用于细胞培养的结构化整体固定床、相关生物反应器以及制造方法与流程

用于细胞培养的结构化整体固定床、相关生物反应器以及制造方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2021年2月24日提交的序列号为第63/153,082号的美国专利的优先权，其公开内容通过引用并入本文。本技术进一步要求于2020年12月2日提交的序列号为第pct/ep2020/084317号的国际专利申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
3.本技术与于2019年12月2日提交的序列号为第62/942,345号的美国临时专利申请和于2020年4月3日提交的序列号为第63/004,706号的美国临时专利申请相关，其公开内容通过引入并入本文。本技术还通过引用并入了以下申请：序列号为第62/758,152号、第62/733,375号和第62/608,261号的美国临时专利申请；公布号为第2018/0282678号的美国专利申请；国际专利申请pct/ep2018/076354；美国临时专利申请62/711,070；以及美国临时专利申请62/725,545。
技术领域
4.本文件总体上涉及细胞培养领域，并且更特别地涉及一种用于细胞培养的结构化整体固定床、相关生物反应器以及制造方法。


背景技术：

5.生物反应器有时用于在细胞培养床内生长(或培养)某些细胞，细胞培养床可以固定在生物反应器内的适当位置。这样的固定床可以是非结构化的(例如，由堆积在一起的松散颗粒形成)或者可以以某种方式结构化。此类结构化固定床通常由小心地放置在彼此顶部或旁边的离散材料层形成。在任一种情况下，这些非结构化固定床的制造成本和复杂性都很高，特别是在需要大量人工参与的情况下。具体而言，纤维或层必须以特定方式手工组装，以获得适合给定工艺条件的细胞培养床。
6.除非在床的制造期间特别小心，否则经常会缺乏流体流动和细胞生长的均匀性。具体而言，由于由密度变化引起的床内的流动限制，细胞生存力和生长也可能受到损害，密度变化可能是所用材料的不可预测的变化造成的。此类变化会在流体不容易流动的一些区域产生高压力梯度。
7.同样，有时需要改变细胞培养床内的流体流动。为了实现这一点，已经提出了使用不同类型的材料或特殊几何形状的复杂布置，同样涉及导致成本和复杂性增加的制造技术。在生长的细胞是待收获目标的情况下，使用现有的固定床布置，最大化回收也可能是具有挑战性的，现有的固定床布置通常是致密的，并且不是很适合或优化用于实现活细胞分离和最大化回收。此外，由于搅拌、流体压力或施加到生物反应器的其他力，可能产生松散的纤维和摩擦产生的颗粒，并从这些传统的固定床中释放出来。例如，在培养和收获期间，当相邻的材料层相互摩擦时，颗粒可能会产生并从床中释放出来。
8.因此，需要一种克服上述问题以及其他可能尚未发现的问题的结构化固定床。具体而言，希望提供一种用于生物反应器的结构化固定床，其具有不依赖于手工组装来产生
的可定制结构，因此可以降低成本。可定制的性质将允许以高度可预测且可重复的方式在不同区域产生具有不同流动特性的固定床。结构化固定床可以消除会导致污染收获物颗粒的层间摩擦。结构化固定床也可以同时形成为生物反应器的一部分，因此不需要单独的制作步骤，并且可以设计为可压缩的结构，以提高流体回收和细胞收获。


技术实现要素：

9.一方面，本公开涉及一种结构化固定床，该结构化固定床包括三维(3d)整料，比如由多个互连单元或物体形成的支架或网格形式。此类物体具有用于细胞粘附的表面。固定床本质上可以是一次性使用的，以避免根据生物加工标准进行清洗所涉及的成本和复杂性。这样的整体结构化固定床将防止颗粒的产生(包含pet纤维的固定床可以释放一些游离纤维)，这允许用于最终可以过滤产品的过程中(例如，干细胞生产大型病毒的应用否则不能无菌过滤)。
10.在另一方面，本公开涉及一种设备，其包括细胞培养器皿(例如，生物反应器)和整体结构化固定床。在另一实施例中，结构化固定床包括用于细胞培养系统中高密度贴壁细胞生长的大规模细胞基质。
11.在一个实施例中，固定床使用增材制造法来制造，比如3-d印刷技术。在一些实施例中，使用选择性激光烧结(sls)3d打印来制造固定床，sls 3d打印采用高功率激光将粉末材料熔合在一起成为期望的3d形状。然而，也可以使用其他技术，比如例如立体平版印刷术或“sla”、熔融沉积成型(fdm)、数字光处理(dlp)、多喷头喷射熔融(mjf)、聚合喷射(polyjet)、直接金属激光烧结(dmls)、或电子束熔融(ebm)。固定床可以包括一个或多个物体，这些物体被熔融或烧结在一起以形成整体基质，该整体基质可以包括一个或多个结构。使用时，基质可以提供一个或多个线性或非线性(例如，曲折的)路径供流体和细胞流过。
