一种抗真菌微针贴片及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗真菌微针贴片及其制备方法和应用。


背景技术：

2.全球约有20-25％的人受到皮肤真菌感染的困扰，该疾病若不及时治疗可能会演变成侵袭性真菌感染进而威胁生命健康。目前治疗皮肤真菌感染大多使用含有抗真菌药物的洗剂、乳膏、凝胶等局部制剂，但此类局部制剂只对浅表的真菌皮肤感染较为有效，由于药物难以穿透角质层，局部制剂对于能通过表皮和真皮迁移到皮下组织的真菌所造成的深部感染效果较差。治疗深部真菌感染通常采用口服抗真菌药物的疗法，但这种全身给药的方法因缺少靶向性会对身体造成较大的毒副作用。因此，迫切需要开发有效、安全和易于使用的方法来对抗皮肤感染。
3.微针是一种由长度为100-1000μm的微型针阵列组成的贴片，其能穿透角质层进行给药，同时由于穿刺深度未达到真皮中的神经末梢，因此是一种无痛或者微痛的微创局部给药方式。多数微针由聚合物制成，用于包载和控释药物。目前已经有研究将微针用于检测和治疗各种疾病，包括皮肤癌、皮肤感染、糖尿病和眼疾等。
4.目前已有一些研究报导用于治疗皮肤真菌感染的微针，如使用壳聚糖-聚乙烯亚胺共聚物作为抗菌聚合物来制造的微针贴片，并包封两性霉素以治疗深层皮肤真菌感染。还有包载了伊曲康唑纳米晶的透明质酸微针贴片用来治疗皮肤白念珠菌感染。但近年来，临床发现的多重耐药真菌日益增多，仅靠抗生素类抗真菌药物难以将其杀灭。
5.光热治疗是指光热剂在光的激发下产生温度的升高，从而物理性地破坏真菌结构，起到杀菌作用。这种物理破坏机制不会让真菌产生耐药性。然而，单独使用光热杀菌通常需要高温和长时间，这不可避免地会对周围的正常细胞和组织造成损害。光动力治疗是通过光激活光敏剂以产生有细胞毒性的活性氧，使细胞成分(脂质、蛋白质和核酸)被氧化损伤，从而导致真菌失活的治疗方法。光动力治疗表现出广谱抗菌特性并可避免真菌产生耐药性。然而，游离光敏剂对皮肤的渗透效率低、水溶性差、不稳定等特点限制了光动力治疗的进一步临床应用。
6.因此，亟需在现有技术的基础上，提供新的技术方案，解决现有技术中存在的问题。


技术实现要素：

7.为解决现有技术的不足，本发明创新性地将抗真菌药物伊曲康唑和光热剂/光敏剂吲哚菁绿结合，装载在微针中，可进行无痛微创式局部给药，通过结合近红外光激发下释放的抗真菌药物的抗菌作用、光热作用和光动力学作用，实现对真菌的有效杀灭，且不会对正常组织造成不可逆转的损伤。
8.本发明的一个目的在于，提供一种抗真菌微针贴片，所述抗真菌微针贴片包括背
衬层和设置于所述背衬层表面的针头；
9.所述针头在所述背衬层表面构成n
×
n的阵列；
10.所述针头表面包括含有抗菌药的脂肪酸涂层；
11.所述针头内部包括光敏剂；
12.所述n选自整数。
13.进一步地，所述抗菌药为亲脂性三唑类抗真菌药。
14.进一步地，所述抗菌药为伊曲康唑。
15.进一步地，所述脂肪酸选自含有6-12个碳原子的饱和脂肪酸。
16.进一步地，所述脂肪酸优选为月桂酸。
17.进一步地，所述针头的材料为壳聚糖，所述背衬层的材料为透明质酸盐。
18.进一步地，所述光敏剂为吲哚菁绿。
19.伊曲康唑(itraconazole，itz，cas登记号：84625-61-6)是一种亲脂性三唑类抗真菌药，可用于广泛的真菌感染，其作用机制是高选择性地结合真菌细胞色素p450同工酶，抑制麦角甾醇合成，导致真菌细胞膜损伤，从而使真菌细胞死亡，而与哺乳动物p450系统结合较弱，使药物对人的毒性大大降低。临床伊曲康唑主要用于深部真菌所引起的系统感染，如着色芽生菌病、组织胞浆菌病、类球孢子菌病、孢子丝菌病、球孢子菌病、念珠菌病和曲菌病等。其结构式如下：
[0020][0021]
吲哚菁绿(indocyanine green，icg，cas登记号：3599-32-4)是目前在我国心血管系统疾病临床诊断中常用的一种造影剂，用于使脉络膜和视网膜血管成像。吲哚菁绿对808nm近红外激光有较强的吸收，吸收后的能量以三种方式消散，分别是产生荧光、产生热能和产生活性氧物质，其中产生的热能和活性氧物质可对细胞造成损伤，因此已有研究使用吲哚菁绿治疗肿瘤和细菌感染。其结构式如下：
[0022][0023]
壳聚糖(chitosan，cs，cas登记号：9012-76-4)是天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有生物降解性、生物相容性、抑菌、抗炎等多种生理功能，广泛应用于食品添加剂、美容保健、抗菌剂、医用纤维、医用敷料、药物缓释材料等众多领域。其结构式如下：
[0024][0025]
透明质酸钠(sodium hyaluronate，ha，cas登记号：9004-61-9)又名玻尿酸钠或者
玻璃酸钠，是一种人体内固有的生物大分子，是构成皮肤真皮层的物质，分子量在数十万至数百万之间。由于其具有良好的生物相容性、保湿性、润滑性和抗皱性等特点，已被广泛用于药物载体、护肤产品和医美产品。其结构式如下：
[0026][0027]
