用于在细胞培养期间降低分泌的重组表达蛋白质中半胱氨酸残基的氧化水平的方法与流程

1.本披露涉及用于在细胞培养期间，例如在哺乳动物细胞重组产生抗il-17抗体如苏金单抗(secukinumab)期间，降低分泌的重组表达蛋白质中一个或多个半胱氨酸残基的氧化水平的方法。
背景技术：
：：2.经典抗体由两条轻链(l)和两条重链(h)组成，两条轻链的分子量各自为约25kd，两条重链的分子量各自为约50kd。轻链和重链通过二硫键(l-s-s-h)连接，并且两个lh单元通过两个二硫键进一步连接在重链之间。经典抗体的通式为l-ss-h(-ss-)2h-ss-l或简化为h2l2(hhll)。除了这些保守的链间二硫键之外，还有保守的链内二硫键。两种类型的二硫键对于抗体的稳定性和行为(例如，亲和力)都很重要。通常，二硫键由在抗体链中的保守位置发现的两个半胱氨酸残基(cys-sh)产生，这两个半胱氨酸残基自发形成二硫键(cys-s-s-cys)。二硫键的形成由环境的氧化还原电势和硫醇-二硫化物交换中专用的酶的存在决定。内部二硫键(cys-s-s-cys)使抗体的三维结构稳定。3.存在含有额外的一个或多个游离半胱氨酸(即，未配对的半胱氨酸)的抗体。在一些情况下，一个或多个游离半胱氨酸参与抗原识别和结合，例如因为在抗体的互补决定区中存在游离半胱氨酸。对于这些抗体，游离半胱氨酸的修饰可能对分子的活性和稳定性具有负面影响，并且可导致增加的免疫原性。因此，对这些抗体的加工可能是困难的，因为最终产物可能含有大量无活性的、错误折叠的和/或无用的抗体材料。通过援引整体并入本文的us20090280131提供了抗il-17抗体，例如苏金单抗(即，ain457)，其在轻链互补决定区(cdr)3环(l-cdr3)中的顺式脯氨酸之后具有游离半胱氨酸残基(即，如seqidno:6所示的l-cdr3的第八位氨基酸，该氨基酸对应于如seqidno:10所示的轻链可变区的氨基酸97，下文称为“cysl97”)。为了保持完全活性，苏金单抗的未配对半胱氨酸残基不能通过与其他半胱氨酸残基的氧化二硫化物配对或通过用外源化合物氧化(例如，与其他蛋白质形成混合二硫化物，用细胞代谢物(例如，半胱氨酸或谷胱甘肽)衍生化，和通过氧形成亚砜)进行掩蔽。不幸的是，因为苏金单抗是使用哺乳动物细胞制造的，这些哺乳动物细胞将苏金单抗分泌到细胞培养基中，所以确实发生了不期望的基于细胞的cysl97修饰。4.类似地，将游离半胱氨酸工程改造到抗体序列中可用于促进化学接头、药物、标记和/或其他部分的定点缀合。例如，junutula等人(nat.biotechnol.[自然生物技术],2008,26,925–932)通过重链丙氨酸114的突变将工程化半胱氨酸引入抗muc16抗体中。作者发现突变的抗体在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中的表达生成具有工程化半胱氨酸残基的抗体，该半胱氨酸残基用半胱氨酸或谷胱甘肽作为二硫化物封端。因此，必须对工程化半胱氨酸残基进行处理以去除不期望的基于细胞的修饰。[0005]已经报道了选择性还原其游离半胱氨酸残基被氧化的抗体的方法。例如，wo2016/103146a1中披露了在哺乳动物细胞已经重组产生的il-17抗体的制剂中的氧化cysl97的还原。具体地，应用下游加工步骤，诸如使包含抗体的制剂与至少一种还原剂在系统中接触以形成还原混合物；以及温育该还原混合物，同时保持该系统中的氧体积传质系数(kla*)《约0.37h-1，所述kla*通过将溶解氧曲线改编为饱和曲线来计算。类似地，junutula等人报道了采用强还原剂(例如，三(2-羧乙基)膦[tcep]或二硫苏糖醇[dtt])，纯化还原的抗体和随后使用cu2+或脱氢抗坏血酸再氧化链间二硫键的程序。[0006]然而，此类下游方法步骤可能需要昂贵的设备、额外的纯化步骤，并导致延长的工艺提前期(processleadtime)。因此，需要允许更快和/或成本更低的总体制造的改进方法。因而，也可以评价重组抗体生产的上游加工步骤中的方法进行优化。[0007]用于工业应用(诸如表达重组多肽)的分泌性哺乳动物细胞的培养需要支持生长和生产的培养基。此类培养基必须支持高的活细胞密度，同时还刺激生物产物的合成和细胞外转运。早期的培养基开发努力得到了维持生长、活力和细胞功能的基本配制品，但这些基本配制品包含动物来源的组分和用于分批培养模式的复杂组成部分。随后的改进包括无血清和化学限定(cd)培养基的开发，关键营养物、生长因子和潜在抑制性或毒性细胞代谢物的鉴定，以及使用补料分批培养技术和灌注培养技术优化营养物递送同时最小化不需要的废弃产物的累积。[0008]所有细胞培养基都需要类似的基本营养物以支持细胞生长。氨基酸是细胞培养基中的关键组分，并且研究已经证实细胞培养基的氨基酸组成的微小变化可改变生长曲线和滴度。例如，ghaffari等人(biotechnolprogress[生物技术进展].2020；36:e2946)报道称维持所称的非必需氨基酸即半胱氨酸的可用性是普通cho细胞系中高产率重组蛋白生产的关键工艺参数。然而，半胱氨酸在典型细胞培养基的ph及氧和金属富集条件下容易被氧化。然而，半胱氨酸也可以促进重组蛋白的游离半胱氨酸残基不期望的氧化。因此，半胱氨酸补料策略通常需要高度优化以便从cho细胞获得高产率的重组表达蛋白。[0009]许多细胞培养基和培养基补料是可商购获得的以提供关键营养物。然而，为了在生产中优化具有还原的半胱氨酸残基的分泌性重组多肽的质量和产率，仍然需要定制针对重组多肽的培养基和补料。由于细胞培养条件中有许多参数可以改变，工艺优化是复杂的，即使对于可商购获得的重组多肽诸如抗体而言，仍然需要提供用于工业生产的优化工艺。技术实现要素：[0010]尽管在细胞培养基领域进行了广泛的研究和优化，但是令人惊讶地发现，减少哺乳动物细胞培养基中添加的半胱氨酸的量以降低培养基中cys等同物的浓度可以减少对所表达的抗体的游离半胱氨酸的不期望的修饰。这种减少量的不期望的游离半胱氨酸修饰可导致抗体活性提高和/或避免对随后抗体还原和任选再氧化的需要。[0011]根据第一方面，本披露提供了一种用于在补料分批细胞培养物中产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：[0012]a.在包含基础培养基和一种或多种补料培养基的细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中所述基础培养基包含浓度为约0.3g/l的cys等同物，并且其中所述补料培养基包含浓度小于约0.8g/l的cys等同物，并且其中所述细胞培养基中累积cys等同物的浓度小于约0.4g/l；[0013]b.表达所述重组多肽以及[0014]c.从所述培养基中回收所述多肽。[0015]细胞培养基中的累积cys等同物是源自基础培养基和/或补料培养基的细胞培养基中的半胱氨酸和胱氨酸的总浓度。累积cys等同物在补料分批方法开始时与在该方法结束时相比，例如在数小时或数天后可以是不同的浓度，并且在将补料培养基添加到细胞培养基时，在该方法期间可以变化。在一个实施例中，在补料分批方法开始时细胞培养基中cys等同物的浓度可以小于约0.6g/l。例如，小于约0.5g/l，小于约0.4g/l和优选地小于约0.3g/l。在分批补料方法期间，由于向细胞培养基中添加0.3g/l至约0.8g/l的cys等同物(通过添加半胱氨酸或胱氨酸引起)，cys等同物的浓度可以变化。为了得到该浓度的cys等同物，添加到补料培养基中的细胞培养基中的半胱氨酸的浓度可以小于约1g/l。例如，基础培养基可以不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基可以包含浓度小于约1.0g/l，例如小于约0.9g/l，小于约0.8g/l，并且优选地小于约0.7g/l的半胱氨酸。在一个实施例中，基础培养基可以不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基可以包含浓度为约0.66g/l的半胱氨酸。在另一个实施例中，基础培养基可以不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基可以包含浓度为约0.33g/l的半胱氨酸。在另一个实施例中，基础培养基可以不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基也可以不包含半胱氨酸。[0016]在如本文所述的补料分批方法结束时，细胞培养基中累积cys等同物的浓度可以小于约0.4g/l。在标准的补料分批细胞培养中，其中没有进行改变以降低基础培养基和/或补料培养基中的cys等同物，细胞培养基中累积cys等同物的浓度可以为约0.6g/l。[0017]在一个实施例中，在补料分批细胞培养物中产生的重组多肽是抗体，优选地抗il-17抗体即苏金单抗。[0018]在一个实施例中，在补料分批细胞培养物中使用的哺乳动物细胞选自由以下各项组成的组：cho细胞、hek细胞和sp2/0细胞。例如，哺乳动物细胞可以是cho细胞，选自由以下各项组成的组：cho-s、chokl、chopro3-、chodg44、chop12或dhfr-cho细胞系duk-bii、duxbi1或cho-k1sv。[0019]在第二方面，上述降低细胞培养基中cys等同物的浓度的方法可与选择性还原的下游加工步骤组合，其中将抗体与至少一种还原剂在系统中温育以形成还原混合物，以及温育该还原混合物，同时保持该系统中的氧体积传质系数(kla*)《约0.37h-1，所述kla*通过使溶解氧曲线适应饱和曲线来计算。优选地，该抗体是苏金单抗。在wo2016/103146a1中披露了用于选择性还原il-17抗体制剂中在位置cysl97处的半胱氨酸残基的这种下游加工步骤。[0020]根据本披露的方法产生的重组多肽可以通过进行另外的制备药物产品的步骤来制备以施用于人类患者。例如，在重组多肽是抗体的情况下，必须纯化该抗体并用各种赋形剂配制该抗体以提供适合施用于患者的药物组合物。另外，该抗体可以与包含向患者施用的说明书的小册子一起包装。这样的小册子可以提供用于所封闭的抗体的剂量、施用途径、方案和总治疗持续时间。[0021]在一个方面，本发明提供了一种用于通过哺乳动物细胞培养物产生重组多肽的方法，该方法包括以下步骤：a)在包含细胞培养基的培养物中培养哺乳动物细胞(例如，选自由cho细胞、hek细胞和sp2/0细胞组成的组)，其中该细胞培养基包含与对照基础培养基相比浓度降低的cys等同物；b)通过灌注用新鲜细胞培养基更换培养物中的全部或一部分细胞培养基，其中该新鲜细胞培养基与对照交换培养基相比包含浓度降低的cys等同物；c)表达重组多肽以及d)从培养物中回收该多肽。[0022]在一些实施例中，灌注细胞培养基包含浓度为约0.1g/l至小于约0.6g/l、约0.2g/l至小于约0.5g/l、约0.25g/l至小于约0.4g/l或0.3g/l至约0.4g/l的cys等同物。在一些实施例中，新鲜灌注细胞培养基包含浓度为约0.1g/l至小于约1.1g/l、约0.2g/l至小于约0.9g/l、约0.25g/l至小于约0.6g/l或0.3g/l至约0.4g/l的cys等同物。在一些实施例中，培养基包含浓度为约0.3g/l的cys等同物。在一些实施例中，新鲜培养基包含浓度为约0.3g/l的cys等同物。[0023]在一些实施例中，添加到灌注培养物中的累积cys等同物小于约11g/l，小于约9g/l或小于约7g/l。