检测抗PEG-rhGH中和抗体的方法与流程

检测抗peg-rhgh中和抗体的方法
技术领域
1.本技术涉及检测聚乙二醇重组人生长激素中和抗体的新型分析方法。


背景技术：

2.人体内含有不同量的生长激素（gh），正常人群gh范围是0.06-5.0 ng/ml，新生儿为15.0-40.0 ng/ml，表明存在结构相关的内源性分子，则聚乙二醇重组人生长激素（peg-rhgh）中和抗体检测需首选基于细胞的分析，因此，需要选择合适的细胞系。此外，细胞学方法容易受内源性干扰，且不同年龄段、不同时间段、身体状况等均会影响内源性gh水平，导致个体血清差异大，因此，在中和抗体方法学建立过程中，还面临一个主要挑战是内源性gh的干扰。
3.一般进行临床验证的受试者是发育不全、矮小儿童，其体内gh水平低，很难获取到该类血清用于方法学建立和验证，一般采用健康成人血清替代作为混合血清使用，因而，除了个体血清之间有差异外，该类个体血清和混合血清之间也存在差异。
4.目前还未有检测人血清中抗peg-rhgh中和抗体的文献，对于同类产品如促红细胞生成素（epo）的中和抗体研究中，其为常规的基于细胞的分析，体内内源性epo的含量（10 ~ 30u/l）不会影响中和抗体检测。此外，现有解决上述问题的技术方法一般有酸解离、亲和免疫耗竭等，但一般的酸解离条件会影响细胞状态或结合能力而干扰方法，而亲和免疫耗竭一定程度上影响方法灵敏度，其效果都不是最好的。