月桂酸(lauric acid，la，cas登记号：143-07-7)是一种含有12个碳原子的中链饱和脂肪酸，主要存在于椰子油和棕榈籽油中，其在食品添加剂、香料工业、制药工业和表面活性剂工业等方面有诸多应用。月桂酸是一种相变材料，相变温度为44.4℃，当温度高于44.4℃时月桂酸会由固相转变为液相。其结构式如下：
[0028][0029]
本发明的另一个目的在于，提供上述抗真菌微针贴片的制备方法，包括如下步骤：
[0030]
s1.将壳聚糖溶液加入模具中，离心后用碱溶液进行处理，干燥后，加入光敏剂溶液，离心、干燥后加入透明质酸盐溶液1，离心后加入透明质酸盐溶液2，然后离心、干燥定型得到中间产物；
[0031]
s2.将抗菌药的脂肪酸溶液加入空白模具中，离心后，得到含有抗菌药溶液的模具；
[0032]
s3.将所述中间产物置于所述含有抗菌药溶液的模具中，然后干燥，重复若干次，得到所述抗真菌微针贴片。
[0033]
进一步地，步骤s1中，所述壳聚糖溶液的浓度为3-5％；所述光敏剂溶液的浓度为0.01-0.2％。
[0034]
进一步地，步骤s1中，所述透明质酸盐溶液1的浓度为40-60％，所述透明质酸盐溶液2的浓度为10-30％。
[0035]
进一步地，步骤s2中，所述抗菌药的脂肪酸溶液中抗菌药的含量为10-20％。
[0036]
本发明的另一个目的在于，提供上述抗真菌微针贴片在抗真菌药物、医疗器械和消杀产品中的应用。
[0037]
本发明具有以下有益效果：
[0038]
本发明的抗真菌微针贴片将吲哚菁绿和伊曲康唑共同引入微针中，通过光热、光动和抗生素的协同作用达到显著的抗真菌效果提升，可减少伊曲康唑的用药量，降低真菌产生耐药性的风险。同时，本发明是一种可分离式微针，可将微针留存在皮肤内，患者无需一直贴敷微针贴片，有效减少不适感。此外，本发明采用相变材料月桂酸包载伊曲康唑还可实现光热按需释药，具有良好的应用前景。
附图说明
[0039]
图1示出了本发明实施例1制备的抗真菌微针贴片；
[0040]
其中，
[0041]
图1a为抗真菌微针贴片的制备方法示意图；
[0042]
图1b为抗真菌微针贴片的照片；
[0043]
图1c、d为抗真菌微针贴片的明场显微图像；
[0044]
图1e为用尼罗红作模式药物后的荧光显微图像；
[0045]
图1f为扫描电镜图像，左侧为未载药，右侧为载药；
[0046]
图1g为插入猪皮肤后的皮肤组织切片显微图像(比例尺：10μm)。
[0047]
图2示出了cs(icg)@la(itz)mns的近红外光响应行为；
[0048]
其中，
[0049]
图2a为含有不同icg量的cs(icg)@la(itz)mns在808nm激光(1w/cm2)照射下的升温曲线；
[0050]
图2b为cs(icg)@la(itz)mns在不同功率的808nm激光照射下的升温曲线；
[0051]
图2c为cs(icg)@la(itz)mns在3次808nm激光(1w/cm2)开/关循环下的升/降温曲线；
[0052]
图2d为cs(icg)@la针头在有/无(on/off)808nm激光照射下的释药曲线(n＝3)；
[0053]
图2e为活性氧探针dpbf溶液与不同样品在808nm(1w/cm2)激光照射后的dpbf余量(％)-时间曲线；
[0054]
图2f为活性氧探针sosg溶液与不同样品在808nm(1w/cm2)激光照射后的荧光图谱。
[0055]
图3示出了体外抗真菌作用测试结果；
[0056]
其中，
[0057]
图3a为白色念珠菌标准株(atcc 64548)经不同样品处理后的菌落计数图；
[0058]
图3b为白色念珠菌标准株(atcc 64548)经不同样品处理后的菌落在琼脂板上的生长照片；
[0059]
图3c为白色念珠菌标准株(atcc 64548)经不同样品处理后再经活/死染色后的共聚焦显微图像(比例尺：10μm)；
[0060]
图3d为重复使用同一个cs(icg)@la(itz)mns处理5批白色念珠菌标准株(atcc 64548)，每一批的菌落计数；
[0061]
图3e为白色念珠菌伊曲康唑耐药株(atcc 64550)经不同样品处理后的菌落计数；
[0062]
图3f为白色念珠菌伊曲康唑耐药株(atcc 64550)经不同样品处理后的菌落在琼脂板上的生长照片；
[0063]
图3g为着色芽生菌(cbs269.37，sums0310)经不同样品处理后的菌落计数；
[0064]
图3h为着色芽生菌(cbs269.37，sums0310)经不同样品处理后的菌落在琼脂板上的生长照片。
[0065]
图4示出了体外抗生物膜作用测试结果；
[0066]
其中，
[0067]
图4a为生物膜活/死(syto9/pi)染色后的3d图像；
[0068]
图4b为生物膜结晶紫染色后的照片；
[0069]
图4c为生物膜结晶紫染色后的吸光度(od
595
)。
[0070]
图5示出了抗菌机制研究结果；
[0071]
其中，
[0072]
图5a为加入/不加入维生素c(vc)这种过氧化物淬灭物时的抗菌实验菌落计数(n＝3)；
[0073]
