多层膜陷阱式SERS生物传感器及其制备方法和应用

多层膜陷阱式sers生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种多层膜陷阱式sers生物传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002][0003]
在复杂条件下实现简单、低成本、高灵敏度和耗时的sars-cov-2病毒检测仍然是一项重大的技术挑战。针对这些情况，病毒的鉴定和筛选在减少疾病传播方面发挥着关键作用。常见的核酸检测和试剂盒抗原检测由于准确度高，仍然是目前使用的主要检测方法。但这些技术容易受到外界温度的影响，往往需要几个小时甚至几天才能产生准确的结果，上述限制所造成的巨大工作量迫切需要发展能够实现现场病毒探测和识别的快速方法。
[0004]
目前，基于光谱的诊断技术已被应用于各种应用，并已成功证明可以检测广泛的低浓度分析物，包括病毒。表面增强拉曼散射(surface enhanced raman scattering,sers)是由于金属纳米结构局域表面等离子激发所产生的拉曼光谱增强现象，是一种指纹光谱并可以将分子的拉曼散射信号强度增强106倍以上。sers因其超灵敏、快速、简单的检测能力在生化分子检测、化学、医疗、环境检测、安全检测等领域具有十分广泛的应用前景，sers技术可以实现对生物分子的直接检测，无需样品前处理且具有信号稳定性高、均匀性和可重复性强的优势，可以较好的应用于定量分析。
[0005]
传统表面增强拉曼光谱技术大多依靠化学合成的贵金属纳米颗粒与分析物相结合进行检测。然而，金属纳米颗粒性质不稳定，容易发生团聚。同时，拉曼探针基底不均匀，重复性较差，容易造成实验结果假阳性。另外，这种金属纳米颗粒的共振波长较为单一，通常只能适用于一种激发光。采用纳米加工技术制备的sers基底能够提供均匀、稳定且可调的周期结构，但是通常增强倍数较低。
[0006]
因此，有必要提供一种能够实现病毒快速识别检测且具有高稳定性、高重复性、高灵敏度的sers生物传感器。


技术实现要素：

[0007]
本发明针对上述问题，提出了一种在无需前处理的条件下能够对病毒实现快速、高稳定性和高重复性直接检测的多层膜陷阱式sers生物传感器及其制备方法和应用。
[0008]
为此，本发明的一方面提供了一种多层膜陷阱式sers生物传感器，包括：基底；多个陷阱结构，形成在所述基底表面，具有中心柱和位于中心柱外围的环形陷阱；多层膜，包括第一金属层、介质层和第二金属层，形成在所述基底表面并至少覆盖所述陷阱结构的中心柱表面和环形陷阱表面；其中，所述多层膜陷阱式sers生物传感器被配置为能够在拉曼光谱仪的入射光激发下产生对应于待测病毒的拉曼光谱。
[0009]
根据本发明多层膜陷阱式sers生物传感器的一个实施例，所述基底的材料为硅、石英、玻璃和蓝宝石中的一种；所述第一金属层和第二金属层的材料为ag或au，所述介质层
的材料为氧化铝、二氧化硅和二氧化钛中的至少一种。
[0010]
根据本发明多层膜陷阱式sers生物传感器的一个实施例，所述第一金属层的厚度d1为15～35nm，所述介质层的厚度s为5～15nm，所述第二金属层的厚度d2为15～35nm。例如，所述第一金属层的厚度d1为15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm或35nm。例如，所述介质层的厚度s为5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm或15nm。例如，所述第二金属层的厚度d2为15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm或35nm。
[0011]
根据本发明多层膜陷阱式sers生物传感器的一个实施例，所述多层膜还包括分别形成在所述第一金属层和第二金属层之前的粘附增强层，所述粘附增强层的材料为cr、ge或ti且厚度为0.5～1nm。例如，所述粘附增强层的厚度为0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm或1nm。
[0012]
根据本发明多层膜陷阱式sers生物传感器的一个实施例，所述多个陷阱结构周期性地排列在基底上，横向周期p为300～500nm；所述中心柱的高度h为80～150nm，所述环形陷阱的内径r1为30～100nm、外径r2为125～175nm。例如，所述多个陷阱结构周期性地排列在基底上，横向周期p为300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、480nm或500nm。例如，所述中心柱的高度h为80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。例如，所述环形陷阱的内径r1为30nm、10nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm，外径r2为125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm或175nm。