12.在一些实施例中，物体可以包括一种或多种形状。一个或多个物体可以包括但不限于如下形状，比如球形、卵形、椭圆形、立方体、金字塔形、六边形、八边形、十面体、正方形、矩形或上述形状的任意组合，并且可以由简单形状的重复产生。这些物体可以是珠子或其他小的简单形状(可以是或不是球形)，并且可以结合在一起，比如3d打印工艺的结果。虽然可以使用其他形状来制造固定床结构，但是可以进行物体的预先定位以获得均匀的结构，因此，在这种布置中，由于完全不需要在结合之前进行定位，所以期望简单的球体或球，但是可以使用任何其他形状。
13.可以将物体粘结、印刷或融合在一起，以形成固定床结构或基质。粘结或熔合的方法可以包括局部焊接、sls或其他3d打印方法，但不限于此类技术。固定床的表面积等于所有物体的表面积，并且粘壁细胞将以二维模型或方式粘附到此类物体。
14.在一些实施例中，物体为固体的，且由聚合物材料制成。替代地，物体可以是中空的，其中，内部具有空腔。物体的表面可以是连续的，或者可以是不连续的，以提供通向物体内部的内空腔的通路(多孔性)。不连续部分可以形成开口，这些开口提供通向空腔的通路，并且这些开口提供细胞培养基从中流过的路径。开口可以小于平均细胞的大小，从而防止细胞进入空腔并被截留在其中，但也可以更大以使细胞在空腔中生长繁殖。替代地，空腔可以更大，以允许细胞进入其中并在其中生长。在任何情况下，开口可以允许细胞培养基从中流过。穿过物体的流体流动路径可以是规则的或不规则的(无定型的)。物体可以如血液循
环的静脉和动脉那样，具有几种大小的空腔/孔隙。这个构思是模仿血液循环的设计，其中，细胞可以被捕获在空腔和由大通道冲洗的介质内部，以使细胞容易出来，它们也可以粘附到物体表面，而不会被捕获在空腔内。
15.在一些实施例中，可以将固定床集成到细胞培养器皿或生物反应器中。在一些实施例中，固定床的结构是柔性的和/或可压缩的。在一些实施例中，该结构包括集成在细胞培养器皿或生物反应器中的一个或多个整体结构。在一些实施例中，基质和生物反应器都使用相同的工艺(例如sls)制造，使得容器和固定床同时形成。这将避免基质与容器壁之间的泄漏和旁路，提供更简单的制造工艺，并确保在基质与容器之间产生好的耐受力。这也允许增加容器壁的厚度，使得加热发生在器皿的底部处。
16.形成固定床的物体可以由在细胞培养应用中相容的聚合物制成。合适的材料包括但不限于聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯、聚环氧丙烷及其组合，或者可以是用于增材制造技术的任何类型的生物相容性聚合物。金属或陶瓷也可以用于形成生物反应器、整体结构化固定床或两者。
17.在一些实施例中，可以对固定床、物体或其一部分进行改性，以提供期望的细胞粘附性质(即，亲水化或结合配体)，包括用各种类型的等离子体、工艺气体和/或化学品、和/或工业中已知的移植法进行改性的处理工艺。在优选实施例中，片材、整体结构化化固定床或基质或其一部分的表面被改性或处理。
18.在一些实施例中，物体或固定床或其一部分可以涂有一层或多层可以增强或提供细胞粘附特性的生物相容性水凝胶薄层，包括(例如)胶原或基质凝胶。在另一个实施例中，固定床的表面积与体积之比可以在每升细胞培养基1至10平方米之间。在另一个实施例中，固定床使得细胞密度大于0.1
×
106个细胞/平方厘米或10
×
106个细胞/毫升的固定床。
19.在一些实施例中，形成固定床以在使用时提供流体流动和细胞生长的最大均匀性。在一些实施例中，将固定床设计成允许有效且均匀的流体和细胞流过，但也可以将固定床设计成引导流体流动并控制流体动力学性质，比如压力、速度、温度或湍流。此外，固定床的结构可以适应多定向的流体流动。在一些实施例中，固定床包括沿垂直或水平方向堆叠或折叠的片材。在一些实施例中，流体竖直地流过片材，并且在一些实施例中，流体水平地流动。流体通过片材的流动可能是曲折的。这些片材可以是任何形状的。
20.在一些实施例中，整体结构化固定床包括适于用于插入在生物反应器中的形状和大小。在一些实施例中，整料是环形的。组成固定床的物体的大小可以相同。这导致固定床具有均匀性和从输入到输出的相同压降。然而，也可以使用不规则或随机大小或间隔的物体，包括例如在床的部分中产生不同的压实、孔隙度或密度的区域或区，以便产生流动梯度。本质上，可定制的固定床的制造可以是这样的，即存在用于供给细胞的线性流体流动的区域或区，以及用于捕获细胞(贴壁细胞以及悬浮细胞)用于生长的致密结构的区域。这样的床的特征可以针对不同的细胞类型进行设置，包括最小孔隙率、表面积、结构性区、线速度要求、压力限制和需求等。
21.在一些实施例中，制造、改性或改造固定床，以包括增加流体流动和/或扩散的路径。这些路径可以在固定床的制造(例如3d打印工艺)期间形成，或者可以在固定床制造之后形成，比如通过使用激光或其他钻孔技术之后形成。在一些实施例中，路径降低了固定床两侧的压降。例如，基质可以一个堆叠在另一个之上。在这种情况下，压降可能会增加，因此