图5b为白念珠菌atcc 64548与dcfh-da共孵育后的胞内过氧化物共聚焦明场/荧光场显微图像(比例尺：10μm)。
[0074]
图6示出了体内抗真菌作用研究结果；
[0075]
其中，
[0076]
图6a为体内感染及治疗流程示意图；
[0077]
图6b为体内热成像图；
[0078]
图6c为体内白念珠菌标准菌株atcc 64548经不同样品处理后的菌落计数；
[0079]
图6d为体内白念珠菌标准菌株atcc 64548经不同样品处理后在琼脂板上的生长照片。
具体实施方式
[0080]
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为国内外同一领域常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
[0081]
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。应当理解，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。
[0082]
本发明实施例中的伊曲康唑(itz)、壳聚糖(cs，脱乙酰度≥95％，粘度100-200 apm.s)和维生素c购自上海麦克林生化科技有限公司；
[0083]
吲哚菁绿(icg)和透明质酸钠(ha，10kda/150-250kda)购自上海源叶生物科技有限公司；
[0084]
甲醇和二氯甲烷购自广州化学试剂厂；
[0085]
沙氏肉汤培养基(sdb)购自北京索莱宝科技有限公司；
[0086]
1640培养基购自美国gibco公司；
[0087]
sosg购自大连美伦生物技术有限公司；
[0088]
live/baclighttm细菌生存力试剂盒购自美国invitrogen生命技术公司；
[0089]
dcfh-da购自mce(medchemexpress)公司。
[0090]
本发明测试例中的白色念珠菌标准株(atcc 64548)、白色念珠菌伊曲康唑耐药株(atcc 64550)、着色芽生菌标准株(cbs269.37，sums0310)均由中山大学孙逸仙纪念医学院
鲁莎教授惠赠。
[0091]
实施例1
[0092]
一种抗真菌微针贴片，包括背衬层和设置于所述背衬层表面的针头；
[0093]
所述针头在所述背衬层表面构成10
×
10的阵列；
[0094]
所述针头表面包括含有itz的la涂层；
[0095]
所述针头内部包括光敏剂icg；
[0096]
所述针头的材料为cs，所述背衬层的材料为ha。
[0097]
上述抗真菌微针贴片的制备方法，包括如下步骤：
[0098]
s1.将200μl 4％的cs溶液(1％冰醋酸配制)加入pdms微针模具中，使用吊篮式离心机离心30min(4500rpm，20℃)，离心完毕后除去多余的cs溶液，再次离心5min(4500rpm，20℃)；
[0099]
然后加入200μl 10％ naoh溶液，离心5min(4500rpm，20℃)，然后将模具放入10％naoh溶液中浸泡1h，取出后用纯水冲洗，放在37℃烘箱中干燥15min；
[0100]
然后加入200μl 1mg/ml的icg(甲醇溶液)，离心20min(4500rpm，20℃)，除去多余的icg(甲醇溶液)，37℃干燥5min；
[0101]
然后加入150μl 50％ ha溶液(10kda)，离心5min(3500rpm，20℃)，除去多余的50％ ha溶液(10kda)；最后加入250μl 20％ ha溶液(150kda)，离心30min(3500rpm，20℃)，放入37℃烘箱中干燥定型，由此制得中间产物，即cs(icg)mns；
[0102]
s2.配制含有15％ itz和10％ la(溶剂为70％甲醇和30％二氯甲烷)的itz溶液；将200μl所述itz溶液加入空白模具中，使用吊篮式离心机离心1min(3500rpm，20℃)，除去多余溶液，得到含有抗菌药溶液的模具；
[0103]
s3.将所述中间产物按压于所述含有抗菌药溶液的模具中，放入37℃烘箱中干燥，重复以上载药步骤两次，得到所述抗真菌微针贴片，即cs(icg)@la(itz)mns。
[0104]
图1示出了本发明实施例1制备的抗真菌微针贴片；
[0105]
其中，
[0106]
图1a为抗真菌微针贴片的制备方法示意图；
[0107]
图1b为抗真菌微针贴片的照片；
[0108]
图1c、d为抗真菌微针贴片的明场显微图像；
[0109]
图1e为用尼罗红作模式药物后的荧光显微图像；
[0110]
图1f为扫描电镜图像，左侧为未载药，右侧为载药；
[0111]
图1g为插入猪皮肤后的皮肤组织切片显微图像(比例尺：10μm)。
[0112]
根据图1可以得出，本发明制备的cs(icg)@la(itz)mns由一个10
×
10阵列组成，面积为13
×