在一些实施例中，添加到培养物中的累积cys等同物为约3g/l至小于约11g/l、约4g/l至小于约11g/l、约5g/l至小于约11g/l、约3g/l至小于约9g/l、约4g/l至小于约9g/l、约5g/l至小于约9g/l，或优选地约5g/l至小于约7g/l。[0024]在一些实施例中，添加到灌注培养物中的累积cys等同物小于约1g/l/天、小于0.9g/l/天、小于0.7g/l/天、小于0.6g/l/天、小于约0.5g/l/天、小于约0.4g/l/天或小于约0.3g/l/天。在一些实施例中，添加到灌注培养物中的累积cys等同物为约0.1g/l/天至小于约1g/l/天，优选地约0.2g/l/天至小于约0.6g/l/天，更优选地约0.2g/l/天至小于0.5g/l/天，或约0.3g/l/天或0.4g/l/天。附图说明[0025]图1是示出了根据实施例的抗体样品的活性的图。[0026]图2示出了通过降低灌注培养基的半胱氨酸/胱氨酸浓度(cys等同物)对随时间(按天计)(x轴)而变化的抗体活性(％)的影响。与灌注培养基的基线(y轴)相比，半胱氨酸/胱氨酸浓度的降低越大导致抗体活性的保持率更大。[0027]图3显示降低基础培养基和/或补料培养基中半胱氨酸的量对随时间(天；x轴)而产生的苏金单抗的浓度(mg/ml；y轴)几乎没有影响。[0028]图4显示第12天苏金单抗的终末培养物浓度(mg/ml)在基线(包含标准的基础培养基和补料培养基的细胞培养基)和所测试的三种变体基础培养基和/或补料培养基之间变化很小。[0029]图5示出了与基线(包含标准的基础培养基和补料培养基的细胞培养基)相比，使用所测试的三种变体基础培养基和/或补料培养基产生的抗体样品的活性(％)。[0030]图6示出了通过灌注培养产生的抗体样品的活性(％)，该灌注培养使用在灌注培养基中没有半胱氨酸的试验灌注培养基，因此与包含正常水平的半胱氨酸和cys等同物的对照灌注细胞培养基相比cys等同物减少50％。添加到试验灌注细胞培养物和对照灌注细胞培养物中的累积cys等同物分别为大约5.875g/l(约0.31g/l/天)和11.642g/l(0.61g/l/天)，每天大约进行一次完全培养基交换。具体实施方式[0031]本披露的目的是提供用于在细胞培养期间，例如在哺乳动物细胞重组生产苏金单抗期间降低重组多肽诸如抗il-17抗体中的半胱氨酸残基的氧化水平的方法。[0032]术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”x的组合物可以仅由x组成或可以包含另外的物质，例如x+y。[0033]与数值x相关的术语“约”意指例如+/-10％。当在数值范围或数字列表前使用时，术语“约”适用于系列中的每个数字，例如，短语“约1-5”应被解释为“约1–约5”，或例如，短语“约1、2、3、4”应被解释为“约1、约2、约3、约4等”。[0034]基于翻译后氨基酸序列，苏金单抗的相对分子质量为147,944道尔顿。该分子量(即147,944道尔顿)用于计算本披露全篇的苏金单抗摩尔浓度值和摩尔比。然而，在cho细胞中产生期间，通常从每条重链中去除c端赖氨酸。每条重链缺少c端赖氨酸的苏金单抗的相对分子质量为147,688道尔顿。苏金单抗的制剂含有在重链上有和没有c端赖氨酸残基的分子的混合物。本披露中使用的苏金单抗摩尔浓度值(和采用这些摩尔浓度值的比率)因此是估计值，并且关于这些数值的术语“约”、“近似”等至少涵盖相对于分子质量的这种变化和由此进行的所得计算。[0035]词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要时，本披露的定义中可以省略单词“基本上”。[0036]大规模培育细胞可用于例如工业生物技术中建立的各种发酵方法。可以使用根据本发明的细胞培养基，利用不连续细胞培养方法和连续细胞培养方法，诸如灌注和恒化培养。不连续方法，包括重复补料分批和重复分批，是一个优选的实施例。通常，本发明的方法和组合物涉及通过细胞培养产生分泌性多肽。[0037]分批细胞培养包括补料分批培养或简单分批培养。术语“补料分批细胞培养”是指这样的细胞培养，其中最初将细胞和细胞培养基供给至培养容器，并且在培养过程中连续地或以离散增量将另外的培养营养物补料到培养物，在培养终止之前有或没有周期性的细胞和/或产物收获。术语“简单分批培养”涉及其中在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和细胞培养基)供给至培养容器的程序。优选地，在根据本发明的细胞培养基中培育的细胞是cho细胞。[0038]术语“细胞培养基”是指可用于使细胞长时间段生长的营养物的水溶液。通常，细胞培养基包含以下组分：能量源，通常将是碳水化合物，优选地葡萄糖、氨基酸，优选地碱性组的氨基酸，包括所有必需氨基酸和非必需氨基酸；维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物；游离脂肪酸；和无机化合物，包括微量元素、无机盐、缓冲化合物，及核苷和碱。[0039]术语“生长培养基”是指通常在整个生产过程的扩增期使用的细胞培养基。扩增期是整个培育/生产过程的第一时期，第一时期的主要特征在于高细胞生长和较少的多肽产生。扩增期用于扩增细胞，这意味着生成足够数目的处于指数生长期的细胞以接种生产生物反应器。[0040]术语“生产培养基”是指通常在整个生产过程的生产期使用的细胞培养基。生产期是整个培育/生产过程的第二时期，第二时期用于产生大量产物。在生产期，细胞应尽可能长时间地保持存活和生产模式。[0041]由于安全和污染问题，在制药业领域中使用细胞培养基，例如用于生产治疗活性的重组多肽，通常不允许使用任何动物来源的材料。因此，根据本发明的细胞培养基优选地是不含血清和/或蛋白质的培养基。术语“不含血清和/或蛋白质的培养基”表示完全化学限定的培养基，该培养基不含来自动物来源的添加剂如组织水解产物、胎牛血清等。此外，优选地也不向根据本发明的细胞培养物中添加蛋白质，特别是生长因子如胰岛素、转铁蛋白等。优选地，根据本发明的细胞培养基也不补充水解蛋白质源如大豆、小麦或水稻蛋白胨或酵母水解产物等。[0042]术语“基础培养基”是用于培养细胞的培养基，该培养基本身直接用于培养细胞并且不用作其他培养基的添加剂，但是可将各种组分添加到基础培养基中。例如，如果cho细胞在dmem(一种众所周知的、可商购获得的哺乳动物细胞培养基)中培养，并且定期用葡萄糖或其他营养物补料，dmem将被认为是基础培养基。“补料培养基”是在细胞培养中用作补料的培养基，该细胞培养可以是补料分批细胞培养。与基础培养基一样，基于所培养的特定细胞的需要设计补料培养基，并且补料培养基可以具有较高浓度的基础培养基的大部分而非全部组分。例如，一些组分，例如包括氨基酸或碳水化合物在内的营养物，可以是它们在基础培养基中的正常浓度的约5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、400、600、800倍或甚至约1000倍。一些组分诸如盐可以保持在与基础培养基大约相同的浓度，以保持补料与基础培养基等渗。添加一些组分以保持补料的生理性，而添加一些组分是因为它们向培养物中补充营养物。[0043]根据本发明的细胞培养基可用于各种细胞培养方法。细胞的培育可以在贴壁培养中进行，例如在单层培养中或优选地在悬浮培养中进行。[0044]可以从根据本发明的细胞培养物和细胞培养基产生的多肽不受限制。多肽可以是重组的或不是重组的。如本文所用的术语“多肽”涵盖由通过肽键连接的多于两个氨基酸的链组成的分子；含有两条或更多条此类链的分子；包含一条或多条被另外修饰，例如通过糖基化修饰的此类链的分子。该多肽可以含有一个或多个天然二硫键。该多肽可以含有天然的或工程化的游离半胱氨酸。术语多肽旨在涵盖蛋白质。[0045]根据本发明通过细胞培养物和细胞培养基产生的优选类别的多肽是重组抗体。[0046]如在本文提及的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合部分或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(ch1、ch2和ch3)构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区可进一步细分为被称为高变区或互补决定区(cdr)的高变区，它们散布着被称为框架区(fr)的更保守的区域。每个vh和vl由按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(c1q))的结合。[0047]如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异结合抗原(例如，il-17)的能力的抗体的片段。已经显示，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括fab片段，一种由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；f(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；fd片段，其由vh和ch1结构域组成；fv片段，其由抗体的单臂的vl和vh结构域组成；由vh结构域组成的dab片段(ward等人,1989,nature[自然]341:544-546)；和分离的cdr。示例性抗原结合位点包括在seqidno:1-6和11-13(表1)中列出的苏金单抗的cdr，优选重链cdr3。此外，虽然fv片段的两个结构域vl和vh是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的合成接头来相连，其中vl区和vh区配对形成单价分子(被称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人,(1988)science[科学]242:423-426；huston等人,(1988)proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊],85:5879-5883)。这种单链抗体也旨在涵盖于术语“抗体”的范围内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得单链抗体和抗原结合部分。[0048]如本文所用，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合il-17的分离的抗体基本上不含特异性结合除il-17以外的抗原的抗体)。如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制剂。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有框架区和cdr区二者都衍生自人来源的序列的可变区的抗体。“人抗体”不需要由人、人组织或人细胞产生。本披露的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变引入的突变，通过抗体基因重组期间在体内连接处的n-核苷酸添加，或通过体内体细胞突变)。在所披露的程序和组合物的一些实施例中，il-17抗体是人抗体、分离的抗体和/或单克隆抗体。