一种暗发酵混合菌群以及其培养方法和应用与流程

1.本技术属于生物发酵技术领域，具体涉及一种暗发酵混合菌群以及其培养方法、在废弃油藏制氢中的应用。


背景技术：

2.现有的油井开采过程一般分为两个阶段，第一阶段中利用地层自身的压力就可以使得石油喷涌上来，而第二阶段一般采用注水法，一边注水一边补充地层的压力，从而可以借助于外力将石油举升上来，这之后由于将石油举升至底面的技术难度增加以及开采成本的提升，即便地层深处仍旧残留大量未开采的石油，也不得不放弃开采成为废弃油藏。目前，能够提高石油采收率的各种方式被提出来，例如聚合物驱油、化学驱油、热力采油和微生物驱油等等。
3.而利用微生物以原油为原料进行产氢则是目前备受关注的另一个利用废弃油藏的方式，废弃油藏经第二阶段的二次开采后，油井上层包括注入的水层以及水层下方丰富的油层，将这些微生物注入水层后，这些微生物就能够与油层接触并代谢烃类化合物从而产生氢气，而通过后续对油井混合气进行分离和提纯，就可以获得纯度较高的氢气。然而目前能够利用原油进行产氢的微生物的产氢效率比较低，而且对于利用原油产氢的微生物菌群的研究也比较少，因此亟需一种能够提高利用废弃油藏以原油为原料发酵而产氢的混合菌群。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，提供了一种暗发酵混合菌群以及其培养方法、在废弃油藏制氢中的应用，该暗发酵混合菌群不仅能够以原油为原料进行产氢，还能够提高油层的流动性，改善油层与水层的分界面，并且对原油中的重质组分进行裂解，从而可以充分利用油层进行发酵产氢，提高微生物利用废弃油藏产氢的效率。
5.根据本技术的一个方面，提供了一种废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，所述混合菌群包括：极端热袍菌(thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)、嗜热菌(thermus sp.)、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)。
6.可选的，所述混合菌群包括：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442、嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144。
7.可选的，所述混合菌群由单独培养至对数生长期的各菌种混合培养后得到。
8.可选的，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164的接种量为5～15％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为10～20％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌
(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为2～5％。
9.可选的，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164与埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量的比值为1:(2～3)。
10.可选的，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164与埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量的比值为1:3。
11.可选的，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164与所述铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量的比值为1：0.8。
12.根据本技术的另一个方面，提供了一种上述废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群的培养方法，先将各菌种单独暗培养至对数生长期，然后接种至混合培养基进行混合暗培养得到所述废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群。
13.可选的，单独暗培养中，极端热袍菌(thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)和嗜热菌(thermus sp.)的培养温度为70～75℃，其他菌种的培养温度为28～30℃，转速均为100～300rpm，培养时长2～4天；混合暗培养中，培养温度为28～30℃，转速为100～300rpm，培养时长2～4天。
14.可选的，所述单独暗培养中极端热袍菌(thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)和嗜热菌(thermus sp.)的培养基为tgy(tryptone glucose yeast)培养基；单独暗培养中其他菌种以及混合暗培养中的培养基为tsb(tryptic soy broth)培养基。
15.根据本技术的又一个方面，提供了一种混合菌群在废弃油藏制氢中的应用，所述混合菌群为上述的废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群。
16.本技术的有益效果包括但不限于：
17.1.根据本技术的暗发酵混合菌群，极端热袍菌和埃氏栖热袍菌能够利用原油进行发酵产生氢气，而进一步通过与嗜热菌、费氏丙酸杆菌、丁酸弧菌和铜绿假单胞杆菌共同培养形成的混合菌群，相较于普通单一菌种或其他混合菌群，能够大大提高利用原油产生氢气的效率，并且培养和制备工序简单快捷，非常适合用于工业生产。
18.2.根据本技术的暗发酵混合菌群，其中添加有嗜热菌和铜绿假单胞杆菌，其中铜绿假单胞杆菌能够将原油中的重质成分进行裂解形成轻质组分，形成的轻质组分在实验环境中能够更加容易被产氢菌接触到，而在实际生产环境中，密度较大的原油层在下层而包含菌群的水层在上侧，经裂解产生的轻质组分的密度低，可与嗜热菌产生的烷基硫酸盐表面活性剂进行作用，通过对原油层进行分散和乳化可以优化原油层与水层的交界面，使裂解的轻质组分更容易乳化进入水层，从而通过缩短产氢菌与原油层的接触路径，促进产氢菌与原油层的接触效果，使该混合菌群的产氢效率大大提高。
19.3.根据本技术的暗发酵混合菌群，还添加有费氏丙酸杆菌和丁酸弧菌，上述两种菌能够充分利用水层中的有机酸性代谢物质进行发酵，并产生氢气，从而使得该混合菌群不仅能够利用原油进行产氢，也能够充分利用水层中的营养物质进行产氢，提高产氢效率，其中的费氏丙酸杆菌能够利用水层中酸性代谢物产生氢气和二氧化碳，从而可以改善水层的酸性环境，能为其他菌提供更适宜的生长条件，通过提高混合菌种中各菌种的活力，从而促进该混合菌群的产氢效率。
20.4.根据本技术的暗发酵混合菌群，其中费氏丙酸杆菌能够分泌多种营养物质，有利于混合菌群中其他菌的生长，其还会分泌多种酶到环境中，可以提高菌群中其他菌的代谢水平和生长速度，尤其是对极端热袍菌和埃氏栖热袍菌的促进作用更强，从而使得混合菌群中主要负责利用原油进行产氢的两种菌可以较高活力进行工作，通过混合菌群中各菌的协同配合，能够明显提高混合菌群整体的产氢能力。
21.5.根据本技术的暗发酵混合菌群，极端热袍菌和埃氏栖热袍菌作为能够利用原油进行产氢的菌，其中极端热袍菌的专一性比较强，利用轻质组分烷烃产氢的效率更高，而埃氏栖热袍菌能够利用原油中的多种烃类组分进行发酵产氢，但是产氢效率相对较低，由于原油层与水层的接触效果本就不佳，因此单独使用两种菌或两种菌的比例过低或过高，都会降低产氢效率。当极端热袍菌接种量过多时由于原油中轻质组分有限且石油层、水层接触效果差，使得混合菌群的前期产氢速率高，但是后期却无法充分利用原油底物，而当埃氏栖热袍菌接种量过多时，虽然能够充分利用原油底物产氢，但是产氢效率却比较低，而当上述两种菌以特定比例进行配合使用时，能够充分发挥两种菌的优势，既能充分利用原油底物，又能使得产氢效率最大化。
