h时段内，prrsv组极显著高于细胞对照组（p《0.01或p《0.0001）；rib组在72-88h极显著或显著低于prrsv组（p《0.01或p《0.05），其他时间点均低于prrsv组，但差异不显著（p》0.05），无统计学意义；异柯里拉京组均极显著低于prrsv组（p《0.0001）。
52.由图11从tnf-α mrna的表达水平来看，64h-120h时段内，prrsv组和rib组极显著
高于细胞对照组（p《0.01或p《0.0001）；rib组在80h-96h极显著低于prrsv组（p《0.01），其他时间点差异不显著（p》0.05），无统计学意义；异柯里拉京组与细胞对照组差异不显著（p》0.05），极显著低于prrsv组（p《0.01或p《0.0001）。
53.由图12可知，从iκbα mrna的表达水平来看，在64h-120h时段内，prrsv组和rib组极显著高于细胞对照组（p《0.01或p《0.0001）；rib组在80h-96h显著或极显著低于prrsv组（p《0.05或p《0.01），其他时间点差异不显著（p》0.05），无统计学意义；异柯里拉京组与细胞对照组差异不显著（p》0.05），极显著低于prrsv组(p《0.01或p《0.0001）。
54.由图13可知，从p65 mrna的表达水平来看，在56h-88h时段内，prrsv组显著或极显著高于细胞对照组（p《0.05或p《0.01）；rib组在56h和64h显著高于细胞对照组（p《0.05、p《0.01），在64h-80h显著低于prrsv组（p《0.05），其他时间点差异不显著（p》0.05），无统计学意义；异柯里拉京组与细胞对照组差异不显著（p》0.05），极显著或显著低于prrsv组（p《0.01或p《0.05）。
55.由图14可知，从il-6 mrna的表达水平来看，在56h-120h时段内，prrsv组和rib组显著或极显著高于细胞对照组（p《0.05或p《0.0001）；rib组在80h-96h显著或极显著低于prrsv组（p《0.05或p《0.01），其他时间点差异不显著（p》0.05）；异柯里拉京组与细胞对照组差异不显著（p》0.05），显著或极显著低于prrsv组（p《0.05或p《0.0001）。
56.由图15知，从il-8 mrna的表达水平来看，在64-120h时段内，prrsv组和rib组极显著高于细胞对照组（p《0.01或p《0.0001）；rib在80h-108h极显著或显著低于prrsv组（p《0.01或p《0.05）；异柯里拉京与细胞对照组差异不显著（p》0.05），整体水平均极显著低于prrsv组（p《0.01或p《0.0001）。
57.总体上prrsv组tnf-α、iκbα、p65、il-6、il-8 mrna的表达水平均呈先升高后降低的趋势，异柯里拉京对下调以上基因mrna的表达作用明显，而rib对其下调效果低于异柯里拉京。
58.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.异柯里拉京在制备抗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用，其特征在于，所述异柯里拉京的结构为：。2.一种抗猪繁殖与呼吸综合征的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括异柯里拉京。

技术总结
本发明公开了异柯里拉京在制备抗猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用，属于药剂技术领域。对比现有的天然中药对Marc-145细胞的TC0和TC


技术研发人员：常华 项勋 段博芳 李隽 代飞燕 段纲 杨林富 阮谦 王绍卿 杨茜
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/8/16