[0049]术语“il-17”是指il-17a，先前被称为ctla8，并且包括来自不同物种(例如，人、小鼠、和猴)的野生型il-17a、il-17a的多态变体和il-17a的功能等同物。根据本披露的il-17a的功能等同物与野生型il-17a(例如，人il-17a)优选具有至少约65％、75％、85％、95％、96％、97％、98％、或甚至99％总体序列同一性，并且基本上保留了诱导人真皮成纤维细胞产生il-6的能力。[0050]术语“kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“kd”旨在指解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(m)。可以使用本领域中充分确立的方法确定抗体的kd值。用于确定抗体的kd的方法是通过使用表面等离子体共振，或者使用生物传感器系统，如系统。在一些实施例中，il-17抗体或抗原结合片段(例如苏金单抗)对于人il-17的kd为约100-250pm。[0051]术语“亲和力”是指抗体和抗原在单个抗原位点处的相互作用强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。用于评估抗体对各种物种的il-17的结合亲和力的标准测定法是本领域已知的，包括例如elisa、蛋白质印迹和ria。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，比如通过biacore分析。[0052]根据本领域已知的和本文所述的方法确定的“抑制”一种或多种这些il-17功能特性(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物学活性等)的抗体将被理解为，相对于不存在抗体时(或当存在不相关特异性的对照抗体时)观察到的特定活性，涉及特定活性在统计学上显著的降低。抑制il-17活性的抗体影响统计学上显著的降低，例如，降低了至少约10％的测量参数，降低了至少50％、80％或90％，并且在所披露的方法和组合物的某些实施例中，使用的il-17抗体可以抑制大于95％、98％或99％的il-17功能活性。[0053]除非另有说明，根据本披露，术语“衍生物”用于定义il-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的例如特定序列(例如，可变结构域)的氨基酸序列变体和共价修饰(例如，聚乙二醇化、脱酰胺作用、羟基化、磷酸化、甲基化等)。“功能衍生物”包括具有与所披露的il-17抗体一样的定性的生物学活性的分子。功能衍生物包括如本文披露的il-17抗体的片段和肽类似物。片段包含根据本披露(例如，指定序列)的多肽序列内的区域。本文披露的il-17抗体的功能衍生物(例如，苏金单抗的功能衍生物)优选地包含与本文披露的il-17抗体和其抗原结合片段的vh和/或vl序列(例如，表1的vh和/或vl序列)具有至少约65％、75％、85％、95％、96％、97％、98％、或99％总体序列同一性的vh和/或vl结构域，并且基本上保留与人il-17结合的能力，或例如抑制il-17诱导的人真皮成纤维细胞的il-6产生。[0054]短语“基本上相同”意指与特定参考序列相比，相关氨基酸或核苷酸序列(例如，vh或vl结构域)与其相同或具有非实质性差异(例如，通过保守氨基酸取代)。非实质性差异包括微小的氨基酸变化，例如在特定区域(例如，vh或vl结构域)的5个氨基酸序列中的1个或2个取代。在抗体的情况下，第二抗体具有相同的特异性并且具有其至少50％的亲和力。与本文披露的序列基本上相同(例如，具有至少约85％序列同一性)的序列也是本技术的一部分。在一些实施例中，相对于所披露的序列，衍生物il-17抗体(例如，苏金单抗的衍生物，例如苏金单抗生物类似抗体)的序列同一性可以是约90％或更高，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。[0055]关于天然多肽及其功能衍生物的“同一性”在本文中定义为：在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中氨基酸残基与相应天然多肽的残基相同的百分比。n-末端或c-末端延伸与插入均不应解释为降低同一性。用于比对的方法及计算机程序是熟知的。百分比同一性可以通过标准比对算法确定，例如altshul等人描述的基于局部比对搜索工具(blast)((1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志],215:403410)；needleman等人的算法((1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志],48:444453)；或者meyers等人的算法((1988)comput.appl.biosci.[生物科学中的计算机应用],4:1117)。一组参数可以是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的blosum62评分矩阵。也可使用已经整合到align程序(版本2.0)中的e.meyers和w.miller((1989)cabios[生物科学中的计算机应用],4:11-17)的算法，使用pam120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。[0056]“一个或多个氨基酸”是指例如所有天然存在的l-α-氨基酸且包括d-氨基酸。短语“氨基酸序列变体”是指当与根据本披露的序列相比时其氨基酸序列具有一些差异的分子。根据本披露的抗体的氨基酸序列变体，例如特定序列的变体仍然具有与人il-17结合的能力或例如抑制il-17诱导的人真皮成纤维细胞的il-6产生的能力。氨基酸序列变体包括取代性变体(去除至少一个氨基酸残基且在根据本披露的多肽中的相同位置插入不同氨基酸的那些变体)、插入性变体(紧邻根据本披露的多肽中的特定位置处的氨基酸插入一个或多个氨基酸的那些变体)以及缺失性变体(在根据本披露的多肽中去除一个或多个氨基酸的那些变体)。[0057]短语“游离半胱氨酸”、“非传统半胱氨酸”和“未配对半胱氨酸”可互换地指不参与保守的抗体二硫键结合的半胱氨酸，或关于非抗体多肽是指不与多肽野生型结构中的另一个未配对半胱氨酸形成二硫键的半胱氨酸。游离半胱氨酸可存在于抗体框架区或可变区中(例如，在cdr内)。在苏金单抗中，如seqidno:6所示的l-cdr3的第八位氨基酸(其对应于如seqidno:10所示的轻链可变区的氨基酸97)(下文称为cysl97)是游离半胱氨酸。每个苏金单抗分子包含两个此类游离半胱氨酸残基-每个vl结构域中一个。[0058]如本文所用的术语“选择性还原”是指如wo2016/103146a1中披露的选择性还原在哺乳动物细胞已经重组产生的il-17抗体的制剂中的cysl97的方法。具体地，应用下游加工步骤，诸如使包含抗体的制剂与至少一种还原剂在系统中接触以形成还原混合物；以及温育该还原混合物，同时保持该系统中的氧体积传质系数(kla*)《约0.37h-1，所述kla*通过将溶解氧曲线改编为饱和曲线来计算。[0059]在细胞培养系统中的重组多肽表达期间，在培养基中可包含半胱氨酸，或例如在补料分批方法期间在基础培养基中包含半胱氨酸和/或在培养基补料中添加到培养容器中。半胱氨酸是指l-半胱氨酸而不是d-半胱氨酸，并且可以以盐诸如一水合半胱氨酸盐酸盐的形式添加。通常，单体半胱氨酸在添加到细胞培养基中时立即二聚化，因此仅以胱氨酸的二聚体形式存在。这种氧化还原反应导致在2个单体半胱氨酸分子之间形成二硫键。本发明的基础培养基或补料培养基中的半胱氨酸浓度可以小于约5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15或0.10g/l。替代性地，基础培养基和/或补料培养基可以不含半胱氨酸。[0060]胱氨酸也可存在于基础细胞培养基中或作为培养基补料添加到培养基中，例如作为酪氨酸胱氨酸储备溶液的一部分。本发明的基础培养基或补料培养基中的半胱氨酸浓度可以小于约5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15或0.10g/l。替代性地，基础培养基和/或补料培养基可以不含半胱氨酸。[0061]尽管添加到培养基中的半胱氨酸通常氧化形成胱氨酸，但是添加到培养基中的一些胱氨酸可以还原形成半胱氨酸，因此上面对于这些浓度给出的数字是指实际添加到培养基中的半胱氨酸或胱氨酸的浓度，而不需要稍后确定多少比例的该物质可能已经被氧化或还原。因此，在培养容器中的细胞可用的半胱氨酸和/或胱氨酸的量的上下文中，可以使用术语“cys等同物”。如本文所用，该术语是指细胞培养基或培养基补料中半胱氨酸和胱氨酸总共的量或浓度。cys等同物将是培养容器中的细胞培养基中细胞可用的半胱氨酸/胱氨酸，无论源自基础培养基和/或补料培养基。因此在培养容器中，例如在用于补料分批方法的细胞培养基中，总cys等同物的浓度可以小于约5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.90、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15或0.10g/l。[0062]由于特别是在补料分批方法中，细胞培养基中的cys等同物可源自基础培养基和/或补料培养基，所以术语“累积cys等同物”用于指源自基础培养基和/或补料培养基的细胞培养基中的cys等同物的总量或总浓度。累积cys等同物在补料分批方法开始时与在该方法结束时相比，例如在5天、8天、10天、11天或12天后可以是不同的浓度，并且在将补料培养基添加到细胞培养基时，在该方法期间可以变化。在标准培养条件下的补料分批细胞培养方法中，细胞培养基中cys等同物的浓度可以在约0.5g/l至约0.6g/l或约4mm至约5mm的范围内。在根据本披露的方法中，在补料分批方法开始时细胞培养基中cys等同物的浓度可以小于约0.6g/l或小于约4.5mm。例如，小于约0.5g/l，小于约0.4g/l并且优选地小于约0.3g/l，或小于约3.5mm，小于约3.0mm并且优选地小于约2.5mm。在分批补料方法期间，由于向细胞培养基中添加0.3g/l至约0.8g/l的cys等同物(通过添加半胱氨酸或胱氨酸或两者引起)，cys等同物的浓度可以变化。为了达到该浓度的cys等同物，添加到补料培养基中的细胞培养基中的半胱氨酸的浓度可以小于约1g/l。例如，基础培养基可以不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基可以包含浓度小于约1.0g/l，例如小于约0.9g/l，小于约0.8g/l，并且优选地小于约0.7g/l的半胱氨酸。在一个实施例中，基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基包含浓度为约0.66g/l的半胱氨酸。在另一个实施例中，基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基包含浓度为约0.33g/l的半胱氨酸。在另一个实施例中，基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且补料培养基不包含半胱氨酸。