13mm2(图1b)。体视显微图像显示针尖均匀，每根针均为具有尖顶的棱柱状，高度为约1200μm，基底边长为约350μm，针尖距为约1000μm，针具有明显的上下双层结构(图1c和图1d)。为表征针尖表面是否包载上了含有伊曲康唑的月桂酸涂层，采用尼罗红被用来作为模式药物，在体视显微镜的荧光场下，可以看出针尖表面显均匀的红色，说明尼罗红能均匀地涂布在针尖表面(图1e)。同时，扫描电镜图像显示未包载月桂酸涂层的针尖表面较为光滑，而包载了月桂酸涂层的针尖表面较为粗糙，这也可以说明针尖表面成功包载了月桂酸涂层(图1f)。
[0113]
微针的特点之一是能穿透角质层进行给药，为表征cs(icg)@la(itz)mns是否具有足够的机械强度插入皮肤，我们进行如下检测：取平整的猪皮肤，将其脂肪去除，切成厚薄均一的小块，把cs(icg)@la(itz)mns垂直用力按压在皮肤上8min，再贴敷20min后揭下背衬层。将含有针头的猪皮肤包埋在包埋剂(oct)中，-80℃冰冻，使用冰冻组织切片机将猪皮切成10μm的片。使用激光共聚焦显微镜对切片进行观察。
[0114]
可以看到微针插入处的皮肤上产生了撕裂状的凹陷，同时有针头留在凹陷处。这说明cs(icg)@la(itz)mns的机械强度足够刺穿皮肤，同时作为一个可分离微针也能在微针扎入皮肤后将针头留存在皮肤内(图1g)。
[0115]
测试例1
[0116]
测定cs(icg)@la(itz)mns的载药量
[0117]
测试方法：
[0118]
吲哚菁绿(icg)：首先绘制icg标准曲线：配制浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg/ml的icg(dmso)溶液，使用紫外分光光度仪测量其吸收峰，记录在794nm处的吸光度，绘制浓度-吸光度的标准曲线。在实施例1中，将多余的吲哚菁绿从模具中刮出后，溶于dmso中，使用紫外分光光度仪测量溶液在794nm处的吸光度，代入标准曲线计算出icg浓度，根据最初加入的icg总量减去剩余的icg量，最终计算出每片微针的icg载药量。
[0119]
伊曲康唑(itz)：首先绘制itz标准曲线：配制浓度为4.496、11.24、17.984、24.728、31.472、3.216μg/ml的itz(甲醇)溶液，使用紫外分光光度仪测量其吸收峰，记录在266nm处的吸光度，绘制浓度-吸光度的标准曲线。将cs(icg)@la(itz)mns泡入500μl的甲醇中，使用紫外分光光度仪测量溶液在266nm处的吸光度，代入标准曲线计算出itz浓度，最终计算出每片微针的itz载药量。
[0120]
测试结果如表1所示。
[0121]
表1.cs(icg)@la(itz)mns载药量
[0122][0123][0124]
通过紫外分光光度计的定量研究发现每片cs(icg)@la(itz)mns贴片载有吲哚菁绿(icg)96.38
±
19.65μg，伊曲康唑(itz)15.19
±
0.62μg。
[0125]
测试例2
[0126]
cs(icg)@la(itz)mns的近红外光响应行为
[0127]
测试方法：
[0128]
(1)cs(icg)@la(itz)mns的光热行为
[0129]
光热行为对icg的浓度依赖性：制备icg含量为0、25、50、100、200μg的cs(icg)@la(itz)mns，用808nm(1w/cm2)激光进行照射，使用热成像仪探测微针的温度，每5s记录一次温度，绘制升温曲线。
[0130]
光热行为对激光功率的依赖性：制备icg含量为100μg的cs(icg)@la(itz)mns数枚，用0、300、500、700、1000mw/cm2的808nm激光进行照射，使用热成像仪探测微针的温度，
每10s记录一次温度，绘制升温曲线。
[0131]
(2)cs(icg)@la(itz)mns的光热响应释药行为
[0132]
把微针贴片按压在稍微湿润的纸巾上2min，再贴敷5min后将背衬揭下，微针针头会留存在纸巾中，用小刮铲把针头刮出(后续实施例均用此方法将微针贴片上的针头取出)，置于96孔板中(一枚贴片上的针置于一个孔中)，每孔加入250μl 1640培养基。给予3个激光开/关循环，在第53、113、173分钟时给予808nm激光照射，每次照射7min，保持温度在50
±
2℃。对照组全程无激光照射。在第30、60、90、120、180分钟时从孔中取出200μl溶液于离心管中，再补加200μl 1640培养基于孔中。在离心管加入300μl二氯甲烷，充分摇晃后静置进行萃取，使用紫外分光光度计测二氯甲烷层在268nm的吸光度。将吸光度代入伊曲康唑标曲中计算出伊曲康唑的释放量。
[0133]
(3)cs(icg)mns的光动性能
[0134]
将含有200μg icg的cs(icg)mns的针头取出，置于96孔板中备用。
[0135]
dpbf测过氧化物：设四个实验组：
①
h2o+nir(近红外光)；
②
游离icg(总含量200μg)+nir；
③
cs(icg)mns不加nir；
④
cs(icg)mns+nir。每孔加入475μl纯水和25μl2mg/ml dpbf(dmso)溶液，
①②④
组用808nm(1w/cm2)激光照射30min，使用紫外分光光度仪每5min测一次溶液吸收峰，记录在420nm处的吸光度。