[0013]
本发明的另一方面提供了上述多层膜陷阱式sers生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
s1，提供基底，在所述基底上形成多个陷阱结构；
[0015]
s2，在具有多个陷阱结构的基底表面形成包括第一金属层、介质层和第二金属层的多层膜，并使所述多层膜至少覆盖所述陷阱结构的中心柱表面和环形陷阱表面。
[0016]
根据本发明多层膜陷阱式sers生物传感器的制备方法的一个实施例，在步骤s1中，利用电子束光刻结合等离子刻蚀的方法形成所述多个陷阱结构；在步骤s2中，利用电子束蒸镀或磁控溅射的方法形成所述多层膜，其中，在所述第一金属层和第二金属层之前分别形成粘附增强层。
[0017]
本发明的再一方面提供了上述多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用。
[0018]
根据本发明多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用的一个实施例，包括：
[0019]
s1，提供所述多层膜陷阱式sers生物传感器；
[0020]
s2，将病毒样本采集液滴入所述多层膜陷阱式sers生物传感器中，进行拉曼检测后得到待测病毒的拉曼光谱结果。
[0021]
根据如上所述多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用的一个实施例，所述待测病毒为sars-cov-2病毒或其变异病毒。
[0022]
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0023]
(1)本发明所采用的多层膜陷阱式sers生物传感器，可以较好地捕获病毒分子，尤
其能够对sars-cov-2 n蛋白进行快速、高重复性和高增强检测，可在1分钟内实现对sars-cov-2 n蛋白的快速检测并实现超低浓度范围0.35～3.5copies/ml的拉曼光谱特征识别，其检测限lod低至0.03copies/ml；
[0024]
(2)本发明通过利用金属-介质-金属结构之间电磁波的相互耦合作用来进一步提高sers增强效果，对r6g分子的增强因子高达3.29
×
108，比传统的周期sers基底的增强因子提高了2～3个数量级；
[0025]
(3)本发明的生物传感器信号具有较高的重复性，在传感面的信号偏差rsd为9.78％，为新冠病毒等病毒的早期快速识别提供了简便方法。
附图说明
[0026]
为了更清楚地理解本发明的结构和实施例，下面将对所需要的附图进行说明，以下附图仅代表本发明的某些实施例。
[0027]
图1示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器的原理示意图。
[0028]
图2示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器中陷阱结构的结构示意图。
[0029]
图3示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器的制备过程示意图。
[0030]
图4示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器的sem俯视图a和截面图b。
[0031]
图5示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在532nm激发波长下利用时域有限差分法计算得到的电场图。
[0032]
图6示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在不同环形陷阱内径r1下检测的sars-cov-2 n蛋白表面增强拉曼光谱图。
[0033]
图7示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在周期为400nm的环形陷阱内径r1为30nm下检测的浓度范围0.35～3.5copies/ml sars-cov-2 n蛋白的表面增强拉曼光谱图a和浓度0.35copies/ml下的重复性测试结果b。
[0034]
图8示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在不同环形陷阱内径r1下检测的r6g表面增强拉曼光谱a和拉曼mapping图b。
具体实施方式
[0035]