[0063]可以在培养期过程的不同时间点将补料培养基添加到补料分批细胞培养物中。例如，可以在培养期间每天向细胞培养基中添加补料培养基，或者可以在两天或三天的初始期后添加补料培养基，然后每天添加补料培养基。在补料分批细胞培养方法期间，可以添加补料培养基一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次等。[0064]在如本文所述的补料分批细胞培养方法结束时，细胞培养基中累积cys等同物的浓度可以小于约0.4g/l或小于约3mm。在标准的补料分批细胞培养中，其中没有进行改变以降低基础培养基和/或补料培养基中的cys等同物，细胞培养基中累积cys等同物的浓度可以为约0.6g/l或约5mm。标准的(例如，补料分批)细胞培养基中累积cys等同物的浓度也可以称为基线。[0065]在灌注培养中，可以通过灌注介导的培养基交换将新鲜的细胞培养基添加到细胞培养物中。交换可以是连续的或不连续的(例如，在培养期过程的不同时间点进行)。例如，新鲜培养基可以在培养期间连续地与培养物中的细胞培养基交换，或者可以在两天或三天的初始期之后开始灌注交换，然后连续地交换。在一些实施例中，灌注在足以在每天培养中更换至少50％、优选75％、更优选99％或约100％的细胞培养基的条件下进行。[0066]因此，灌注分批培养期间消耗的培养基的总体积可以比补料分批培养高得多。因此，添加到灌注培养物中的累积cys等同物可相应地更高，同时仍实现由本文所述的方法和组合物提供的游离半胱氨酸氧化的较低氧化水平。例如，每天具有大约100％培养基交换的1000l灌注分批培养物可培养19天，消耗的培养基的总体积为大约19,000l。然而，总培养物体积可保持为大约1000l。在这样的实施例中，添加到对照灌注培养物中的累积cys等同物可以大于约7g/l培养物体积，大于约8g/l，大于约10g/l，或大于约11g/l，或为约11g/l。在一些实施例中，添加到对照灌注培养物中的累积cys等同物可以是或约11g/l或11.5g/l。类似地，添加到19天1000l灌注培养物中的累积cys等同物(每天交换约100％的培养基并在减少的半胱氨酸和/或减少的cys等同物条件下培养)可以小于约7g/l培养物体积、6.5g/l、6g/l或约5.8g/l累积cys等同物。[0067]因此关于灌注分批培养，降低的cys等同物条件可以通过按培养天数归一化的降低的累积cys等同物条件来表征。因此例如，在起始培养基和交换培养基中约0.6g/lcys等同物的对照条件下，每天大约1次完全培养基交换，培养19天灌注培养物的情况下，归一化累积cys等同物可为约0.6g/l/天。类似地，在起始培养基和交换培养基中约0.3g/lcys等同物(或更少)的试验条件下，每天大约1次完全培养基交换，培养19天灌注培养物的情况下，归一化累积cys等同物可以小于0.6g/l/天，诸如约0.3g/l/天。[0068]在一些实施例中，通过在含有小于0.62g/lcys等同物的基础灌注培养基中培养哺乳动物细胞并通过用灌注交换培养基连续或不连续地交换(例如通过灌注)全部或部分细胞培养基，每天向培养物中添加小于0.62g/lcys等同物，以灌注分批法产生具有游离半胱氨酸的分泌性重组蛋白。在一些情况下，该方法包括每天向培养物中添加约0.2g/lcys等同物至小于1g/lcys等同物(例如，通过灌注交换)。在一些情况下，该方法包括每天向培养物中添加约0.2g/lcys等同物至小于0.9g/lcys等同物(例如，通过灌注交换)。在一些情况下，该方法包括每天向培养物中添加约0.2g/lcys等同物至小于0.6g/lcys等同物(例如，通过灌注交换)。在一些情况下，该方法包括每天向培养物中添加约0.2g/lcys等同物至小于0.5g/lcys等同物(例如，通过灌注交换)。在一些情况下，该方法包括每天向培养物中添加约0.2g/lcys等同物至小于0.4g/lcys等同物(例如，通过灌注交换)。[0069]在一些实施例中，通过在含有小于0.62g/lcys等同物的基础灌注培养基中培养哺乳动物细胞并通过用含有小于1.1g/lcys等同物的交换培养基连续或不连续地交换(例如通过灌注)全部或部分细胞培养基，以灌注分批法产生具有游离半胱氨酸的分泌性重组蛋白。在一些情况下，灌注交换培养基含有小于1g/l、小于0.9g/l、小于0.6g/l、小于0.5g/l、小于约0.4g/l或约0.3g/l的cys等同物。在一些实施例中，基础灌注培养基含有小于0.6g/l或约0.3g/l的cys等同物。[0070]在一些实施例中，基础灌注培养基含有约0.2g/l的半胱氨酸至小于约0.6g/l的cys等同物。在一些实施例中，基础灌注培养基含有约0.25g/l的半胱氨酸至小于约0.5g/l的cys等同物。在一些实施例中，基础灌注培养基含有约0.3g/l的半胱氨酸至小于约0.4g/l的cys等同物。在一些实施例中，灌注交换培养基含有约0.2g/l的半胱氨酸至小于约1.1g/l的cys等同物。在一些实施例中，灌注交换培养基含有约0.25g/l的半胱氨酸至小于约0.9g/l的cys等同物。在一些实施例中，灌注交换培养基含有约0.3g/l的半胱氨酸至小于约0.6g/l的cys等同物。在一些实施例中，灌注基础培养基不含或基本上不含半胱氨酸。在一些实施例中，灌注交换培养基不含或基本上不含半胱氨酸。在一些实施例中，灌注基础培养基和/或灌注交换培养基不含或基本上不含半胱氨酸。在一些实施例中，灌注基础培养基和灌注交换培养基相同或基本上相同。基本上不含半胱氨酸的生产(例如，灌注基础或交换生产或补料分批基础或补料)培养基包括这样的培养基，其中由于存在残余的扩增培养基、宿主细胞产生半胱氨酸和/或生产培养期间胱氨酸减少而存在残余量的半胱氨酸。基本上不含半胱氨酸的基础培养基、交换培养基或补料培养基含有小于0.1g/l的半胱氨酸，优选小于0.05g/l的半胱氨酸，更优选小于0.01g/l的半胱氨酸。[0071]在一些实施例中，通过胱胺-cex(阳离子交换色谱)方法测量活性。胱胺-cex方法包括用胱胺(2,2’‑二硫代双(乙胺))衍生化抗体，接着使用阳离子交换色谱法(cex)进行分析分离。因为如果cysl97呈氧化形式，则本文披露的抗体(例如，苏金单抗)的活性降低，所以用胱胺衍生化cysl97充当测量抗体活性的代表。胱胺进行的衍生化导致每个游离cys97残基添加一个正电荷。然后可将所得苏金单抗的衍生化形式(例如+2、+1电荷)与非衍生化形式分离并通过cex定量。理论上可以认为具有两个胱胺与两条轻链上未配对的cys97结合的胱胺衍生化苏金单抗分子具有100％生物活性。可以认为添加一个与其中一条轻链上的未配对cys97结合的胱胺的胱胺衍生化苏金单抗分子具有50％的生物活性。可以认为没有任何胱胺与分子结合的胱胺衍生化苏金单抗分子是无生物学活性的。然后可以将抗体制剂(例如，苏金单抗抗体制剂)中胱胺衍生化的水平，与该制剂中胱胺衍生化的理论最大水平相比(例如，表示为理论最大值的百分比)用作制剂活性的量度。[0072]简言之，胱胺-cex可以如下进行。首先用羧肽酶b(1:40，w:w)处理抗体样品(50μg)，以去除重链中的c端赖氨酸，然后用4mm胱胺在5mm乙酸钠、0.5mmedta(ph4.7)中在室温下衍生化2小时。通过添加2μl的1m磷酸终止衍生化。使用propactmwcx-10分析柱(4mm×250mm，dionex)对胱胺衍生化的抗体样品进行cex。使用12.5mm至92.5mm氯化钠在25mm磷酸钠(ph6.0)中的梯度以1.0ml/min的流速进行分离。用uv检测器(agilenthplc1200)记录220nm处的吸收。[0073]il-17抗体及其抗原结合片段[0074]在一个实施例中，该il-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区cdr1、cdr2和cdr3的免疫球蛋白重链可变结构域(vh)，所述cdr1具有氨基酸序列seqidno:1，所述cdr2具有氨基酸序列seqidno:2，并且所述cdr3具有氨基酸序列seqidno:3。在一个实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区cdr1’、cdr2’和cdr3’的免疫球蛋白轻链可变结构域(vl’)，所述cdr1’具有氨基酸序列seqidno:4，所述cdr2’具有氨基酸序列seqidno:5并且所述cdr3’具有氨基酸序列seqidno:6。在一个实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区cdr1-x、cdr2-x和cdr3-x的免疫球蛋白重链可变结构域(vh)，所述cdr1-x具有氨基酸序列seqidno:11，所述cdr2-x具有氨基酸序列seqidno:12，并且所述cdr3-x具有氨基酸序列seqidno:13。[0075]在一个实施例中，该il-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白vh结构域和至少一个免疫球蛋白vl结构域，其中：a)该vh结构域包含(例如依次)：i)高变区cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1具有氨基酸序列seqidno:1，所述cdr2具有氨基酸序列seqidno:2，并且所述cdr3具有氨基酸序列seqidno:3；或ii)高变区cdr1-x、cdr2-x和cdr3-x，所述cdr1-x具有氨基酸序列seqidno:11，所述cdr2-x具有氨基酸序列seqidno:12，并且所述cdr3-x具有氨基酸序列seqidno:13；和b)vl结构域包含(例如依次)高变区cdr1’、cdr2’和cdr3’，所述cdr1’具有氨基酸序列seqidno:4，所述cdr2’具有氨基酸序列seqidno:5，并且所述cdr3’具有氨基酸序列seqidno:6。[0076]在一个实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含：a)包含seqidno:8中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域(vh)；b)包含seqidno:10中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域(vl)；c)包含seqidno:8中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白vh结构域和包含seqidno:10中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白vl结构域；d)包含seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域；e)包含seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中所列出的高变区的免疫球蛋白vl结构域；f)包含seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域；g)包含seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域以及包含seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中所列出的高变区的免疫球蛋白vl结构域；或h)包含seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域以及包含seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中所列出的高变区的免疫球蛋白vl结构域。