需要降低压降以保持均匀性。
22.在一些实施例中，固定床路径用于增加主流体流动方向上的流体流动以及流体和细胞的径向扩散。此类路径可以遵循对流模型，具有不规则的(例如曲折的或之字形的)路径或其他(更线性的)定向路径，具有在主流体流动方向上的分量以及具有与垂直或径向方向成一定角度的一些方向的其他分量。在一些实施例中，固定床包括一个或多个竖直或“烟囱状”路径，其增加扩散并降低固定床两侧的压降。在一些实施例中，路径的直径在1到2毫米之间，并且路径之间的距离可以为1至4毫米。
23.在一些实施例中，固定床的某些部分位于朝向一端部，盖子可以位于该端部处以关闭器皿空腔，这些部分可以包括可以用作这样的固定床的样品的可移除的固定床部分。可移除部分可以形成固定床的一部分(例如，圆柱形“塞子”)，该部分附接到保持部分，以允许这样的塞子通过盖子中的端口被移除。
24.在一些实施例中，固定床可以按中间角度布置成多块，或甚至相对于流体流动随机布置。优选地，固定床被定向为提供基本上各向同性的流动行为。本公开的固定床允许其在各种应用和生物反应器或容器设计中使用，同时在整个生物反应器器皿中实现更好且更均匀的渗透性。
25.在一些实施例中，固定床集成在生物反应器中。在一些实施例中，固定床被插入到生物反应器中。在一些实施例中，固定床为整料。在一些实施例中，一个或多个整体床被插入到生物反应器中。在一些实施例中，整体床的高度范围为1至5厘米，并且外径范围为2至15厘米。在一些实施例中，整体床被集成到包括细胞的生物反应器中，并且整体床包括粘附于其上的细胞。
26.根据本公开的另一方面，可以提供由控制器或带微处理器的计算机系统控制的工艺，借此用户通过输入(鼠标、键盘等)提供构建生物反应器、结构化整体固定床或两者的某些要求或目标。例如，要求或目标可以是期望的大小、体积或形状、期望的每单位体积的细胞密度、期望的流体流速、期望的细胞系、或其他工艺条件中的一者或多者。然后，系统确定生物反应器的最佳构造，以实现用户限定的目标，并将信息传输到3d打印机，以根据这些目标自动制作生物反应器或固定床。替代地，可以向用户呈现应用程序，使得他或她可以在最终确定并将其传输到打印机之前，检查所提出的固定床设计并根据需要调整参数。
27.形成细胞培养床的固定床的三维结构是有利的，因为它可以为培养贴壁细胞提供大的表面积。此外，定制固定床的能力提供了一致的、可重复的且可预测的细胞培养，并允许产生期望的流动模式(无论是规则的还是可变的)。这包括，例如，提供不同的压实或密度区域，以潜在地在床内产生期望的流动模式，从而优化细胞生长和生存能力方面的性能。
附图说明
28.图1为本公开的某些方面可以对其具有适用性的示例性生物反应器的立体图；
29.图2为结构化整体固定床的立体图；
30.图2a为图2的横截面视图；
31.图2b为结构化整体固定床的替代实施例的横截面视图；
32.图3为结构化整体固定床的另一个实施例的立体图；
33.图3a为图3的横截面视图；
34.图4为结构化整体固定床的另一个实施例的立体图；
35.图4a为图4的横截面视图；
36.图5为结构化整体固定床的另一个实施例的立体图；
37.图5a为图5的横截面视图；
38.图6、图7和图8为具有差异压实的结构化整体固定床的示意性视图；
39.图9为结构化整体固定床的替代实施例的横截面视图；
40.图10为结构化整体固定床的另一个替代实施例的横截面视图；
41.图11和图12例示了向生物反应器中的柔性或可压缩结构化整体固定床提供压缩的一种方式；
42.图13、图14、图15、图16、图17和图18例示了生物反应器的各种替代形式；以及
43.图19和图20示出了根据本公开的用于形成定制固定床、生物反应器或两者的技术的一个示例的系统和流程图。
具体实施方式
44.现在参考图1，其根据本公开的一个方面，例示了用于培养细胞的固定床生物反应器100的一个实施例。在所例示示例中，生物反应器100包括部分地由外部外壳或壳体112形成的器皿，外部外壳或壳体112形成或包括内部隔室。盖114可以放置在壳体112的顶部上以覆盖或密封内部隔室，并且可以固定在适当位置或可以是可移除的。盖114可以包括各种端口或开口g，这些端口或开口g具有可移除的封闭物或盖子c，以允许选择性地引入或移除材料、流体、气体、探针、传感器、采样器等，并且还可以包括一个或多个传感器。