技术实现要素：

5.第一方面，本技术提供了一种检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的方法，所述方法包括：对所述液体生物样品进行加热处理；向加热处理后的液体生物样品中添加乙酸溶液；添加中和试剂；以及检测液体生物样品中的抗peg-rhgh中和抗体。
6.在一些实施方案中，所述加热处理为50至60℃水浴25至45分钟。
7.在一些实施方案中，所述加热处理为56℃水浴30至35分钟。
8.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的ph为1.3-1.7。
9.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的ph为1.5。
10.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的浓度为250-350 mm。
11.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的浓度为300 mm。
12.在一些实施方案中，所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:3至1:5。
13.在一些实施方案中，所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:4。
14.在一些实施方案中，所述中和试剂为1 m的2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇缓冲液。
15.在一些实施方案中，所述中和试剂的添加量占总体系体积的1/10至1/3。
16.在一些实施方案中，所述中和试剂的添加量占总体系体积的1/6。
17.在一些实施方案中，所述生物样品为血清。
18.在一些实施方案中，所述生物样品为人血清。
19.在一些实施方案中，检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体包括使用发光法细胞活力检测技术，以确定样品中的抗peg-rhgh中和抗体。
20.第二方面，本技术提供了用于检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：乙酸；和用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂。
21.在一些实施方案中，所述用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂是celltiter-glo试剂。
22.第三方面，本技术提供了乙酸在制备用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂盒中的用途。
附图说明
23.图1示出了经加热处理并使用乙酸处理后的灵敏度，约为800 ng/ml；图2示出了优化前和优化后的人个体血清抑制率差异比较，优化后（加热处理和乙酸处理）不同个体血清间抑制率差异变小，结果更加稳定。
具体实施方式
24.申请人建立了一种经高温热处理、特殊酸解条件（强酸环境）后的基于高表达ghr的细胞增殖终点法，在去除内源性gh干扰方面得到了显著改善。
25.抗peg-rhgh中和抗体检测技术方法原理如下：本分析方法通过发光法细胞活力检测以确定样品中的抗peg-rhgh中和抗体，例如，通过celltiter-glo试剂检测细胞增殖的终点法进行观测，其是以高表达ghr的细胞（即baf3细胞）为靶细胞，该细胞表面存在生长激素受体（ghr）且细胞生长增殖依赖于gh。首先，将peg-rhgh与加热处理、酸处理且酸碱中和后的系统适用性样品/验证样品/待测样品进行温育，确保药物-抗体复合物充分结合；然后将细胞铺板且加入温育好的药物-抗体复合物，若样品中无抗peg-rhgh中和抗体，体系中rhgh或peg-rhgh则能与细胞表面ghr特异性结合并激活细胞内部信号通路而刺激细胞增殖；若样品有中和抗体，其能阻断rhgh或peg-rhgh与细胞表面ghr结合而抑制细胞正常增殖；细胞经培养后加入celltiter-glo试剂进行定量检测活细胞atp，其通过在化学发光检测仪器上读取的仪器响应值（rlu）来表征活细胞的数量高低；若样品中无中和抗体，其rlu随活细胞atp升高而增高，反之则降低。阳性对照样品用100%混合健康人血清配制。
26.第一方面，本技术提供了一种检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的方法，所述方法包括：对所述液体生物样品进行加热处理；向加热处理后的液体生物样品中添加乙酸溶液；添加中和试剂；以及检测液体生物样品中的抗peg-rhgh中和抗体。
27.在一些实施方案中，所述加热处理为50至60℃水浴25至45分钟。
28.在一些实施方案中，所述加热处理为50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60℃水浴，或者上述任意数值之间的范围。
29.在一些实施方案中，所述加热处理为水浴25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45分钟，或者上述任意数值之间的范围。
30.在一些实施方案中，所述加热处理为56℃水浴30至35分钟。
31.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的ph为1.3-1.7。
32.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的ph为1.3、1.4、1.5、1.6或1.7，或者上述任意数值之间的范围。
33.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的ph为1.5。
34.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的浓度为250-350 mm。
35.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的浓度为250、260、270、280、290、300、310、320、330、340或350 mm，或者上述任意数值之间的范围。
36.在一些实施方案中，所述乙酸溶液的浓度为300 mm。
37.在一些实施方案中，所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:3至1:5。
38.在一些实施方案中，所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4.0、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9或1:5，或者上述任意数值之间的范围。
39.在一些实施方案中，所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:4。
40.在一些实施方案中，所述乙酸溶液为采用蒸馏水稀释商品化乙酸进一步调节ph获得。
41.在一些实施方案中，所述中和试剂为1 m的2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇缓冲液（即trizma中和缓冲液）。
42.在一些实施方案中，所述中和试剂的添加量占总体系体积的1/10至1/3。
43.在一些实施方案中，所述中和试剂的添加量占总体系体积的1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4或1/3，或者上述任意数值之间的范围。
44.在一些实施方案中，所述中和试剂的添加量占总体系体积的1/6。
45.在一些实施方案中，所述中和试剂为1 m且ph为9.5的trizma中和缓冲液。
46.在一些实施方案中，1m的trizma中和缓冲液为采用超纯水稀释商品化trizma base进一步调节ph获得。
47.在一些实施方案中，所述生物样品为血清。
48.在一些实施方案中，所述生物样品为人血清。
49.在一些实施方案中，检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体包括使用发光法细胞活力检测技术，以确定样品中的抗peg-rhgh中和抗体。
50.在一些实施方案中，检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体包括使用celltiter-glo试剂进行最终细胞活力检测以确定样品中的抗peg-rhgh中和抗体。