[0077]为便于参考，基于卡巴特(kabat)定义以及如通过x射线分析且使用乔西亚(chothia)和同事们的方法所确定的，在下表1中提供苏金单抗单克隆抗体的高变区的氨基酸序列。[0078]表1.苏金单抗抗体的高变区的氨基酸序列[0079][0080][0081]在优选的实施例中，所述恒定区结构域优选地还包含适合的人恒定区结构域，例如，如“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学目的蛋白质序列]”(kabate.a.等人，usdepartmentofhealthandhumanservices[美国卫生及公共服务部]，publichealthservice[公共卫生署]，nationalinstituteofhealth[美国国立卫生研究院])中所述。编码苏金单抗的vl的dna列出在seqidno:9中。编码苏金单抗的vh的dna列出在seqidno:7中。[0082]在一些实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段(例如，苏金单抗)包含seqidno:10的三个cdr。在其他实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:8的三个cdr。在其他实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:10的三个cdr和seqidno:8的三个cdr。可以在表1中发现seqidno:8和seqidno:10的cdr。可以在seqidno:6中看到轻链(cysl97)中的游离半胱氨酸。[0083]在一些实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:14的轻链。在其他实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:15的重链(具有或不具有c端赖氨酸)。在其他实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:14的轻链和seqidno:15的重链(具有或不具有c端赖氨酸)。在一些实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:14的三个cdr。在其他实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:15的三个cdr。在其他实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含seqidno:14的三个cdr和seqidno:15的三个cdr。可以在表1中发现seqidno:14和seqidno:15的cdr。表中列出了一组完整的序列。[0084]高度可变区可与任意种类的框架区相连，但优选为人源。适合的框架区描述于kabate.a.等人(同上)中。优选的重链框架是人重链框架，例如苏金单抗抗体的框架。该框架依次由例如fr1(seqidno:8的氨基酸1至30)、fr2(seqidno:8的氨基酸36至49)、fr3(seqidno:8的氨基酸67至98)和fr4(seqidno:8的氨基酸117至127)区组成。考虑到由x射线分析确定的苏金单抗的高变区，另一个优选的重链框架依次由fr1-x(seqidno:8的氨基酸1至25)、fr2-x(seqidno:8的氨基酸36至49)、fr3-x(seqidno:8的氨基酸61至95)和fr4(seqidno:8的氨基酸119至127)区组成。以类似的方式，轻链框架依次由fr1’(seqidno:10的氨基酸1至23)、fr2’(seqidno:10的氨基酸36至50)、fr3’(seqidno:10的氨基酸58至89)和fr4’(seqidno:10的氨基酸99至109)区组成。[0085]在一个实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段(例如，苏金单抗)选自人il-17抗体，该抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区cdr1、cdr2和cdr3；所述cdr1具有氨基酸序列seqidno:1，所述cdr2具有氨基酸序列seqidno:2，并且所述cdr3具有氨基酸序列seqidno:3；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区cdr1’、cdr2’和cdr3’，所述cdr1’具有氨基酸序列seqidno:4，所述cdr2’具有氨基酸序列seqidno:5，并且所述cdr3’具有氨基酸序列seqidno:6。[0086]在一个实施例中，该il-17抗体或其抗原结合片段选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，该抗原结合位点包含：a)依次包含高变区cdr1、cdr2和cdr3的第一结构域，所述cdr1具有氨基酸序列seqidno:1，所述cdr2具有氨基酸序列seqidno:2，并且所述cdr3具有氨基酸序列seqidno:3；和b)依次包含高变区cdr1’、cdr2’和cdr3’的第二结构域，所述cdr1’具有氨基酸序列seqidno:4，所述cdr2’具有氨基酸序列seqidno:5，并且所述cdr3’具有氨基酸序列seqidno:6；以及c)结合第一结构域的n端末端和第二结构域的c端末端或结合第一结构域的c端末端和第二结构域的n端末端的肽接头。[0087]替代性地，如在所披露的方法中使用的il-17抗体或其抗原结合片段可以包含通过序列在本文列出的il-17抗体的衍生物(例如，苏金单抗的聚乙二醇化变体)。替代性地，在所披露的方法中使用的il-17抗体或其抗原结合片段的vh或vl结构域可以具有与本文列出的vh或vl结构域(例如，在seqidno:8和10中列出的那些结构域)基本上相同的vh或vl结构域。本文披露的人il-17抗体可包含与seqidno:15所列出的重链基本上相同的重链(具有或不具有c端赖氨酸)和/或与seqidno:14所列出的轻链基本上相同的轻链。本文披露的人il-17抗体可包含：含有seqidno:15的重链(具有或不具有c端赖氨酸)和含有seqidno:14的轻链。本文披露的人il-17抗体可以包含：a)一条重链，其包含具有与seqidno:8中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域和人重链的恒定部分；和b)一条轻链，其包含具有与seqidno:10中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。[0088]替代性地，在所披露的方法中使用的il-17抗体或其抗原结合片段可以是本文列出的参考il-17抗体的氨基酸序列变体(只要含有cysl97)。本披露还包括il-17抗体或其抗原结合片段(例如，苏金单抗)，其中苏金单抗(但不是cysl97)的vh或vl结构域的一个或多个氨基酸残基中通常仅几个(例如，1-10个)发生了改变；例如通过突变，例如相应dna序列的定点诱变。在所有此类衍生物和变体的情况中，il-17抗体或其抗原结合片段在所述分子的约50nm或更低、约20nm或更低、约10nm或更低、约5nm或更低、约2nm或更低、或更优选地约1nm或更低的浓度下，能够将约1nm(＝30ng/ml)人il-17的活性抑制50％，如wo2006/013107的实例1中所述针对人真皮成纤维细胞中由hu-il-17诱导的il-6产生来测量所述抑制活性。[0089]在一些实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)与成熟人il-17的表位结合，该表位包含leu74、tyr85、his86、met87、asn88、val124、thr125、pro126、ile127、val128、his129。在一些实施例中，il-17抗体(例如苏金单抗)与成熟人il-17的表位结合，该表位包含tyr43、tyr44、arg46、ala79、asp80。在一些实施例中，il-17抗体(例如苏金单抗)与具有两条成熟人il-17链的il-17同源二聚体的表位结合，所述表位包含在一条链上的leu74、tyr85、his86、met87、asn88、val124、thr125、pro126、ile127、val128、his129和在另一条链上的tyr43、tyr44、arg46、ala79、asp80。用于定义这些表位的残基编号方案基于是成熟蛋白(即，缺少23个氨基酸的n端信号肽且以甘氨酸开始的il-17a)的第一个氨基酸的残基。不成熟的il-17a的序列列出在swiss-prot条目q16552中。在一些实施例中，il-17抗体具有约100-200pm的kd。在一些实施例中，il-17抗体对于约0.67nm人il-17a的生物学活性的体外中和具有约0.4nm的ic50。在一些实施例中，皮下注射(s.c.)施用il-17抗体的绝对生物利用度具有约60％至约80％的范围，例如约76％。在一些实施例中，il-17抗体(如苏金单抗)具有的消除半衰期为约4周(例如，约23至约35天、约23至约30天，例如约30天)。在一些实施例中，il-17抗体(如苏金单抗)具有的tmax为约7至8天。[0090]在所披露的方法中使用的特别优选的il-17抗体或其抗原结合片段是人抗体，尤其是如在wo2006/013107的实例1和2中所述的苏金单抗。苏金单抗是igg1/κ同种型的重组高亲和力，完全人单克隆抗人白细胞介素-17a(il-17a，il-17)抗体，该抗体目前正在临床试验中用于治疗免疫介导的炎性病症。苏金单抗(参见，例如，wo2006/013107和wo2007/117749)对il-17具有非常高的亲和力，即kd为约100-200pm，并且对于约0.67nm人il-17a的生物学活性的体外中和具有的ic50为约0.4nm。因此，苏金单抗以约1:1的摩尔比抑制抗原。这种高结合亲和力使得苏金单抗抗体特别适合用于治疗应用。此外，已经确定苏金单抗具有非常长的半衰期，即约4周，这允许延长给药之间的时间，这是当治疗慢性终生病症(诸如类风湿性关节炎)时的特殊性质。[0091]本文披露了用于制备上述il-17抗体及其抗原结合片段(例如苏金单抗)的方法。所披露的方法可方便地对抗体(例如，il-17抗体，例如苏金单抗)的制剂进行以降低成本。抗体的“制剂”是指具有多个抗体分子的组合物(例如，溶液)。“制剂”包括包含il-17抗体或其抗原结合片段的任何液体组合物。因而，制剂可包含例如在水或缓冲液中、在柱洗脱液中、在渗析缓冲液等中的il-17抗体或其抗原结合片段(例如，苏金单抗)。在一些实施例中，抗体的初始制剂包含在缓冲液(例如，tris，例如1mm-1mtris，ph6.0-8.0)或wfi中的il-17抗体或其抗原结合片段(例如，苏金单抗)的库。