45.在生物反应器壳体112的内部隔室内,可以提供几个隔室或腔室,用于在整个生物反应器100中传输流体、气体或两者的流动。在一些实施例中，腔室可以包括位于或靠近生物反应器100基底的第一腔室116。在一些实施例中，第一腔室116可以任选地包括用于在生物反应器100内引起液体流动的搅拌器。搅拌器可以是可旋转的非接触式磁性叶轮118的形式，从而在生物反应器中形成离心泵。搅拌器也可以是这样的叶轮的形式，即其具有与底座的机械联接(例如，通过轴承)，具有接触或非接触驱动，或者甚至可能是形成液体循环系统的一部分的外部泵，或者用于在生物反应器内引起液体循环的任何其他装置，或者可能是布置在壳体112内部或外部的泵。由于搅拌器(叶轮118)提供的搅拌作用，比如液体的流体可以沿着生物反应器100的外部或周边部分(或者以其他方式通过固定床)向上流动(如图2中箭头a所示)进入腔室120中。
46.离开腔室120的液体被输送到腔室123中形成的“顶部空间”，腔室123位于床122的一侧(上侧)与盖114之间，液体(介质)在此暴露于气体(如氧气)。在一些实施例中，流体然后可以径向向内流动到中央腔室126以返回到床122的下部部分。在一些实施例中，这个中央腔室126本质上可以是柱状的，并且可以由无孔导管或管128形成，或者由穿过结构化床122的中心开口或路径形成。
47.腔室126将液体返回到第一腔室116(返回箭头r)，以通过生物反应器100进行再循环，从而形成连续循环(在这个方案中为“从底部到顶部”)。在一些实施例中，还可以提供传感器，例如温度探头或传感器t，用于感测在腔室126中流动或驻留的流体的温度。在一些实施例中，额外的传感器(例如，ph、氧气、溶解氧、温度、细胞密度等)也可以设置在液体进入
(或重新进入)腔室116之前的位置，包括例如固定床122的出口位置或顶部处。
48.图2和图2a例示了本公开的生物反应器中的结构化固定床122的一个实施例。在一个实施例中，结构化固定床122包括由多个相互连接的单元或物体124a形成的支架或网格形式的三维(3d)整体基质124，该整体基质124具有用于细胞粘附的表面(可能包括结合配体)。优选地，基质包括在使用时用于流体和细胞从中流过的曲折路径。在一些实施例中，基质124可以是3d(三维)阵列、格子、支架或海绵的形式的。基质124优选在本质上是一次性使用的，以避免根据生物加工标准进行清洁所涉及的成本和复杂性。
49.在一个实施例中，基质124使用3-d印刷技术制造。在一些实施例中，使用选择性激光烧结(sls)3d打印来制造基质124，但是不限于使用这种方法。sls使用高能激光将粉末材料融合成期望的3d形状。
50.如图3和图3a所示，固定床122可以包括由一个或多个物体124a组成的基质124形式，一个或多个物体124a直接烧结在一起形成整料。物体124a可以包括一种或多种形状，其为基质提供最低的表面体积比。一个或多个物体124a可以是珠子或球体的形式的，但是可以是卵形、椭圆形、立方体六边形、八边形、十面形、正方形、矩形和/或前述形状的组合。虽然可以使用其他形状来制造固定床122，但是预先放置物体可能是实现同质结构所希望的。因此，在这种情况下，简单的球体或球可能是优选的，因为完全不需要在结合之前将物体保持在不稳定的位置。
51.直接(图3)或通过形成间隔物的连接件124b将物体124a结合或融合在一起，以形成固定床结构或基质。然而，固定床122也可以包括由一个或多个物体124a组成的整体片材，或者直接相互连接或者通过连接器124b相互连接。在任一情况下，所使用的结构可以形成曲折的路径，流体可以通过该路径行进通过基质124，如在下面的描述中进一步概述的。粘结或熔合物体124a的方法可以包括局部焊接、sls或其他3d打印方法。固定床122的表面积等于所有物体124a的表面积，并且粘壁细胞将以二维模型或方式粘附到此类物体。
52.在一些实施例中，物体124a为固体且由聚合物材料制成。替代地，物体可以是中空的，其中，内部具有空腔。物体124a的表面可以是连续的，但也可以是不连续的，从而提供通向物体内部的内空腔的通路(多孔性)。如果存在的话，不连续部分可以形成开口，这些开口提供通向空腔的通路，并且可能提供用于细胞培养基流过的路径。开口可以小于平均细胞的大小，从而防止细胞进入空腔并卡在里面。然而，开口可以允许细胞培养基从中流过。穿过物体的流体流动路径可以是均匀的或规则的，或不均匀的/不规则的。
53.整体基质124可采用多种形状。如图2和图3所示，整体基质可以为长方体结构。在生物反应器100包括不同形状(例如，圆形或环形腔室，比如腔室120，比如在图1的生物反应器100中)的情况下，多个这样的结构可以定位在腔室中，并且可以被成形为实质上占据空间(比如通过为楔形形状)。替代地，如图4和图4a所示，整体基质124可以包括环形结构。
54.基质124可以是规则的，如图3和图4所示，也可以是不规则的。例如，物体124a可以在沿着基质124或围绕基质124的不同位置处改变大小、形状或间距。这可以允许基质124以期望的整体方式形成，但是根据特定细胞培养操作的需要，在流体流动或细胞粘附方面提供可变的性质。如图5和图5a所示，珠球或其他小形状形式的物体也可以被定向成使得相邻层上的物体接触多个(例如，至少两个、三个或四个、五个、六个或七个，在所示的示例中，八个)其他物体或珠子。