51.在一些实施方案中，所述发光法细胞活力检测使用商业化试剂盒进行，例如包含celltiter-glo试剂的商品化试剂盒，例如，promega的celltiter-glo
®
luminescent cell viability assay。
52.在一些实施方案中，所述发光法细胞活力检测包括：向样品中添加药物工作液，孵育2-2.5小时，收集、洗涤、计数细胞；将工作细胞与样品混合，孵育70-74小时；最后向样品中添加检测试剂工作液，使用酶标仪进行检测。
53.在一些实施方案中，所述药物工作液为rhgh工作液。
54.在一些实施方案中，所述工作细胞为baf3细胞。
55.在一些实施方案中，所述检测试剂工作液为celltiter-glo试剂。
56.第二方面，本技术提供了用于检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：乙酸；和用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂。
57.在一些实施方案中，所述用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂是celltiter-glo试剂。
58.其中所述乙酸能够将样品中的中和抗体与药物解离。
59.第三方面，本技术提供了乙酸在制备用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂盒中的用途。
60.其中所述乙酸能够将样品中的中和抗体与药物解离。
61.第四方面，本技术提供了加热处理和乙酸在用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的方法中的用途。
62.其中所述加热处理能够去除非特异性干扰。
63.其中所述乙酸能够将样品中的中和抗体与药物解离。
64.作为一个示例性实施方式，检测抗peg-rhgh中和抗体的方法包括以下步骤，1. 血清样品加热：将血清样品置于水浴锅中加热；优选地，所述水浴锅为56℃，30~35min；2. 血清样品预处理：采用乙酸进行预处理；优选地，所述乙酸为300 mm (ph 1.5)；3. 样品酸碱中和：向预处理的血清样品中加入trizma中和缓冲液，振荡混匀；优选地，所述trizma中和缓冲液为1 m (ph 9.5)；4. 将样品与药物工作液温育：向圆孔聚丙烯板中加入酸碱中和后的血清样品，加入药物工作液，振荡混匀后，于co2培养箱中孵育约2~2.5小时；5. 收集细胞：混匀细胞，将细胞离心；优选地，室温离心3分钟；6. 细胞洗涤：弃去上清液，加入基础培养基，重悬细胞并离心；优选地，室温离心3分钟；7. 细胞计数：观察细胞状态并计数，并加入一定量的基础培养基成为工作细胞；8. 加样：向96孔细胞培养板中加入工作细胞，并加入步骤4中温育后的样品，振荡混匀；9. 细胞培养：将96孔细胞培养板置于co2培养箱中孵育；优选地，孵育70-74小时；10. 显色：加入检测试剂工作液至细胞中，振荡混匀；室温下避光静置后检测；11. 检测：将96孔细胞培养板放入多功能酶标仪中进行检测；各多功能酶标仪设置参数参考分析规程；12. 数据储存、分析：储存原始数据；根据分析规程对原始数据进行分析。
65.一个示例性检测抗peg-rhgh中和抗体的步骤如下：1. 血清样品加热：将血清样品置于56℃水浴锅中加热30~35分钟；2. 血清样品预处理：采用300mm hac (ph 1.5) 按照体积比为1:4进行预处理；3. 预处理后血清样品酸碱中和：向100 μl/孔的预处理血清样品中加入20
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l/孔的trizma中和缓冲液（1 m ph 9.5），振荡混匀；4. 样品与药物工作液温育：参照板图，向圆孔聚丙烯板中加入70
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l/孔的酸碱中和后血清样品，然后加入70
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l/孔的药物工作液，振荡混匀后，于co2培养箱中孵育约2~2.5
小时；5. 收集细胞：用移液管吹打混匀细胞，将细胞转移至离心管中，室温离心3分钟；6. 细胞洗涤：弃去上清液，加入基础培养基，重悬细胞，室温离心3分钟；7. 细胞计数：观察细胞状态并计数，并加入一定量的基础培养基成为工作细胞；8. 加样：参照板图，往96孔细胞培养板中加入100
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l/孔的工作细胞，然后加入50
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l/孔的步骤4中温育后样品，振荡混匀；9. 细胞培养：将96孔细胞培养板置于co2培养箱中孵育70-74小时；10. 显色：加入60
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l/孔的检测试剂工作液至细胞中，振荡混匀；室温下避光静置约20分钟后检测；11. 检测：将以上96孔细胞培养板放入多功能酶标仪中进行检测；各多功能酶标仪设置参数参考分析规程；12. 数据储存、分析：储存原始数据，并打印；根据分析规程对原始数据进行分析并行储存并打印。
66.本技术建立了一种准确可靠、高灵敏的检测抗聚乙二醇重组人生长激素中和抗体的方法。该方法可以很好地解决内源性gh的干扰，从而准确获得中和抗体的数据。
67.本技术优势包括以下中的一种或多种：基于高表达ghr的细胞增殖终点法，方法稳定，能很好地模拟产生的中和抗体作用机制；采用高温加热结合酸解（例如，强酸酸解）方式，去除gh干扰的效率很高；加热处理能够去除非特异性干扰；乙酸能够将生物样品中的中和抗体与药物解离。
68.实施例将通过具体实例的方式更详细地描述本技术。提供以下实施例仅用于说明目的，且并不旨在以任何方式限制本技术。本领域技术人员将容易认识到各种非关键参数，这些参数可以被改变或修改以产生基本上相同的结果。
69.实施例1步骤：1. 血清样品加热：将血清样品置于56℃水浴锅中加热30~35 min；2. 血清样品预处理：采用300 mm hac (ph 1.5) 按照体积比为1:4进行预处理；3. 预处理后血清样品酸碱中和：向100 μl/孔的预处理血清样品中加入20
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l/孔的trizma中和缓冲液（1 m ph 9.5），振荡混匀；4. 样品与药物工作液温育：参照板图，向圆孔聚丙烯板中加入70
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l/孔的酸碱中和后血清样品，然后加入70
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l/孔的药物工作液，振荡混匀后，于co2培养箱中孵育约2~2.5小时；5. 收集细胞：用移液管吹打混匀细胞，将细胞转移至离心管中，室温离心3分钟；6. 细胞洗涤：弃去上清液，加入基础培养基，重悬细胞，室温离心3分钟；7. 细胞计数：观察细胞状态并计数，并加入一定量的基础培养基成为工作细胞；8. 加样：参照板图，往96孔细胞培养板中加入100
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l/孔的工作细胞，然后加入50
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l/孔的步骤4中温育后样品，振荡混匀；
9. 细胞培养：将96-孔细胞培养板置于co2培养箱中孵育70~74小时；10. 显色：加入60
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l/孔的检测试剂工作液至细胞中，振荡混匀；室温下避光静置约20分钟后检测；11. 检测：将以上96孔细胞培养板放入多功能酶标仪中进行检测；各多功能酶标仪设置参数参考分析规程；12. 数据储存、分析：储存原始数据，并打印；根据分析规程对原始数据进行分析并行储存并打印。
70.结果：如图1所示，经加热处理、使用乙酸处理后的灵敏度约为800 ng/ml。将经加热处理且使用乙酸处理与不经加热处理且不使用乙酸处理的血清结果进行比较，如图2所示，方法优化后（加热、乙酸处理）不同个体血清间抑制率差异变小，结果更为稳定。