[0092]在上述方法的一些实施例中，il-17抗体或其抗原结合片段包含：i)包含seqidno:8中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域(vh)；ii)包含seqidno:10中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域(vl)；iii)包含seqidno:8中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白vh结构域以及包含seqidno:10中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白vl结构域；iv)依次包含seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域；v)依次包含seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中所列出的高变区的免疫球蛋白vl结构域；vi)依次包含seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域；vii)依次包含seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域以及依次包含seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中所列出的高变区的免疫球蛋白vl结构域；和viii)依次包含seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13中所列出的高变区的免疫球蛋白vh结构域以及依次包含seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6中所列出的高变区的免疫球蛋白vl结构域。在披露的方法中，该il-17抗体或其抗原结合片段是igg1同种型的人抗体。在披露的方法的一些实施例中，该抗体是苏金单抗。[0093]重组抗体产生[0094]重组多肽的制造传统上分为两个主要步骤：上游(细胞培养和靶多肽合成)和下游(将多肽纯化和配制成原料药或药物产品)。[0095]更具体地，单克隆抗体或其抗原结合片段的制剂可以使用任何哺乳动物细胞系由任何哺乳动物细胞重组产生，这些哺乳动物细胞系例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、小鼠骨髓瘤ns0细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、人胚肾细胞系hek-293、人视网膜细胞系per.c6(荷兰库赛尔公司(crucell,nl))、hkb11细胞克隆(源自hek293s与伯基特淋巴瘤系2b8的杂交细胞融合物)。“由哺乳动物细胞重组产生”意指已经使用重组dna技术在哺乳动物细胞中实现抗体的产生。[0096]cho细胞是目前在生物学和医学研究中使用最广泛的哺乳动物宿主，特别是用于表达人治疗性蛋白质，并且已经报道在cho细胞系统中产生70％左右的重组治疗性蛋白质。尽管它们需要昂贵的培养基并且与大肠杆菌(e.coli)和酵母表达系统相比生长相对缓慢，但是cho细胞能够像人细胞一样实现更精确的蛋白质糖基化、组装和折叠。因此，对于活性与翻译后修饰密切相关的一些蛋白质，cho细胞是优选地的生产宿主。cho细胞也有效地合成在原核生物宿主中不能主动表达的极大分子。合适的cho细胞系包括例如cho-s(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(invitrogen,carlsbad,ca,usa))、chokl(atccccl-61)、chopro3-、chodg44、chop12或dhfr-cho细胞系duk-bii(urlaubg和chasinla(1980)pnas77(7):4216-4220)、duxbi1(simonsencc和levinsonad(1983)pnas80(9):2495-2499)或cho-k1sv(瑞士巴塞尔龙沙公司(lonza,basel,switzerland))。许多cho细胞来源的产物已得到监管批准，诸如红细胞生成素(epogen；安进公司(amgen))、tnfα受体融合物(enbrel；安进公司)、抗her2抗体(herceptin；基因泰克公司(genentech))、抗tnfα抗体(humira；艾伯维公司(abbvie))和抗vegf抗体(avastin；基因泰克公司)。[0097]对于重组蛋白的工业生产，生物制造中使用的最常见的培育模式是补料分批和灌注。一种或另一种技术的使用取决于与蛋白质或宿主相关的不同因素(kadouri和spier,(1997)cytotechnology[细胞技术]24:89-98)，其中细胞附着在载体上培育或悬浮培育。最常见的方法之一是分批生物反应器，其中在接种后，细胞生长和生产直至达到由于培养基消耗引起的限制并且细胞密度开始降低。第二种非常常见的方法是分批补料，其中通过在培育期间的不同时间点添加高度浓缩的补料来防止营养物限制。因此培养持续时间比分批模式更长，并且最终生产率提高。对于培养基连续补料和连续取出收获物的连续方法，最简单的方法之一是恒化器方法，其中以恒定流速添加培养基并且以相同流速取出生物反应器内容物，没有任何细胞保留(henryo等人,(2008)biotechnol.prog.[生物技术进展],921-931)。替代性的连续方法是灌注，其中有恒定的流入和流出，但细胞现在保留在生物反应器内。生产稳定蛋白质诸如单克隆抗体的当前行业标准是在高达20kl的搅拌罐生物反应器中的补料分批方法。这些培育容器可以提供非常高的混合和传质速率，并且还为工作容积提供高灵活性，并且可以用于不同的细胞类型和操作模式(rodriguesme等人,(2010)biorechnol.prog.[生物技术进展]26:332-51)。[0098]自生物制造开始以来，培养基开发一直是细胞培养开发和优化最重要的方面，首先是为了工艺性能，但其次，也是更为重要的是出于安全原因。第一细胞培养基是使用动物来源的产品制备的(yao和asayama,(2017)reprod.med.biol.[生殖医学和生物学],16:99-117)。患者的结果是暴露于许多危险因素诸如病毒和朊病毒，并且患者的感染风险很重要，特别是对于慢性疾病而言，因为患者持续暴露于药物(grillbergerl等人,(2009)biotechnol.j.[生物技术杂志],4:186-201)。由于批次异质性导致的工艺不一致性也是减少动物或甚至植物来源的培养基组分的驱动因素，并且甚至现今，在可以增强细胞生长的化学限定培养基的优化中花费了显著的努力。[0099]化学限定培养基现在是可商购获得的，并且大多数大型生物制造公司已经开发了它们自己的配方。例如，高度浓缩的补料可能具有挑战性，因为一些化合物的物理性质会引起溶解度或稳定性的限制。cho细胞培养基和工艺参数的进一步优化，特别是针对单克隆抗体和其他重组多肽的商业制造，已经导致细胞密度和蛋白质表达的显著增加，在一些情况下滴度达到10g/l以上(lif等人,(2010)mabs[单克隆抗体],2(5):466–479；luf等人,(2013)biotechnolbioeng.[生物技术与生物工程],110(1):191–205；xingz等人,(2011)processbiochem.[过程生物化学],46(7):1432-9)。一些专注于细胞培养基的公司已经开发和优化了专门用于重组cho制造过程的基础和进料培养基组合(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司(thermofisher,waltham,ma,usa)、美国威斯康辛州沃基肖的通用电气医疗公司(gehealthcare,waukesha,wi,usa)、美国密苏里州圣路易斯的密理博西格玛公司(milliporesigma,st.louis,mo,usa)、瑞士巴塞尔龙沙公司(lonza,basel,switzerland)、美国加利福尼亚州圣塔安娜的欧文科技公司(irvinescientific,santaana,ca,usa))。[0100]这些可商购获得的培养基的配方通常是专有的；然而所有细胞培养基都需要类似的基本营养物，这些基本营养物是支持生命和细胞生长所必需的。水，连同碳源、氮源和磷酸源、某些氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素和盐全部以基于细胞的化学构成、达到所需细胞密度所需的计算量和对营养物消耗速率的了解的浓度供给，使得可以补充关键组分以维持和延长细胞活力。具体而言，氨基酸是cho细胞培养基中，特别是化学限定培养基中的关键组分，并且研究已显示细胞培养基的氨基酸组成的小变化可以改变生长曲线和滴度，并且还可以显著影响产物糖基化模式(fany等人,(2015)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程],112(3):521-35)。[0101]一般而言，氨基酸可以分类为非必需氨基酸和必需氨基酸，非必需氨基酸可以由哺乳动物细胞合成，必需氨基酸是细胞不能合成的，因此必须作为细胞培养基的组分供给。非必需氨基酸和必需氨基酸均可对cho细胞生长具有显著影响，并且已显示优化培养基配方中非必需氨基酸和必需氨基酸的相对浓度可提高重组单克隆抗体的生产率(parampallia等人,(2007)cytotechnology[细胞技术],54(1):57-68)。必需氨基酸包括组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，并且在大多数情况下，在cho细胞培养基中需要所有必需氨基酸。[0102]非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸。尽管非必需氨基酸可由培养物中的哺乳动物细胞合成，但大多数细胞培养基仍含有大部分或所有这些氨基酸以支持细胞生长和多肽产生。大多数非必需氨基酸可对细胞培养过程具有显著影响。[0103]具体而言，半胱氨酸(仅含巯基的氨基酸)是单克隆抗体产生中的特殊非必需氨基酸。半胱氨酸残基上巯基之间二硫桥的形成支持cho细胞结构蛋白和重组抗体产物的三级结构和四级结构的折叠。半胱氨酸限制对于cho细胞生长可能是致命且不可逆的，并且可能导致细胞活力下降。在ghaffari等人(2020)的研究中，在三种中国仓鼠卵巢(cho)细胞系(cho-dxb11、cho-k1sv和cho-s)中研究了限制谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸对细胞生长、代谢、抗体生产率和产物糖基化的影响。半胱氨酸限制对所有三种cho细胞系的细胞增殖和生产率都是有害的。在所研究的三种氨基酸限制中，半胱氨酸限制对培养物生长和生产率以及mab糖基化具有最大的有害影响。半胱氨酸具有低溶解度，并且可在以工业规模，特别是以高细胞浓度常用的不连续补料方案中成为限制。ghaffari等人研究了cho-dxb11细胞可耐受半胱氨酸限制的持续时间，这些细胞最初在没有半胱氨酸的biogro培养基中生长。