[0136]
sosg测过氧化物：设四个实验组：
①
h2o+nir；
②
游离icg(总含量200μg)+nir；
③
cs(icg)mns不加nir；
④
cs(icg)mns+nir。每组加入500μl纯水和1μl sosg(10μm)甲醇溶液，
①②④
组用808nm(1w/cm2)激光照射15min后，用荧光分光光度计记录各组溶液500-600nm的吸收峰(ex＝488nm)。
[0137]
图2示出了cs(icg)@la(itz)mns的近红外光响应行为；
[0138]
其中，
[0139]
图2a为含有不同icg量的cs(icg)@la(itz)mns在808nm激光(1w/cm2)照射下的升温曲线；
[0140]
图2b为cs(icg)@la(itz)mns在不同功率的808nm激光照射下的升温曲线；
[0141]
图2c为cs(icg)@la(itz)mns在3次808nm激光(1w/cm2)开/关循环下的升/降温曲线；
[0142]
图2d为cs(icg)@la针头在有/无(on/off)808nm激光照射下的释药曲线(n＝3)；
[0143]
图2e为活性氧探针dpbf溶液与不同样品在808nm(1w/cm2)激光照射后的dpbf余量(％)-时间曲线；
[0144]
图2f为活性氧探针sosg溶液与不同样品在808nm(1w/cm2)激光照射后的荧光图谱。
[0145]
根据图2可以得出：
[0146]
由于包载了近红外荧光染料吲哚菁绿，cs(icg)@la(itz)mns因此具有一定的近红外光响应性。在波长为808nm的激光照射下，cs(icg)@la(itz)mns能迅速升温，且升温行为具有icg浓度依赖性(图2a)以及激光功率依赖性(图2b)，说明cs(icg)@la(itz)mns具有良好的光热性能。对cs(icg)@la(itz)mns给予3次808nm激光(1w/cm2)开/关循环照射，得到3个相近的升/降温曲线，说明cs(icg)@la(itz)mns在3次重复的激光照射中具有相似的升温行为，具有良好的光热稳定性(图2c)。
[0147]
本发明中采用月桂酸包载伊曲康唑，月桂酸是一种相变材料，当温度高于44℃时，月桂酸就会由固相转变为液相，释放出其中的伊曲康唑，由此达到光热控释的作用。由释放曲线可看出，在一定时间段中激光照射组比无激光照射组的释放量更多，且在激光照射组中，有激光照射的阶段药物释放速率大于无激光照射阶段(图2d)。由此说明cs(icg)@la(itz)mns有一定的光热控释作用，可实现按需释药。
[0148]
为探究cs(icg)mns的光动力学作用，选用了dpbf和sosg两种活性氧检测探针。其中dpbf可识别多种活性氧，一旦与活性氧结合，就会被不可逆氧化，uv-vis(420nm)的吸收强度迅速降低。sosg高度选择性结合单线态氧，当存在单线态氧时，sosg会产生绿色荧光。将cs(icg)mns与dpbf共孵育后施加808nm激光(1w/cm2)照射，溶液在420nm处的紫外吸光度大幅下降，说明产生了过氧化物，而不施加激光照射则几乎没有过氧化物产生(图2e)。值得一提的是，游离icg在被施加激光照射后也没有过氧化物产生，这可能是因为高浓度的icg分子发生聚集淬灭，无法产生过氧化物，而壳聚糖针头的孔隙结构能够让icg较好地分散，限制其聚集淬灭从而更好地发挥光动作用。使用sosg作为探针时也得到相似的结果，即cs(icg)mns结合808nm激光照射能产生过氧化物，而cs(icg)mns不施加激光照射或游离icg施加激光照射则几乎不产生过氧化物(图2f)。总而言之，此微针可通过光动力学作用产生大量对真菌有害的活性氧，可用于实现微针的协同抗真菌作用。
[0149]
测试例3
[0150]
体外抗真菌作用
[0151]
测试方法：
[0152]
将cs@la(itz)mns(只含有伊曲康唑的微针)、cs(icg)mns(只含有吲哚菁绿的微针)、cs(icg)@la(itz)mns贴片的针头取出置于96孔板中(一枚贴片上的针置于一个孔中)。设4个实验组：
①
cs@la(itz)mns；
②
cs(icg)mns；
③
cs(icg)@la(itz)mns；
④
空白对照。所有孔中均加入100μl sdb和100μl菌悬液(白念珠菌标准株atcc 645481
×
108cfu/ml，白念珠菌伊曲康唑耐药株atcc 64550 1
×
108cfu/ml，着色芽生菌标准株cbs269.37 1
×
107cfu/ml)。每一组均设6个孔，其中有3个孔用808nm激光(1w/cm2)照射90s，3个孔不照射激光。照射完后在37℃培养箱中摇晃孵育1h。然后将菌液稀释适宜倍数后在sdb琼脂板上进行均匀涂布，37℃静置培养24h后对菌落进行计数。
[0153]