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0036]
本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0037]
为了使本发明的内容易于理解，下面将结合附图和具体实施例进行详细的说明，所列举的实施例仅为本发明的部分实施例，在不背离本发明的情况下还可以有其他组合方式。
[0038]
本发明旨在提供一种多层膜陷阱式sers生物传感器，通过在该生物传感器上所形成的等离子体活性纳米图案记录病毒的sers特征来识别是否存在病毒感染，从而更为快速、有效地识别病毒。
[0039]
以下将结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0040]
图1示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器的原理示意图。
[0041]
如图1所示，根据本发明的示例性实施例，所述多层膜陷阱式sers生物传感器包括基底1、多个陷阱结构2和多层膜3。多个陷阱结构2形成在基底1表面，具有中心柱21和位于中心柱21外围的环形陷阱22。多层膜3包括第一金属层31、介质层32和第二金属层33，形成在基底1表面并至少覆盖陷阱结构2的中心柱21表面和环形陷阱22表面。其中，上述多层膜陷阱式sers生物传感器被配置为能够在拉曼光谱仪的入射光激发下产生对应于待测病毒的拉曼光谱。
[0042]
其中，本发明中基底1的材料可以为硅、石英、玻璃和蓝宝石中的一种。多层膜3中第一金属层31和第二金属层33的材料可以为ag或au，介质层32的材料为氧化铝、二氧化硅和二氧化钛中的至少一种，通过该多层膜中金属-介质-金属结构之间电磁波的相互耦合作用来进一步提高该生物传感器的sers增强效果。
[0043]
优选地，第一金属层31的厚度d1为15～35nm，介质层32的厚度s为5～15nm，第二金属层33的厚度d2为15～35nm。并且，在形成多层膜3后，上述陷阱结构3的中心柱31表面会形成蘑菇状或伞状结构，使得热点更好的聚集在陷阱内。上述厚度的设置有利于调整共振波长，使之与激发波长匹配，形成局域表面等离子体效应，从而增强拉曼散射光。
[0044]
为了提高金属层的粘附性，本发明的多层膜3还包括分别形成在第一金属层31和第二金属层33之前的粘附增强层，该粘附增强层的材料可以为cr、ge或ti且厚度优选为0.5～1nm，此厚度的设置防止粘附增强层对光产生阻尼效应。
[0045]
图2示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器中陷阱结构的结构示意图。
[0046]
如图2所示，本发明的多层膜陷阱式sers生物传感器中多个陷阱结构2周期性地排列在基底1上，横向周期p为300～500nm；中心柱21的高度h为80～150nm，环形陷阱22的内径r1为30～100nm、外径r2为125～175nm。上述尺寸的设置同样为了便于调整共振波长，使之与激发波长匹配，形成局域表面等离子体效应，从而增强拉曼散射光。
[0047]
通过设置上述结构的陷阱结构2，能够较好地捕获病毒分子，当病毒落入本发明的多层膜陷阱式生物传感器时，能够大大增强病毒的拉曼信号，从而有效识别病毒的存在。具体地，该生物传感器在光照下能够激发陷阱结构内的局域表面等离子体共振，产生增强的表面电磁场；同时，由于环形陷阱底部和边缘以及中心柱表面都存在金属结构，相邻金属结构的局域表面电磁场产生耦合作用，能够进一步增强表面电磁场；相邻的金属层之间也会产生强烈的等离子波，进一步传导至陷阱结构边缘促进电场的增强，上述共同作用使得落入陷阱内的病毒的拉曼散射信号得到增强。其中，还可以根据需求调整横向周期p、内径r1、外径r2和多层膜厚度d1、s、d2等参数，实现该生物传感器检测性能的调整。
[0048]
图3示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器的制备过程示意图。
[0049]
如图3所示，本发明还提供了上述多层膜陷阱式sers生物传感器的制备方法，包括以下步骤。
[0050]
步骤s1：
[0051]
提供基底1(如图3中(a)所示)，在基底1上形成多个陷阱结构2(如图3中(b)和图3中(c)所示)。
[0052]
其中，利用电子束光刻结合等离子刻蚀的方法形成上述多个陷阱结构。
[0053]
步骤s2：
[0054]
在上述具有多个陷阱结构2的基底表面形成包括第一金属层31、介质层32和第二金属层33的多层膜3，并使多层膜3至少覆盖陷阱结构的中心柱21表面和环形陷阱22表面(如图3中(d)所示)。
[0055]
其中，利用电子束蒸镀或磁控溅射的方法形成多层膜3，并可以在形成第一金属层31和第二金属层33之前分别增加形成粘附增强层的步骤以形成能够增强金属层粘附性的粘附增强层。