55.基质路径用于增加主流体流动方向上的流体流动以及流体和细胞的径向扩散。此类路径可以具有不规则的(例如之字形)或其他方向的路径，其具有在主流体流动方向上的分量以及具有与垂直或径向方向成一定角度的一些方向的其他分量。如图2和图2b所示，基质124可以包括一个或多个“烟囱状”路径p，其增加扩散并降低基质两侧的压降。在一些实施例中，路径p的直径在1至2毫米之间，并且路径之间的距离可以为1至4毫米。路径p可以是竖直的，如图所示，或者可以是水平的。当存在多个堆叠的基质时，路径可以偏移以增强流体流动的曲折性质。
56.路径p或烟囱是任选的，并旨在提供具有一些径向流的流体介质的优先流动，以分配细胞和介质，从而为此类细胞提供营养。对此类路径的需求可能取决于要求通道的更大长度/高度的基质的尺寸。
57.在一些实施例中，基质124和生物反应器100(整体上或部分地)均使用相同的3d打印机或3d打印工艺制造。以这样的方式形成整体基质124和生物反应器100避免了泄漏和对密封的需要，提供了更简单的制造工艺，并确保基质与生物反应器100之间存在好的耐受力。基质124和生物反应器100的区段也可以被3d打印，比如例如水平切片，并且堆叠或组装在一起。
58.在一些实施例中，基质124的某些部分，比如位于朝向盖114一端的部分，可以包括可以用作这样的基质的样品的可移除的基质部分。这些部分可以被成形为形成基质124的一部分(例如，圆柱形“塞子”)，该部分附接到保持部分，以允许这样的塞子通过盖子中的端口被移除。
59.在一些实施例中，基质124可以按中间角度布置成多块，或甚至相对于流体流动随机布置。基质124可以被定向为提供基本上各向同性的流动行为，这意味着流动相对于方向是不变的。所公开的基质124可以用于各种应用和生物反应器或容器设计中，同时使整个生物反应器器皿具有更好且更均匀的渗透性。
60.在一些实施例中，基质124集成在生物反应器100中。在一些实施例中，基质124被插入在生物反应器100中。在一些实施例中，将一个或多个整料，比如图2或图4的基质，插入到生物反应器100中。在一些实施例中，整料的高度范围为1至5厘米，并且外径范围为2至15厘米。在一些实施例中，整体基质124被集成在包括细胞的生物反应器100中，并且整体基质包括粘附于其上的细胞。
61.据信，基质124的三维结构是有利的，因为其为培养贴壁细胞提供了大的表面积。此外，基质124可以包括均匀的结构并提供刚性，这使得均匀的流体流动和一致且可预测的细胞培养成为可能。
62.虽然上述附图通常示出了某种程度上同质的基质布置，但基质可以非同质或非均匀的方式提供。例如，如图6中示意性例示的，基质124可以被设置成使得具有密度或紧密度的梯度，如右边较暗的部分和左边逐渐变亮的部分所表示。例如，这可以通过在一个区域或区z1中提供具有较大压实程度的物体124a，在第二区域或区z2中提供较小压实程度的物体124c，以及在其间提供可能的具有不同的中间压实程度的一个或多个附加区z3至zn。通过使用增材制造，比如3d打印技术，可以使用不同大小、不同形状、不同间距或前述的任何组合的物体124a、124b来实现不同程度的压实，并因此在孔隙率和流体流动方面为基质124提供变量或特性。这样，当实际上不存在离散层时，结构化整体基质124可以模拟由织造或非
织造材料形成的常规固定床中的多层效果。
63.转到图7和图8，可以理解的是，结构化整体基质124可以包括不同或交替压实或密度的两个或多个不同区。例如，图7中的布置示出了高密度或压实的三个区z4，每个区由低密度或压实的区z5隔开。因此，低密度或压实的区z5可以基本上用作较高压实区z4的间隔物，其可以主要用于贴壁细胞生长。因此，较低压实区或区域(高孔隙度)具有更大的孔隙度，并促进流体流过基质124和相邻的较高压实(低孔隙度)区域或区之间。可以以任何期望的模式或布置来提供任何数量的此类区，并且所提供的每个区或区域可以在任何方向上具有不同的压实。此外，虽然图7示出了被竖直地布置的区域，但是从图8中可以理解，区z4、z5可以水平地布置(其中，主要流动方向f是竖直的，但是通常水平流动也是可能的，如以下描述中进一步概述的)。
64.尽管上文所示的差异压实的区为线性，但是使用增材制造技术形成的基质124的布置可以如此使得低压实的区形成迷宫式路径l，如图9所示。在一个示例中，如图所示，这可以通过使具有第一较小尺寸或较大间距的物体124d沿着期望的路径提供来实现，期望的路径由较大尺寸或较小间距的物体124a界定。物体124a、124d可以任选地通过连接器124b连接，连接器124b也可以具有不同的大小和形状。布置可以如此使得实现流体沿不同方向(如箭头m所示，在整个基质124中产生对流流的所谓“离开斜坡”)流入较高压实区。尽管在图9中仅示出了一个这样的迷宫式路径l，但是应该理解的是，可以提供一个以上的这样的路径，并且进一步地应该理解的是路径可以在任何方向上延伸。