采用live/baclighttm细菌生存力试剂盒，检测atcc 64548、atcc 64550、着色芽生菌标准株三种真菌在经不同样品处理后的生存活力。采用与上述步骤中相同的方式处理真菌后，将同一组所有孔中的真菌集中在一个离心管中，离心(4500g，4℃，10min)，除去上清液后加入100μl的染料(1ml pbs+1.5μl pi+1.5μl syto9)，在金属浴中孵育15min(37℃，200rpm)。取10μl菌液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，倒置于激光共聚焦显微镜下，用63倍物镜观察。
[0154]
为探究cs(icg)@la(itz)mns在多次使用后的抗菌效果，取cs(icg)@la(itz)mns的针头置于96孔板中，加入200μl白念珠菌菌悬液(sdb，1
×
108cfu/ml)，808nm(1w/cm2)激光照射2min，照射完后将菌液吸出置于另一96孔板中，再次加入200μl白念珠菌(sdb，1
×
108cfu/ml)，808nm(1w/cm2)照射2min，以上步骤重复五次。待五次照射结束后将装有五次经过cs(icg)@la(itz)mns处理的菌液以及没有处理过的菌液的96孔板放在37℃培养箱中摇晃孵育1h。然后将菌液稀释适宜倍数后在sdb琼脂板上进行均匀涂布，37℃静置培养24h后
对菌落进行计数。
[0155]
图3示出了体外抗真菌作用测试结果；
[0156]
其中，
[0157]
图3a为白色念珠菌标准株(atcc 64548)经不同样品处理后的菌落计数图；
[0158]
图3b为白色念珠菌标准株(atcc 64548)经不同样品处理后的菌落在琼脂板上的生长照片；
[0159]
图3c为白色念珠菌标准株(atcc 64548)经不同样品处理后再经活/死染色后的共聚焦显微图像(比例尺：10μm)；
[0160]
图3d为重复使用同一个cs(icg)@la(itz)mns处理5批白色念珠菌标准株(atcc 64548)，每一批的菌落计数；
[0161]
图3e为白色念珠菌伊曲康唑耐药株(atcc 64550)经不同样品处理后的菌落计数；
[0162]
图3f为白色念珠菌伊曲康唑耐药株(atcc 64550)经不同样品处理后的菌落在琼脂板上的生长照片；
[0163]
图3g为着色芽生菌(cbs269.37，sums0310)经不同样品处理后的菌落计数；
[0164]
图3h为着色芽生菌(cbs269.37，sums0310)经不同样品处理后的菌落在琼脂板上的生长照片。
[0165]
根据图3可以得出，在不施加808nm激光照射时，所有的组对于白念珠菌标准菌株(atcc 64548)都无显著抗菌作用；施加808nm激光(1w/cm2)照射后，cs@la(itz)mns仍然无显著抗菌作用，cs(icg)mns有一定的抗菌作用，可抑制至少90％的菌落，cs(icg)@la(itz)mns表现出最好的抗菌效果，可抑制超过99.9％的菌落(图3a和图3b)。
[0166]
将atcc 64548使用不同样品进行处理后，用live/baclighttm试剂盒进行染色，通过适量比例的syto 9和pi的混合染色，具有完整膜结构的活性高的菌呈现绿色荧光，而具受损膜结构的活性低的菌呈现红色荧光，染色后使用激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示经过cs(icg)@la(itz)mns+nir处理的真菌红色荧光最强活性最差，cs(icg)mns+nir处理的真菌部分呈红色荧光，其余组的红色荧光则较弱(图3c)。该实验结果与菌落计数结果基本吻合，同时也说明cs(icg)@la(itz)mns+nir的抗菌机制与破坏真菌细胞膜有关。
[0167]
因本发明所设计的微针可将针头留存在皮肤内，因此期望可对其多次进行激光照射从而实现多次重复治疗。为探究其多次治疗的可行性，重复使用同一个cs(icg)@la(itz)mns辅以808nm激光分别处理5次真菌。由菌落计数结果可看出，cs(icg)@la(itz)mns即使在使用5次后抑菌率仍可高达99.9％(图3d)，说明其可多次发挥抗菌作用，实现多次治疗。
[0168]
对于白念珠菌的伊曲康唑耐药株(atcc 64550)和着色芽生菌标准株(fonsecaea monophora(cbs269.37，sums0310))这两类真菌的抗菌作用结果显示：微针对于耐药型白念珠菌的抗菌性能与标准白念珠菌的类似(图3e和3f)。对于着色芽生菌，在不施加808nm激光照射时，含有伊曲康唑的cs@la(itz)mns组和cs(icg)@la(itz)mns组均有一定的抑菌作用，可抑制约60％的菌落，这可能是因为着色芽生菌对伊曲康唑比白念珠菌更敏感，给予激光照射后，cs(icg)mns组和cs(icg)@la(itz)mns组也表现出抑菌作用，其中，cs(icg)@la(itz)mns组的抑菌效果最佳，能抑制超过95％的菌落(图3g和3h)。以上的抗菌实验结果表明，当cs(icg)@la(itz)mns结合808nm激光照射时可产生非常好的抗真菌效果，推测这是伊曲康唑，光热和过氧化物协同作用的效果。
[0169]
测试例4
[0170]
体外抗生物膜作用
[0171]
测试方法：