[0056]
利用上述方法制备得到的多层膜陷阱式sers生物传感器的sem俯视图a和截面图b，具体如图4所示。
[0057]
更具体地，本发明可以包括以下步骤：
[0058]
(1)清洗基底，在基底上旋涂一层光刻胶，如电子束光刻胶；
[0059]
(2)在光刻胶上曝光所设计的图形；
[0060]
(3)显影光刻胶，形成所需的光刻胶图形；
[0061]
(4)刻蚀样片，形成多个陷阱结构，如采用等离子刻蚀；
[0062]
(5)去除光刻胶，留下具有多个陷阱结构的基底；
[0063]
(6)在基底上，分别形成第一金属层、介质层和第二金属层，如采用电子束蒸镀；
[0064]
(7)制得覆盖多层膜的多层膜陷阱式sers生物传感器。
[0065]
图5示出了根据本发明示例性实施例的实施例1和2中r1＝75nm的多层膜陷阱式sers生物传感器在532nm激发波长下利用时域有限差分法计算得到的电场图。
[0066]
如图5所示，陷阱结构的底部和边缘都存在强烈的电磁场，同时相邻的金属层之间存在强烈的耦合作用，该电场图充分说明了电磁场主要集中在陷阱结构内，一旦病毒落入陷阱结构的环形陷阱内即可实现拉曼信号的高增强检测。
[0067]
本发明还提供了上述多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用，具体包括：提供所述多层膜陷阱式sers生物传感器；将病毒样本采集液滴入多层膜陷阱式sers生物传感器中，进行拉曼检测后得到待测病毒的拉曼光谱结果。其中，待测病毒为sars-cov-2病毒或其变异病毒。
[0068]
对于病毒而言，n蛋白主要负责封装病毒的遗传物质，当病毒侵入人体细胞时，n蛋白高度表达，进而攻击人体免疫系统。本发明将利用生物传感器检测病毒的n蛋白识别病毒的存在。
[0069]
下面将结合实施例对本发明进行具体说明。
[0070]
根据本发明，sers增强因子(ef)的计算公式如下：
[0071]
[0072]
其中，i
sers
为所测分析物的sers强度，i
bulk
为正常拉曼强度。n
sers
为sers生物传感器表面吸附的分析物的单层分子数，n
bulk
为激光照射下在体积内激发的分子数量。
[0073]
实施例1：sars-cov-2病毒n蛋白检测识别
[0074]
本实施例采用利用上述方法制得的四组sers生物传感器进行检测识别。在基底硅片上制备周期p为400nm，环形陷阱内径r1分别为30nm、50nm、75nm、100nm，外径r2为150nm，多层膜材料分别为ag/sio2/ag的sers生物传感器。其中，中心柱高度h为80nm，第一金属层和第二金属层是ag层，且厚度d1和d2为30nm，介质层sio2厚度s为10nm。该四组不同环形陷阱内径的多层膜陷阱式sers生物传感器用于检测浓度为1.0ng/ml的sars-cov-2 n蛋白，所采用的激发波长为532nm，光谱采集时间为10s。
[0075]
图6示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在不同环形陷阱内径r1下检测的sars-cov-2 n蛋白表面增强拉曼光谱图。如图6所示，四组sers生物传感器的表面增强拉曼光谱都清晰地识别了sars-cov-2 n蛋白的拉曼特征结构，且拉曼增强效果明显，而无此陷阱结构的拉曼光谱强度十分微弱。
[0076]
同时，对sars-cov-2 n蛋白进行了更低浓度的检测。在532nm激光下，选取内径为30nm的多层膜陷阱式sers生物传感器，分别取10μl不同浓度的病毒样本采集液进行检测。
[0077]
图7示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在环形陷阱内径r1为30nm下检测的浓度范围0.35～3.5copies/ml sars-cov-2 n蛋白的表面增强拉曼光谱图(a)和浓度0.35copies/ml下的重复性测试结果(b)。如图7中a所示，该sers生物传感器可以清晰地识别出0.35～3.5copies/ml浓度范围内的sars-cov-2 n蛋白，计算其检测限低至0.03copies/ml。另外，为了研究该sers生物传感器的重复性，对0.35copies/ml的sars-cov-2 n蛋白进行了重复实验，选取100个拉曼光谱进行重复性实验，在拉曼位移1160cm-1
处的重复性(信号相对偏差)为9.78％，如图7中b所示。
[0078]
实施例2：r6g的检测识别
[0079]
本实施例同样采用利用上述实施例1的四组sers生物传感器进行检测识别，所采用的激发波长为532nm，光谱采集时间为1s。图8示出了根据本发明示例性实施例的多层膜陷阱式sers生物传感器在不同环形陷阱内径r1下检测的r6g表面增强拉曼光谱(图8中a)和拉曼mapping图(图8中b)。