22.6.根据本技术的暗发酵混合菌群，铜绿假单胞杆菌能够裂解原油中的重质组分为轻质组分，而其中的极端热袍菌又能够利用轻质组分作为底物进行产氢发酵，因此当混合菌群中存在足量的铜绿假单胞杆菌时，是能够促进混合菌群的产氢能力的，然而如果极端热袍菌与所述铜绿假单胞杆菌的接种量之比过低，即铜绿假单胞杆菌在混合菌群中含量过多时，却会影响极端热袍菌和埃氏栖热袍菌的数量和活性，而当铜绿假单胞杆菌与极端热袍菌以合适的接种量比例进行接种时，铜绿假单胞杆菌不会因过多而影响极端热袍菌和埃氏栖热袍菌生长和发挥产氢作用，还能裂解产生出能够满足极端热袍菌所需的轻质组分，从而提高混合菌群整体的产氢效率。
具体实施方式
23.下面结合实施例详述本技术，但本技术并不局限于这些实施例。
24.如无特别说明，本技术的实施例中的原料和试剂均通过商业途径购买。
25.实施例1
26.(1)单独暗培养
27.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442和嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737活化种子液分别接种于三组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度73℃，转速100～300rpm，培养时长3天；将费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144活化种子液分别接种于三组不同tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天。
28.(2)混合暗培养
29.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌
(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为15％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％。
30.实施例2
31.(1)单独暗培养
32.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442和嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737活化种子液分别接种于三组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度70℃，转速100～300rpm，培养时长4天；将费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144活化种子液分别接种于三组不同tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度28℃，转速100～300rpm，培养时长4天。
33.(2)混合暗培养
34.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度28℃，转速100～300rpm，培养时长4天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为10％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为10％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为5％。
35.实施例3
36.(1)单独暗培养
37.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442和嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737活化种子液分别接种于三组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度75℃，转速100～300rpm，培养时长2天；将费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144活化种子液分别接种于三组不同tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度30℃，转速100～300rpm，培养时长2天。
38.(2)混合暗培养
39.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度30℃，转速100～300rpm，培养时长2天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为15％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为20％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为2％。
40.实施例4
41.(1)单独暗培养
42.同实施例1。
43.(2)混合暗培养
44.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为4％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为16％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％。
45.实施例5
46.(1)单独暗培养
47.同实施例1。
48.(2)混合暗培养
49.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为7％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为13％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％。
50.实施例6
51.(1)单独暗培养
52.同实施例1。
53.(2)混合暗培养
54.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为10％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为10％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％。
55.实施例7
56.(1)单独暗培养
57.同实施例1。
58.(2)混合暗培养
59.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌
fibrisolvens)dsm-3071的接种量均为4％。
75.对比例3
76.(1)单独暗培养
77.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164和埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442活化种子液分别接种于两组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度73℃，转速100～300rpm，培养时长3天；将费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144活化种子液分别接种于三组不同tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天。