然后在培养的第1天或第2天通过添加浓缩的半胱氨酸溶液使半胱氨酸浓度恢复到0.4mm。如果半胱氨酸水平在第1天恢复，则细胞在迟滞期额外保持一天，然后在第2天恢复生长；到第5天，这些培养物达到与对照相似的浓度。在半胱氨酸限制培养2天后恢复半胱氨酸水平证明是无效的并且细胞不生长。(ghaffarin等人,(2020)biotech.prog.[生物技术进展],36:e2946)。相反，》1mm的半胱氨酸浓度对于哺乳动物细胞可能是有毒的，这可能是由于脂质过氧化和羟基自由基的形成，这些在铜的存在下可进一步加速(ritaccofv等人(2018)biotechnol.prog.[生物技术进展],34(6):1407-26)。在哺乳动物中，半胱氨酸库受肝脏调节，而在cho细胞中没有这种调节机制，培养基中的半胱氨酸浓度需要仔细设计和控制以用于细胞培养方法(stipanukmh等人,(2006)j.nutr.[营养学杂志],136(6):1652s-59s)。[0104]用于本文所述方法的重组多肽制剂(例如，il-17抗体或其抗原结合片段的制剂)可以使用任何哺乳动物细胞系由任何哺乳动物细胞重组产生。优选地，哺乳动物细胞系是cho细胞。重组多肽，例如抗il-17抗体或其抗原结合片段，可以在连续制造系统中产生或使用补料分批系统，向培养基中添加补料来产生。如上所述，抗il-17抗体苏金单抗包含参与抗原识别和结合的游离的未配对的半胱氨酸。该游离半胱氨酸残基是在轻链互补决定区(cdr)3环中的顺式脯氨酸之后发现的，即如seqidno:6所示的l-cdr3的第八位氨基酸，该氨基酸对应于如seqidno:10所示的轻链可变区的氨基酸97，并且称为“cysl97”。为了保持完全活性，该游离半胱氨酸残基不能通过与其他半胱氨酸残基的氧化二硫键配对或通过用外源化合物氧化而进行掩蔽。此外，该游离半胱氨酸的修饰可对该抗体的活性和稳定性具有负面影响，并且可导致增加的免疫原性。因此，对苏金单抗的加工可能是困难的，因为最终产物可能含有大量无活性的抗体材料。然而，因为苏金单抗是使用哺乳动物细胞，尤其是cho细胞制造的，所以确实会发生cysl97的基于细胞的修饰，这可影响产率和抗体活性。[0105]如以上讨论的，术语“cys等同物”是指培养容器中的培养基中细胞可用的半胱氨酸和胱氨酸，无论源自基础培养基和/或补料培养基。令人惊讶的是，已经发现降低苏金单抗细胞培养生长培养基中cys等同物的量引起游离半胱氨酸cysl97的修饰减少。这又引起生产过程产生的活性抗体增加，即产品质量增加。与已建立的研究(例如ghaffari等人，同上)相反，生产培养基和培养基补料中半胱氨酸的减少对苏金单抗的产率没有负面影响。[0106]重组多肽的纯化[0107]为了获得根据如本文所述的细胞培养方法产生的重组多肽的基本上均质的制剂，纯化步骤是必需的。作为第一步，通常将培养基或裂解液离心以去除颗粒细胞碎片。可以通过羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、渗析或亲和色谱法方便地纯化所产生的多肽。还可以使用用于蛋白纯化的其他技术，诸如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅上色谱、肝素琼脂糖上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上色谱、色谱聚焦、sds-page和硫酸铵沉淀。[0108]药物组合物、施用和试剂盒[0109]本文提供了药物组合物，这些药物组合物包含如本文所述的重组多肽与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的组合。为了制备包括本披露内容的分子的药物或无菌组合物，将所述分子与药学上可接受的载体或赋形剂混合。短语“药学上可接受的”意指由美国联邦政府或州政府的监管机构批准或者列于美国药典(u.s.pharmacopeia)或其他普遍认可的药典中用于动物并且更特别地用于人。术语“药物组合物”是指至少一种活性成分(例如，本披露的抗体或片段)和至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂的混合物。“药物”是指用于医学治疗的物质。[0110]治疗剂和诊断剂的药物组合物可以通过与生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水性溶液、洗剂或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，hardman等人.,(2001)goodmanandgilman′sthepharmacologicalbasisoftherapeutics[goodman和gilman的治疗剂的药理学基础],mcgraw-hill[麦格劳-希尔集团],纽约州纽约市；gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药学科学与实践],lippincott,williams,andwilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],纽约州纽约市；avis等人(编辑)(1993)pharmaceuticaldosageforms:generalmedications[药物剂型：肠胃外药物],marceldekker[马塞尔德克尔公司],纽约；lieberman等人(编辑)(1990)pharmaceuticaldosageforms:tablets[药物剂型：片剂],marceldekker[马塞尔德克尔公司],纽约；lieberman等人(编辑)(1990)pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems[药物剂型：分散系统],marceldekker[马塞尔德克尔公司],纽约；weiner和kotkoskie(2000)excipienttoxicityandsafety[赋形剂毒性和安全性],marceldekker,inc.[马塞尔德克尔出版公司],纽约州纽约市)。[0111]为治疗剂选择施用方案取决于若干种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性、和生物基质中的靶细胞的可及性。在某些实施例中，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的生物制品的量部分地取决于特定的实体和正在治疗的病症的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子和小分子的指南是可获得的(参见例如，wawrzynczak(1996)antibodytherapy[抗体疗法],biosscientificpub.ltd[bios科学出版社有限公司],牛津郡,英国；kresina(编),(1991)monoclonalantibodies,cytokinesandarthritis[单克隆抗体、细胞因子和关节炎],marceldekker[马塞尔德克尔公司],纽约州纽约市；bach(编辑),(1993)monoclonalantibodiesandpeptidetherapyinautoimmunediseases[自身免疫疾病中的单克隆抗体和肽疗法],marceldekker[马塞尔德克尔公司],纽约州纽约市；baert等人,(2003)newengl.j.med.[新英格兰医学杂志]348:601-608；milgrom等人,(1999)newengl.j.med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973；slamon等人(2001)newengl.j.med.[新英格兰医学杂志]344:783-792；beniaminovitz等人(2000)newengl.j.med.[新英格兰医学杂志]342:613-619；ghosh等人,(2003)newengl.j.med.[新英格兰医学杂志]348:24-32；lipsky等人,(2000)newengl.j.med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602)。[0112]本披露还涵盖用于治疗患有由il-17介导的病理性障碍，例如自身免疫疾病或者炎性障碍或病症的患者的试剂盒。此类试剂盒包含治疗有效量的根据本文所述的方法产生的抗体和包装小册子，其中包装小册子指示针对患者的抗il-17抗体的推荐剂量方案。优选地，抗体是抗il-17抗体，诸如苏金单抗。另外，此类试剂盒可以包含用于施用抗体的工具(例如，自动注射器、注射器和小瓶、预填充注射器、预填充笔)以及使用说明书。试剂盒还可包含用于施用抗il-17抗体以治疗患者的说明书。此类说明书可以提供用于所封闭的抗体的剂量、施用途径、方案和总治疗持续时间。短语“用于施用的工具”用于指示用于向患者全身施用药物的任何可用工具，该工具包括但不限于预填充注射筒、小瓶和注射筒、注射笔、自动注射器、iv滴注器和袋、输注泵、贴片、输注袋和针等。使用此类物品，患者可以自我施用药物(即，在没有医生的帮助下施用药物)或者医生可以施用药物。[0113]本披露的一个或多个实施例的细节陈述于上文所附的说明书中。虽然与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。根据说明书并且根据权利要求书，本披露的其他特征、目标和优点将是清楚的。在说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另外明确说明，否则单数形式包括复数指代物。除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。在本说明书中引证的所有专利以及出版物均通过引用并入。提出以下实例以便更充分地说明本披露的优选实施例。这些实例决不应被解释为限制如由所附权利要求书限定的所披露的患者问题的范围。[0114]实例[0115]以下实验旨在进一步说明本技术中所定义的发明。[0116]实例1[0117]设计一组实验来了解苏金单抗的cys97氧化是否在细胞外发生。[0118]用具有标准量的半胱氨酸/胱氨酸的细胞培养基渗滤纯化的苏金单抗原料药(amiconultracel管)。然后，将溶液在培养基中稀释到1.5g/l的浓度，以与生物反应器滴度保持一致。此后，将溶液在37℃下温育。最后，在24小时和48小时后取样进行胱胺-cex以测定游离cys97百分比。[0119]表2显示在培养基温育后游离cys97百分比显著降低，表明在苏金单抗分泌后cys97可在含有半胱氨酸/胱氨酸的细胞外环境中被氧化。这种理解产生了cys97氧化可能由于细胞培养基中存在半胱氨酸/胱氨酸而发生的假说。[0120]表2.用细胞培养基进行苏金单抗原料药温育[0121][0122]结果证实细胞培养基中的半胱氨酸/胱氨酸使cys97氧化。[0123]将苏金单抗原料药与含有不同量半胱氨酸/胱氨酸的培养基一起温育。图1显示培养基中半胱氨酸/胱氨酸的量较低会降低cys97的氧化量。该培养基温育研究表明半胱氨酸/胱氨酸确实会氧化苏金单抗上的cys97。[0124]实例2[0125]先前的观察已经显示，在培养基诸如灌注培养基中在37℃下进行苏金单抗温育导致抗体活性随时间降低。