65.在前述示例中，物体124a、124c、124d例示为通常是有序的，因此具有规则的图案。然而，形成3d打印整体基质124的物体可以随机布置，或者具有不同结构大小的不规则图案(例如，布置可以容纳大通道、小通道和用于细胞的空腔)。图10例示了相似大小的物体124a的随机布置的一个示例，但是该随机性也可以应用于形成3d打印的结构化整体基质124的物体的大小、形状或间距。生物反应器可以由几个子模块组成，然后包括几个整料。
66.用于形成基质124的材料具有生物相容性，并且可以是刚性的或柔性的。在柔性材料的情况下，基质124可以是可压缩的，因此基本上像海绵一样起作用。因此，如图11和图12所示，通过在生物反应器100的内部中央隔室或腔室126内压缩基质124(在放大图中示出为由3d打印材料的随机网状物形成)，流体可以从其中释放(并且可能转移到与生物反应器流体连通的贮存器200，比如通过排放管线连接的收获瓶)。这种压缩可以以多种方式实现，比如通过使用可移动柱塞130形式的压缩器，或者使用也形成压缩器或柱塞的可移动内部壁或外部壁接合基质124。在压缩基质124之前或期间，可以比如通过使用胰蛋白酶或类似的分离剂实现细胞从基质124的分离。基质124的压缩可以反向进行以允许膨胀，然后重复压缩基质并促进细胞分离剂从中分散。附加地或替代地，可以向生物反应器100或其任何部分(例如，中央腔室126)施加真空，以帮助流体回收。
67.在增材制造(例如，3d打印)期间，可以使用单一材料或多种材料形成基质124，比如通过同时或依次使用多个装置，比如3d打印头、喷嘴或挤出机。在一个示例中，基质124可以由可溶材料和不可溶材料两种材料形成，然后施加溶剂(例如水)以洗去可溶材料，这可以用于在基质内形成期望的图案。例如，这种技术可以用于实现图10所示的随机配置示例。
68.也可对材料进行各种处理，以提供某些品质，比如，通过使床的某些部分亲水并且某些部分疏水。同样，某些部分可以被制成细胞粘附性的，比如例如通过提供结合配体。一
旦制作了基质124，在形成过程期间，或两者都进行，任何或所有此类处理也可以应用于材料。
69.图13例示了生物反应器100的另一示例。这个生物反应器100包括图1的实施例的基本结构，但是具有多个堆叠的床122。每个床122可以由一个或多个基质(示出了两个基质，但是可以提供任何数量的基质)形成。
70.如图14所示，床122可以位于径向向内(中心)的腔室126中。叶轮118可以在基底腔室116中。当叶轮118被启动时，可以使流体(比如液体、气体或两者)向上流过床122，向外流到腔室120、123，然后回到基底腔室116。
71.转到图15，例示了生物反应器100的替代实施例，其如上所述包括壳体112。在这个实施例中，流体通过搅拌器，比如在基底腔室116中或附近的壳体或容器140中的叶轮118循环，并首先流向中心腔室126，然后径向向外竖直地通过结构化固定床122。液体一离开床122上部部分然后就沿着床122径向向外的腔室120返回，并返回到叶轮118以重复循环。
72.图16例示了生物反应器100的替代实施例，其结构与图15中的生物反应器有些相似，主要区别在于省略了中心腔室，采用实心芯137的形式。因此，流体，比如液体，可以通过开口径向离开叶轮118的容器140，并且基本上如前所述行进，经由基底腔室116返回到容器140。
73.在图17例示的实施例中，结构化固定床122由位于生物反应器100中的一个或多个整体基质124组成。生物反应器被布置成使得流体从入口i流向或灌注到出口o，比如竖直地从顶部流向底部，但是方向也可以相反。图18示出了生物反应器100的另一布置，其中，流体通常从入口i通过结构化固定床122水平地流向出口o，结构化固定床122由一个或多个整体基质124组成，一个或多个整体基质124以堆叠的方式定位在生物反应器100中。
74.如上所述，生物反应器100和基质124可以在单一增材制造(如3d打印)期间同时形成整体结构。这有利地避免了在生物反应器中单独构建并安装基质124的需要，其中，通过粘合剂或其他方式提供必要的密封。结果是生物反应器在制造和功能方面具有更高的完整性、质量和均匀性/一致性。