78.(2)混合暗培养
79.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为15％，费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％。
80.对比例4
81.(1)单独暗培养
82.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164和埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442活化种子液分别接种于两组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度73℃，转速100～300rpm，培养时长3天；将费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019和丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071活化种子液分别接种于两组不同tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天。
83.(2)混合暗培养
84.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为15％，费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019和丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071的接种量均为4％。
85.对比例5
86.(1)单独暗培养
87.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442和嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737活化种子液分别接种于三组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度73℃，转速100～300rpm，培养时长3天；将铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144活化种子液接种于tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天。
88.(2)混合暗培养
89.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为15％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％。
90.对比例6
91.(1)单独暗培养
92.同实施例1。
93.(2)混合暗培养
94.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为15％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为4％,、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019和丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071的接种量均为8％。
95.对比例7
96.(1)单独暗培养
97.将极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442和嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737活化种子液分别接种于三组不同tgy培养基进行单独暗培养，培养条件：温度73℃，转速100～300rpm，培养时长3天；将费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和黏质沙雷菌(serratia marcescens)atcc-13880活化种子液分别接种于三组不同tsb培养基进行单独暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天。
98.(2)混合暗培养
99.将步骤(1)中各个单独暗培养的菌种分别接种于tsb培养基进行混合暗培养，培养条件为：温度29℃，转速100～300rpm，培养时长3天，获得所述暗发酵混合菌群。其中各个菌种的接种量为：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164为5％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为15％，嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、脱硫肠状菌(desulfotomaculum nigrificans)dsm-122、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和黏质沙雷菌(serratia marcescens)atcc-13880的接种量均为4％。
100.实验例1
101.分别将上述实施例1～8和对比例1～7获得的暗发酵混合菌群分别接种于包括有原油的测试培养基中，进行产氢量的测试，每组测试中并加入tween80作为表面活性剂以提高培养基中混合菌群与原油的接触效果，测试发酵气体中氢气和二氧化碳的含量，并计算平均产氢速率，结果如下表1所示。
102.测试培养基包括：nh4cl 1.0g/l、k2hpo
4 0.3g/l、kh2po
4 0.3g/l、mgcl2·
6h2o 0.2g/l、cacl2·
2h2o 0.1g/l、kcl 0.1g/l、乙酸钠0.5g/l、酵母提取物2.0g/l、蛋白胨2.0g/
l、刃天青0.0002g/l、l-盐酸半胱氨酸0.5g/l、葡萄糖3.0g/l、na2s 0.5g/l、nahco
3 2.0g/l、微量元素溶液10ml和20ml/l原油，其中微量元素溶液包括：mncl2·
4h2o 6.4g/l、cocl2·
6h2o 0.387g/l、cucl 2h2o 0.035g/l、na2moo4·
2h2o 0.033g/l、zncl
2 0.027g/l、fecl
2 1.062g/l。
103.表1
[0104][0105]
分析表1结果，由实施例1、4、5、6的结果可知，作为主要产氢的极端热袍菌和埃氏栖热袍菌的接种量之比是影响混合菌群中两种菌数量的主要因素，当极端热袍菌和埃氏栖热袍菌接种量之比为1：3时，混合菌群的产氢效率最高，这是因为上述两种菌的特性有所不同，极端热袍菌仅能利用原油中的较轻质成分但是产氢效率高，而埃氏栖热袍菌能够适用性比较广，但是相应地产氢效率比较低，两种菌以上述1：3的比例进行搭配使用时，能够获得最高的产氢效率。由实施例1、7、8的结果相比较可知，铜绿假单胞杆菌与极端热袍菌的接种量关系会对混合菌群的产氢量产生影响，若极端热袍菌与铜绿假单胞杆菌接种量之比过
小，导致混合菌群中的铜绿假单胞杆菌数量过多，因竞争作用导致极端热袍菌和埃氏栖热袍菌的活性降低，而当铜绿假单胞杆菌接种量过少时，铜绿假单胞杆菌裂解产生的原油轻质组分不足以供应极端热袍菌进行产氢发酵，也会导致混合菌群的产氢速率降低，而当极端热袍菌与铜绿假单胞杆菌的接种量的比值为1：0.8时，此时混合菌群中的铜绿假单胞杆菌数量合适，既不会影响极端热袍菌和埃氏栖热袍菌生长和活性，还能裂解产生出能够满足极端热袍菌所需的轻质组分，使得产氢效率效率最高。