技术特征：
1.检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的方法，所述方法包括：对所述液体生物样品进行加热处理；向加热处理后的液体生物样品中添加乙酸溶液；添加中和试剂；以及检测液体生物样品中的抗peg-rhgh中和抗体。2.如权利要求1所述的方法，其中所述加热处理为50至60℃水浴25至45分钟。3.如权利要求1所述的方法，其中所述加热处理为56℃水浴30至35分钟。4.如权利要求1所述的方法，其中所述乙酸溶液的ph为1.3-1.7。5.如权利要求4所述的方法，其中所述乙酸溶液的ph为1.5。6. 如权利要求1所述的方法，其中所述乙酸溶液的浓度为250-350 mm。7. 如权利要求6所述的方法，其中所述乙酸溶液的浓度为300 mm。8.如权利要求1所述的方法，其中所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:3至1:5。9.如权利要求8所述的方法，其中所述液体生物样品与乙酸溶液的体积比为1:4。10. 如权利要求1所述的方法，其中所述中和试剂为1 m的2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇缓冲液。11.如权利要求1所述的方法，其中所述液体生物样品为人血清。12.如权利要求1所述的方法，其中检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体包括使用发光法细胞活力检测技术，以确定液体生物样品中的抗peg-rhgh中和抗体。13. 用于检测液体生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：乙酸；和用于检测生物样品中抗peg-rhgh中和抗体的试剂。

技术总结
本申请提供了一种检测液体生物样品中抗PEG-rhGH中和抗体的方法，所述方法包括：对所述液体生物样品进行加热处理；向加热处理后的液体生物样品中添加乙酸溶液；添加中和试剂；以及检测液体生物样品中的抗PEG-rhGH中和抗体；所述加热处理不影响药物PEG-rhGH的活性，添加乙酸溶液不影响工作细胞的活性和反应性。添加乙酸溶液不影响工作细胞的活性和反应性。添加乙酸溶液不影响工作细胞的活性和反应性。


技术研发人员：邓承莲 谢新遥 杨金
受保护的技术使用者：军科正源（北京）药物研究有限责任公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/8/16