75.根据本公开的另一方面，参考图19和图20，可以提供由计算机300控制的工艺，计算机300包括微处理器300a和存储有应用程序的存储装置300b(或从云中下载的应用程序)。用户可以通过输入302(例如键盘302a、鼠标302b和显示器302c)提供用于构建生物反应器、结构化整体床或两者的某些目标。例如，目标可以是期望的大小、体积或形状、期望的每单位体积的细胞密度、期望的流体流速、期望的细胞系、或其他工艺条件中的一者或多者。然后，计算机300确定生物反应器的最佳构造，以实现用户限定的目标，并将信息输出到输出装置，比如用于执行增材制造的装置(例如3d打印机304)，以根据这些目标制作生物反应器或基质，或者任选地输出到显示器302c，用于在输出到打印装置之前进行用户定制。虽然示出了离散的单元，但是应该理解，所有单元都可以组合成单个装置。
76.图20通过流程图例示了用于形成结构化整体固定床的相应工艺400。方法包括数据输入步骤402、数据处理步骤404、在输出到打印机之前将数据输出到3d打印机或任选地输出到屏幕以供用户定制的步骤406、以及基于最终输入和应用用打印机打印固定床的步骤408。
77.概括而言，本公开可以涉及以下任意次序的组合的一项或多项：
78.1.一种用于培养细胞的设备，包括：
79.生物反应器器皿；以及
80.设置在该器皿的一部分中的整体结构化细胞培养床。
81.2.如项目1所述的设备，进一步包括用于使流体流过该整体式结构化细胞培养床的搅拌器。
82.3.如项目1或项目2所述的设备，其中，整体式结构化细胞培养床是环形的。
83.4.如项目1至3中任一项所述的设备，其中，整体式结构化细胞培养床为长方体。
84.5.如项目1至4中任一项所述的设备，其中，整体式结构化细胞培养床包括具有部分弯曲或圆形形状的互连物体的片材。
85.6.如项目1至5中任一项所述的设备，其中，整体结构的细胞培养床包括物体的三维基质。
86.7.如项目6所述的设备，其中，基质中的物体是直接相连的。
87.8.如项目6所述的设备，其中，基质中的物体通过连接器连接，在物体之间形成空间。
88.9.如项目1至9中任一项所述的设备，其中，生物反应器器皿包括用于接收整体结构化细胞培养床的环形腔室。
89.10.如项目1至9中任一项所述的设备，其中，所述反应器器皿和整体结构化细胞培养床包括一体化结构。
90.11.如项目1至10中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括用于无阻碍流体流动的一条或多条路径。
91.12.如项目11所述的设备，其中，一条或多条路径是线性的。
92.13.如项目11所述的设备，其中，一条或多条路径是非线性的。
93.14.如项目1至13中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括随机布置的物体。
94.15.如项目1至14中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括第一区，第一区具有比第二区更大的物体密度。
95.16.如项目1至15中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床适于产生流体流动梯度。
96.17.如项目1至16中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床是3d打印的。
97.18.如项目1至17中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床是可压缩的。
98.19.如项目18所述的设备，进一步包括用于压缩整体结构化细胞培养床的压缩机。
99.20.如项目1至19中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括不同孔隙率的区域。
100.21.如项目20所述的设备，其中，区域包括用于实现培养基分布的较大孔隙区域和用于细胞截留/生长的较小孔隙区域。
101.22.如项目1至21中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括被处理成亲水性的至少一部分。
102.23.如项目1至22中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括被处理成疏水性的至少一部分。
103.24.如项目1至23中任一项所述的设备，其中，整体结构化细胞培养床包括经处理以增加细胞粘附特性的至少一部分。
104.25.一种用于制造的方法，包括：
105.通过增材制造而形成整体结构化细胞培养床。
106.26.如项目25所述的方法，其中，形成步骤包括3d打印整体结构化细胞培养床。
107.27.如项目25或26所述的方法，包括将生物反应器和整体结构化细胞培养床一起形成为整体结构化。
108.28.如项目25至27中任一项所述的方法，其中，形成步骤包括同时3d打印生物反应器和整体结构化细胞培养床。
109.29.如项目25至28中任一项所述的方法，其中，形成步骤包括使用两种不同的材料形成整体结构化细胞培养床。