[0080]
如图8中a所示，不同内径的sers生物传感器检测浓度为10-6
m r6g，四组sers生物传感器的表面增强拉曼光谱都清晰地识别了r6g的拉曼特征结构。对于内径分别为30nm、50nm、75nm和100nm的sers生物传感器，计算得到r6g在610cm-1
处的ef分别为～3.29
×
108、～1.39
×
108、～1.23
×
108和～1.00
×
108。另外，分别研究了不同内径sers生物传感器的均匀性，在5μm
×
5μm范围内进行了拉曼mapping检测，检测结果显示具有良好的均匀性，如图8中b。
[0081]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0082]
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

技术特征：
1.一种多层膜陷阱式sers生物传感器，其特征在于，包括：基底；多个陷阱结构，形成在所述基底表面，具有中心柱和位于中心柱外围的环形陷阱；多层膜，包括第一金属层、介质层和第二金属层，形成在所述基底表面并至少覆盖所述陷阱结构的中心柱表面和环形陷阱表面；其中，所述多层膜陷阱式sers生物传感器被配置为能够在拉曼光谱仪的入射光激发下产生对应于待测病毒的拉曼光谱。2.根据权利要求1所述多层膜陷阱式sers生物传感器，其特征在于，所述基底的材料为硅、石英、玻璃和蓝宝石中的一种；所述第一金属层和第二金属层的材料为ag或au，所述介质层的材料为氧化铝、二氧化硅和二氧化钛中的至少一种。3.根据权利要求1所述多层膜陷阱式sers生物传感器，其特征在于，所述第一金属层的厚度d1为15～35nm，所述介质层的厚度s为5～15nm，所述第二金属层的厚度d2为15～35nm。4.根据权利要求1所述多层膜陷阱式sers生物传感器，其特征在于，所述多层膜还包括分别形成在所述第一金属层和第二金属层之前的粘附增强层，所述粘附增强层的材料为cr、ge或ti且厚度为0.5～1nm。5.根据权利要求1所述多层膜陷阱式sers生物传感器，其特征在于，所述多个陷阱结构周期性地排列在基底上，横向周期p为300～500nm；所述中心柱的高度h为80～150nm，所述环形陷阱的内径r1为30～100nm、外径r2为125～175nm。6.如权利要求1至5中任一项所述多层膜陷阱式sers生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，提供基底，在所述基底上形成多个陷阱结构；s2，在具有多个陷阱结构的基底表面形成包括第一金属层、介质层和第二金属层的多层膜，并使所述多层膜至少覆盖所述陷阱结构的中心柱表面和环形陷阱表面。7.根据权利要求6所述多层膜陷阱式sers生物传感器的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，利用电子束光刻结合等离子刻蚀的方法形成所述多个陷阱结构；在步骤s2中，利用电子束蒸镀或磁控溅射的方法形成所述多层膜，其中，在所述第一金属层和第二金属层之前分别形成粘附增强层。8.如权利要求1至5中任一项所述多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用。9.根据权利要求8所述多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用，其特征在于，包括：s1，提供所述多层膜陷阱式sers生物传感器；s2，将病毒样本采集液滴入所述多层膜陷阱式sers生物传感器中，进行拉曼检测后得到待测病毒的拉曼光谱结果。10.根据权利要求9所述多层膜陷阱式sers生物传感器在病毒检测中的应用，其特征在于，所述待测病毒为sars-cov-2病毒或其变异病毒。

技术总结
本发明公开了多层膜陷阱式SERS生物传感器及其制备方法和应用，该生物传感器包括：基底；多个陷阱结构，形成在基底表面，具有中心柱和位于中心柱外围的环形陷阱；多层膜，包括第一金属层、介质层和第二金属层，形成在基底表面并至少覆盖陷阱结构的中心柱表面和环形陷阱表面；该多层膜陷阱式SERS生物传感器被配置为能够在拉曼光谱仪的入射光激发下产生对应于待测病毒的拉曼光谱。制备方法包括：提供基底，在基底上形成多个陷阱结构；在具有多个陷阱结构的基底表面形成多层膜并使多层膜至少覆盖陷阱结构的中心柱表面和环形陷阱表面。本发明能够在无需前处理的条件下对病毒实现快速、高稳定性和高重复性的直接检测。高稳定性和高重复性的直接检测。高稳定性和高重复性的直接检测。


技术研发人员：罗先刚 李冬贤 岳伟生 高平 何琼 张涛
受保护的技术使用者：中国科学院光电技术研究所
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/8/23