[0106]
由实施例1和对比例1、2、3、4、5的结果相比较可知，仅使用极端热袍菌和埃氏栖热袍菌作为混合菌群的方案，产氢效率非常低，这是因为实施例1中的混合菌群，各菌种在搭配混合后，可以取得更好的效果，嗜热菌和铜绿假单胞杆菌组合能够有效改善油层与水层的界面，从而大大提高利用原油产氢的效率，而费氏丙酸杆菌和丁酸弧菌不仅能够充分利用水层中的碳水化合物进行产氢，同时降低水层中的酸性物质而产生二氧化碳排出，并会分泌酶和生长因子促进其他菌的生长和繁殖，使得上述混合菌群的配合后可以明显提高产氢的效率。其中实施例1和对比例5的结果相比较可知，虽然对比例5中由于二氧化碳含量小，因此相对氢气的含量非常高，但是由于混合菌群中发酵环境的酸性条件使得混合菌群发酵产氢效率非常低，而且不能充分利用水层中有机物进行辅助产氢，使得总体产氢速率非常低。由实施例1和对比例7的结果相比较可知，对比例7中使用了在石油开采中两种常用的其他工业菌进行替换，尤其是其中的黏质沙雷菌虽然也能改善油层的流动性，但是该混合菌群的制氢效率相较于实施例1相差较大。
[0107]
由实施例1与对比例2、3、4的结果相比较可知，对比例2、3和4中由于极端热袍菌和埃氏栖热袍菌与原油的接触能力下降，产氢量降低，而对费氏丙酸杆菌和丁酸弧菌利用水层中的有机物产氢和二氧化碳的过程影响小，不仅使得产氢速率明显很低，还使得产生的气体中二氧化碳占比过大，增加了后期氢气分离提纯的难度。由实施例1和对比例6的结果相比较可知，实施例中增加了费氏丙酸杆菌和丁酸弧菌的接种量，导致发酵过程中二氧化碳的产生量增加，使得混合气体中氢气含量比较低，并且由于费氏丙酸杆菌和丁酸弧菌接种量的增加，也会影响极端热袍菌和埃氏栖热袍菌的产氢效果，使得混合菌群整体的产氢效率降低。
[0108]
以上所述，仅为本技术的实施例而已，本技术的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本技术的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，其特征在于，所述混合菌群包括：极端热袍菌(thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)、嗜热菌(thermus sp.)、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)。2.根据权利要求1所述的废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，其特征在于，所述混合菌群包括：极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442、嗜热菌(thermus sp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144。3.根据权利要求2所述的废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，其特征在于，所述混合菌群由单独培养至对数生长期的各菌种混合培养后得到。4.根据权利要求3所述的废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，其特征在于，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164的接种量为5～15％，埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量为10～20％，嗜热菌(thermussp.)atcc-27737、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)cicc-10019、丁酸弧菌(butyrivibrio fibrisolvens)dsm-3071和铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa)cicc-56144的接种量均为2～5％。5.根据权利要求4所述的废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，其特征在于，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164与埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量的比值为1:(2～3)。6.根据权利要求5所述的废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群，其特征在于，所述极端热袍菌(thermotoga hypogea)dsm-11164与埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)dsm-9442的接种量的比值为1:3。7.根据权利要求1～6所述废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群的培养方法，其特征在于，先将各菌种单独暗培养至对数生长期，然后接种至混合培养基进行混合暗培养得到所述废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群。8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，单独暗培养中，极端热袍菌(thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)和嗜热菌(thermus sp.)的培养温度为70～75℃，其他菌种的培养温度为28～30℃，转速均为100～300rpm，培养时长2～4天；混合暗培养中，培养温度为28～30℃，转速为100～300rpm，培养时长2～4天。9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述单独暗培养中极端热袍菌(thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(thermotoga elfii)和嗜热菌(thermus sp.)的培养基为tgy(tryptone glucose yeast)培养基；单独暗培养中其他菌种以及混合暗培养中的培养基为tsb(tryptic soy broth)培养基。10.一种混合菌群在废弃油藏制氢中的应用，其特征在于，所述混合菌群为权利要求1～6所述废弃油藏制氢的暗发酵混合菌群。

技术总结
本申请属于生物发酵技术领域，具体涉及一种暗发酵混合菌群以及其培养方法、在废弃油藏制氢中的应用。在本申请中，公开了一种能够用于利用废弃油藏进行产氢的混合菌群，该混合菌群中包括了极端热袍菌(Thermotoga hypogea)、埃氏栖热袍菌(Thermotoga elfii)、嗜热菌(Thermus sp.)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)和铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，该混合菌群不仅能够以原油为原料进行产氢，还能够提高油层的流动性，改善油层与水层的分界面，并且对原油中的重质组分进行裂解，从而可以充分利用油层进行发酵产氢，提高微生物利用废弃油藏产氢的效率。的效率。


技术研发人员：崔仕章 宋新旺 王黎明 刘骁 牟国毅 侯青怡 徐佳慧 黄琦活 吴丽丽 席伟 公斌 高琪琪
受保护的技术使用者：德仕能源科技集团股份有限公司 德仕能源科技集团股份有限公司青岛分公司
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/23