[0172]
活/死染色：将1ml的白念珠菌atcc 64548(sdb，1
×
105cfu/ml)加入共聚焦皿中，37℃静置培养48h。设4个实验组：
①
空白对照；
②
cs@la(itz)mns；
③
cs(icg)mns；
④
cs(icg)@la(itz)mns。生物膜养成后吸出培养基，将微针扎入生物膜中，加入100μlsdb，每组808nm(1w/cm2)激光照射2min，控制温度在50
±
2℃。将微针贴片揭去，加入1ml的染料(1ml pbs+1.5μl pi+1.5μl syto9)于37℃孵育20min，然后使用激光共聚焦显微镜扫描出生物膜的3d图像。
[0173]
生物量损失：将1ml的ca(sdb，1
×
105cfu/ml)加入12孔板中，37℃静置培养48h。设4个实验组：
①
空白对照；
②
cs@la(itz)mns；
③
cs(icg)mns；
④
cs(icg)@la(itz)mns。生物膜养成后吸出培养基，将微针扎入生物膜中，加入100μl sdb，每组808nm(1w/cm2)激光照射2min，控制温度在50
±
2℃。将微针贴片揭去，加入1ml sdb，放入振荡培养箱中1h(30℃，190rpm)。吸出sdb，将孔板开盖放入超净台中干燥10min，然后加入600μl1％结晶紫(pbs)溶液，室温静置孵育1h。然后吸去多余结晶紫，并加入无水乙醇，于30℃震荡30min后，吸出200μl乙醇于96孔板中，稀释10倍，用酶标仪测其在595nm处的吸光度。
[0174]
其中cs@la(itz)mns为只含有伊曲康唑的微针、cs(icg)mns为只含有吲哚菁绿的微针、cs(icg)@la(itz)mns为既含有伊曲康唑又含有吲哚菁绿的微针。
[0175]
图4示出了体外抗生物膜作用测试结果；
[0176]
其中，
[0177]
图4a为生物膜活/死(syto9/pi)染色后的3d图像；
[0178]
图4b为生物膜结晶紫染色后的照片；
[0179]
图4c为生物膜结晶紫染色后的吸光度(od
595
)。
[0180]
根据图4可以得出，空白对照组和cs@la(itz)mns组生物膜呈现出广泛的绿色荧光，说明死菌数量极少；cs(icg)mns+nir组出现部分红色荧光，说明生物膜中的菌部分死亡；cs(icg)@la(itz)mns+nir组呈现出广泛的红色荧光，说明生物膜中的菌已大幅死亡(图4a)。结晶紫可对生物膜的细胞外基质进行染色，研究结果显示用空白对照组和cs@la(itz)mns组处理的生物膜保持大部分活性且结构完整，相比之下，cs(icg)mns+nir和cs(icg)@la(itz)mns+nir组破坏了紧密的生物膜并导致了显著的生物量(biomass)损失(图4b、c)。以上实验均说明cs(icg)@la(itz)mns在近红外光辐照后相对于仅含有药物或者光敏剂的微针具有更强的抗真菌生物膜作用。
[0181]
测试例5
[0182]
抗菌机制研究
[0183]
为探究过氧化物对抗菌效果的影响，欲使用维生素c淬灭过氧化物。把针头取出置于96孔板中，设5个实验组：
①
空白对照组；
②
cs@la(itz)mns；
③
游离icg；
④
cs(icg)mns；
⑤
cs(icg)@la(itz)mns。每组又分为含维生素c组(淬灭过氧化物)和不含维生素c组，其中含维生素c组所用白念珠菌已用10mm维生素c共孵育24h。
①②④⑤
组均加入100μlsdb和100μl白念珠菌菌悬液(sdb，atcc 64548，1
×
108cfu/ml)，
③
组加入50μl icg(2mg/ml,dmso)，50μl sdb和100μl白念珠菌菌悬液(sdb，atcc 64548，1
×
108cfu/ml)。所有组均用808nm(1w/
cm2)激光照射2min。照射完后在37℃培养箱中摇晃孵育50min。然后将菌液稀释适宜倍数后在sdb琼脂板上进行均匀涂布，37℃静置培养24h后对菌落进行计数。
[0184]
为检测真菌的胞内过氧化物，将ca菌悬液(sdb，atcc 64548，108c fu/ml)与40μmol/ml dcfh-da在37℃中共孵育1h，将100μl此菌液加入含有以下样品的96孔板中：
①
空白培养基；
②
cs@la(itz)mns；
③
游离icg；
④
cs(icg)mns；
⑤
cs(icg)@la(itz)mns；
⑥
cs(icg)@la(itz)mns without nir。除
⑥
组外，
①‑⑤
组均用808nm激光(1w/cm2)照射2min，随后37℃摇晃孵育15min。取10μl菌液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，倒置于激光共聚焦显微镜下，用63倍物镜观察。
[0185]
图5示出了抗菌机制研究结果；
[0186]
其中，
[0187]
图5a为加入/不加入维生素c(vc)这种过氧化物淬灭物时的抗菌实验菌落计数(n＝3)；
[0188]
图5b为白念珠菌atcc 64548与dcfh-da共孵育后的胞内过氧化物共聚焦明场/荧光场显微图像(比例尺：10μm)。