为了确定培养基中半胱氨酸/胱氨酸(即cys等同物)的水平是否可以减弱活性的下降，将苏金单抗洗脱物在基于标准灌注培养基的不同培养基变型中温育以研究培养基组分的影响。[0126]为了最小化将样品添加到培养基中时的稀释效应，将起始溶液在灌注培养基中渗滤。将获得的溶液添加到灌注培养基中，达到50ml的最终体积和约1.5g/l的最终蛋白质浓度以模拟典型抗体生物反应器滴度。将溶液在37℃(标准生物反应器温度)下温育两天。24小时和48小时后，取25ml样品并捕获抗体。通过胱胺-cex分析所有样品的活性。在标准灌注培养基中，半胱氨酸以一水合半胱氨酸盐酸盐的形式供给，胱氨酸由包含酪氨酸和胱氨酸的储备溶液供给。[0127]将苏金单抗在三种培养基变体中温育以研究培养基组成的影响：[0128]表3.[0129][0130][0131]如图2所示，当在基线培养基中温育时，苏金单抗的活性在2天内从98％左右下降至25％。通过将cys等同物的量减少75％，活性下降减少，下降至60％。在没有任何cys等同物的情况下，活性下降进一步减少，下降至仅83％。另外，去除微量元素没有显示出显著的改进，因为活性从96％下降至84％。[0132]实例3[0133]为了确定补料分批反应器方法中半胱氨酸/胱氨酸(即cys等同物)变化的影响，基于cho细胞表达苏金单抗的标准原理设计实验。基础培养基和补料培养基两者中半胱氨酸的浓度都不同。从酪氨酸/胱氨酸储备溶液中添加的胱氨酸的浓度没有产生变化。下表4中给出了测试的培养基变型，其中补料分批细胞培养运行10天。即使从基础培养基或补料培养基中减少或去除了半胱氨酸，培养基中仍然存在来自酪氨酸/胱氨酸储备溶液的胱氨酸。因此，表4中也给出了基线和培养基变体的总cys等同物。[0134]表4.[0135][0136][0137]如图3所示，改变基础培养基和培养基补料中cys等同物的含量产生对于所有变体(包括基线)相似的细胞生长和苏金单抗表达滴度(mg/ml)。用培养基变体仅检测到最终抗体滴度(mg/ml)的微小变化(变体1大约2.4mg/ml至变体3大约2.6mg/ml)，如图4所示。[0138]图5是示出了使用不同培养基变体表达的苏金单抗的活性(％)的图。在cys等同物减少的细胞培养基中表达的苏金单抗的活性高于80％。相反，在基线细胞培养基中表达的苏金单抗的活性为60％左右。[0139]如该实验所证明的，从基础培养基和/或补料培养基中减少和/或去除cys等同物对补料分批方法中苏金单抗的产率没有影响，此外产生具有更高活性的抗体产物。因此，这些结果表明在细胞培养基中以降低浓度的cys等同物表达的苏金单抗减轻了cysl97的不期望的基于细胞的修饰，从而改善产品质量。[0140]实例4[0141]采用1000l规模的高细胞密度灌注分批(hdpb)培养，每天用大约一个反应器体积的灌注培养基的集成化原料药制造方法适用于从cho细胞产生苏金单抗。hdpb生产过程的峰值活细胞密度(vcd)接近1600万个细胞/ml并且过程持续时间为大约19天。与补料分批生产培养基相比，最低限度地调节hdpb生产培养基(包括锰、普朗尼克f68、葡萄糖、谷氨酰胺、半胱氨酸、nacl在内的组分的浓度)以确保生长稳健性和期望的产品质量。未引入新的组分。hdpb生物反应器体积生产率为大约1.2g/l/天(或22.8g/l积聚滴度)。[0142]在对候选培养基配制品评价期间，正如通过胱胺cex测量的，确定降低半胱氨酸浓度增加了苏金单抗的生物活性。如表5和表6以及图6所示，在实验室规模的实验收获库中，通过将灌注培养基中的半胱氨酸浓度降低50％，生物活性增加大约6％-8％。除了在上游过程中确定的效应之外，由于对还原步骤的直接影响，也从下游角度进行了评价，证实了所提出的半胱氨酸效应。[0143]表5.灌注培养基[0144][0145]表6.灌注结果[0146][0147]与其他条件相比，半胱氨酸浓度越低导致酸性值越低，这也被认为是有益的。[0148]表7.序列表[0149][0150]当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种用于在补料分批细胞培养物中产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a.在包含基础培养基和一种或多种补料培养基的细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中所述基础培养基包含浓度为约0.3g/l的cys等同物，并且其中所述补料培养基包含浓度小于约0.8g/l的cys等同物，并且其中所述细胞培养基中累积cys等同物的浓度小于约0.4g/l；b.表达所述重组多肽以及c.从所述培养基中回收所述多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且所述补料培养基包含浓度为约0.66g/l的半胱氨酸。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且所述进料培养基包含浓度为约0.33g/l的半胱氨酸。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基不包含添加的半胱氨酸，并且所述补料培养基不包含半胱氨酸。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组多肽是抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体是苏金单抗。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由cho细胞、hek细胞和sp2/0细胞组成的组。8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，所述方法包括选择性还原的下游加工步骤，其中所述抗体与至少一种还原剂在系统中温育以形成还原混合物。9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：d.纯化所述抗体；e.配制所述抗体用于施用f.将所述抗体与小册子一起包装。10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述重组多肽包含至少一个游离半胱氨酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组多肽包含至少一个二硫键和至少一个游离半胱氨酸。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组多肽是抗体，诸如苏金单抗。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述培养基回收的重组多肽群体与从对照培养基回收的重组多肽群体相比包含高至少约10％水平的还原的游离半胱氨酸，所述对照培养基包含具有浓度大于约0.4g/l的cys等同物的对照基础培养基和/或含有浓度大于约0.9g/l的cys等同物的对照补料培养基，和/或其中所述对照细胞培养物中累积cys等同物的浓度大于约0.4g/l。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括与对照方法相比以mg重组多肽/l培养基计，产生更高产率的重组多肽，所述对照方法包括在对照细胞培养基中培养哺乳动物细胞，所述对照细胞培养基包含对照基础培养基和一种或多种对照补料培养基，其中所述对照基础培养基包含浓度大于约0.4g/l的cys等同物，和/或其中所述对照补料培养基包含浓度大于约0.9g/l的cys等同物，和/或其中所述对照细胞培养物中累积cys等同物的浓度大于约0.4g/l。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述方法包括正如从用过的培养基中测定的，产生具有至少61％还原的游离半胱氨酸的重组多肽群体。16.一种用于通过哺乳动物细胞培养物产生重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a.在包含细胞培养基的培养物中培养哺乳动物细胞(例如，选自由cho细胞、hek细胞和sp2/0细胞组成的组)，其中所述细胞培养基包含浓度为约0.3g/l的cys等同物；b.通过灌注用新鲜细胞培养基交换所述培养物中的所述细胞培养基的一部分，其中所述新鲜细胞培养基包含浓度为约0.3g/l的cys等同物，和/或其中添加到所述培养物中的累积cys等同物的浓度小于约7g/l/天，或小于约0.4g/l/天；c.表达所述重组多肽以及d.从所述培养物中回收所述多肽。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述新鲜培养基不包含添加的半胱氨酸。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括培养的每天通过灌注用新鲜细胞培养基交换所述细胞培养基的至少50％。19.根据权利要求16、17或18所述的方法，其中所述重组多肽包含至少一个游离半胱氨酸。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述重组多肽包含至少一个游离半胱氨酸和至少一个二硫键。21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述重组多肽是抗体，诸如苏金单抗。22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中从所述培养基回收的重组多肽群体与从对照培养基回收的重组多肽群体相比包含高至少约10％水平的还原的游离半胱氨酸，所述对照培养基包含浓度大于约0.4g/l的cys等同物，和/或其中添加到所述对照细胞培养物中的累积cys等同物的浓度大于约7g/l/天，和/或大于约0.4g/l/天。23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中所述方法包括与对照方法相比以mg重组多肽/l培养基计，产生更高产率的重组多肽，所述对照方法包括在对照细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中所述对照细胞培养基包含浓度大于约0.4g/l的cys等同物，和/或其中所述对照细胞培养物中的累积cys等同物的浓度大于约7g/l/天，和/或大于约0.4g/l/天。24.根据权利要求1至5、7-22或23中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用接头、标记或药物共价修饰所述还原的游离半胱氨酸。

技术总结
本披露涉及用于在细胞培养(例如，苏金单抗抗体的制备)期间降低哺乳动物细胞已经重组产生的重组多肽诸如抗IL-17抗体中的半胱氨酸残基的氧化水平的方法。还提供了通过此类方法产生的重组多肽诸如抗IL-17抗体或其抗原结合片段的纯化制剂，例如苏金单抗的纯化制剂。还提供了通过此类方法产生的重组多肽的纯化制剂，其中所述制剂中的活性重组多肽水平较高。其中所述制剂中的活性重组多肽水平较高。其中所述制剂中的活性重组多肽水平较高。


技术研发人员：N
受保护的技术使用者：诺华股份有限公司
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2023/8/24