[0189]
根据图5可以得出，从菌落计数结果可知，抗菌效果cs(icg)@la(itz)mns＞cs(icg)mns＞游离icg＞cs@la(itz)mns，游离icg因其光热作用，有微弱的抗菌作用，cs(icg)mns抗菌作用优于游离icg，根据之前的光动实验，推测是因为cs(icg)mns可产生过氧化物，而游离icg不能，再结合vc淬灭过氧化物的结果可看出，淬灭过氧化物会使cs(icg)mns的抗菌效果下降而对游离icg无影响，再次证明cs(icg)mns的杀菌效果是光热作用和光动力学作用产生的过氧化物的共同作用。cs(icg)@la(itz)mns的抗菌效果明显优于cs(icg)mns，说明因光热释放出的伊曲康唑发挥了作用，加入vc淬灭后，抗菌效果大幅下降，并且幅度大于cs(icg)mns，说明有过氧化物参与了抗菌作用，而且与光热作用以及伊曲康唑产生协同增效(图5a)。
[0190]
为进一步证明由icg光动力学作用产生的过氧化物，使用细胞内活性氧探针dcfh-da与atcc 64548共孵育，dcfh-da被过氧化物氧化后会变成荧光化合物dcf，使用共聚焦荧光显微镜观察后发现，cs(icg)mns+nir组部分菌产生了胞内过氧化物，cs(icg)@la(itz)mns+nir组几乎所有菌都产生了胞内过氧化物，而空白对照组、cs@la(itz)mns组、游离icg组和不施加808nm激光照射的cs(icg)@la(itz)mns组都几乎不产生胞内过氧化物(图5b)。
[0191]
综上所述，当给予808nm激光照射时，cs(icg)@la(itz)mns会产生热量和过氧化物，其中产生的热量可促进伊曲康唑的释放，最终抗真菌药物伊曲康唑、光热作用和光动力学作用协同增效，达到显著的抗真菌效果。
[0192]
测试例6
[0193]
体内抗真菌作用
[0194]
测试方法：
[0195]
取6-8周的balb-c雌性小鼠，随机分为4组(
①
不治疗组；
②
cs@la(itz)mns；
③
cs(icg)mns；
④
cs(icg)@la(itz)mns)，每组4只，脱光其背部毛发。脱毛24h后在小鼠背部皮内注射25μl 1
×
108cfu/ml的白念珠菌(atcc 64548)pbs混悬液。感染12h后在感染部位扎入微针贴片，并施加808nm激光照射30min进行治疗。使用热成像仪监测温度变化。治疗12h后，通过脊椎脱臼处死小鼠，取其感染部位组织，研磨匀浆后在sdb琼脂板上进行均匀涂布，37
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技术特征：
1.一种抗真菌微针贴片，其特征在于，所述抗真菌微针贴片包括背衬层和设置于所述背衬层表面的针头；所述针头在所述背衬层表面构成n
×
n的阵列；所述针头表面包括含有抗菌药的脂肪酸涂层；所述针头内部包括光敏剂；所述n选自整数。2.根据权利要求1所述抗真菌微针贴片，其特征在于，所述抗菌药为亲脂性三唑类抗真菌药。3.根据权利要求2所述抗真菌微针贴片，其特征在于，所述抗菌药为伊曲康唑。4.根据权利要求1所述抗真菌微针贴片，其特征在于，所述脂肪酸选自含有6-12个碳原子的饱和脂肪酸。5.根据权利要求1所述抗真菌微针贴片，其特征在于，所述针头的材料为壳聚糖，所述背衬层的材料为透明质酸盐。6.根据权利要求1所述抗真菌微针贴片，其特征在于，所述光敏剂为吲哚菁绿。7.权利要求1-6任一项所述抗真菌微针贴片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.将壳聚糖溶液加入模具中，离心后用碱溶液进行处理，干燥后，加入光敏剂溶液，离心、干燥后加入透明质酸盐溶液1，离心后加入透明质酸盐溶液2，然后离心、干燥定型得到中间产物；s2.将抗菌药的脂肪酸溶液加入空白模具中，离心后，得到含有抗菌药溶液的模具；s3.将所述中间产物置于所述含有抗菌药溶液的模具中，然后干燥，重复若干次，得到所述抗真菌微针贴片。8.根据权利要求7所述抗真菌微针贴片的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述壳聚糖溶液的浓度为3-5％；所述光敏剂溶液的浓度为0.01-0.2％；所述透明质酸盐溶液1的浓度为40-60％；所述透明质酸盐溶液2的浓度为10-30％。9.根据权利要求7所述抗真菌微针贴片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述抗菌药的脂肪酸溶液中抗菌药的含量为10-20％。10.权利要求1-6任一项所述抗真菌微针贴片在抗真菌药物、医疗器械和消杀产品中的应用。

技术总结
本发明涉及一种抗真菌微针贴片及其制备方法和应用，所述抗真菌微针贴片包括背衬层和设置于所述背衬层表面的针头；所述针头在所述背衬层表面构成n


技术研发人员：丁鑫 梁伊静 袁佩妍
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/23