110.30.如项目25至29中任一项所述的方法，进一步包括在形成步骤期间或之后对整体结构化细胞培养床的至少一部分进行功能性改性的步骤。
111.31.如项目25至30中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：
112.将用于所述整体结构化细胞培养床的一个或多个期望目标输入计算机，以及
113.基于一个或多个期望目标使用计算机控制该形成步骤。
114.32.一种用于培养细胞的设备，包括：
115.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括一条或多条路径，该一条或多条路径位于整体结构化细胞培养床内，用于促进无阻碍的流体流动。
116.33.如项目32所述的设备，其中，一条或多条路径是线性的。
117.34.如项目32所述的设备，其中，一条或多条路径是非线性的。
118.35.一种用于培养细胞的设备，包括：
119.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括随机布置的物体。
120.36.一种用于培养细胞的设备，包括：
121.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括第一区，该第一区具有比第二区更大的物体密度。
122.37.一种用于培养细胞的设备，包括：
123.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床适于产生流体流动梯度。
124.38.一种用于培养细胞的设备，包括：
125.可压缩的整体结构化细胞培养床。
126.39.如项目38所述的设备，进一步包括用于压缩整体结构化细胞培养床的压缩机。
127.40.一种用于培养细胞的设备，包括：
128.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括不同孔隙率的区域。
129.41.如项目40所述的设备，其中，该区域包括用于实现培养基分布的较大孔隙区域和用于细胞截留/生长的较小孔隙区域。
130.42.一种用于培养细胞的设备，包括：
131.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括被处理成亲水性的至少一部分。
132.43.一种用于培养细胞的设备，包括：
133.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括被处理成疏水性的至少一部分。
134.44.一种用于培养细胞的设备，包括：
135.整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床包括经处理以增加细胞粘附特性的至少一部分。
136.45.如项目44所述的设备，其中，经处理以增加细胞粘附特性的部分包括结合配体。
137.46.一种生物反应器，包括如项目32至45中任一项所述的设备。
138.47.一种生物反应器，包括形成为一体化结构的如项目32至45中任一项所述的设备。
139.如本文所用，以下术语具有以下含义：
140.本文中使用的“一/一个(a)”、“一/一个(an)”和“该/所述(the)”指的是单数和复数所指物，除非上下文另有明确规定。举例来说，“一/一个隔间”指的是一个或多个隔间。
141.本文中使用的“大约”、“基本上”或“大致”指的是可测量值，比如参数、量、时间持续时间等，意味着包含特定值的+/-20％或更少、优选+/-10％或更少、更优选+/-5％或更少、甚至更优选+/-1％或更少、还更优选+/-0.1％或更少的变化，到目前为止，这些变化适合于在公开的发明中执行。然而，应当理解，修饰语“大约”所指的值本身也得到特别公开。
142.本文中所用的“包含(comprise)”、“包含(comprising)”和“包含(comprises)”以及“由
……
组成(comprised of)”与“包括(include)”、“包括(including)”、“包括(includes)”或“容纳/含有(contain)”、“容纳/含有(containing)”、“容纳/含有(contains)”是同义的，并且是包含性的或开放式的术语，其指定了随后的事物的存在，例如，“部件包括”并且不排除或预先排除本领域已知的或其中公开的附加的、未列举的部件、特征、元件、构件、步骤的存在。
143.本文所用的“整料”或“整体的”是指单一的三维结构，其避免了离散的部分，比如元件或层放置在彼此之上或相邻以形成整体。
144.虽然在此已经示出和描述了某些实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。例如，虽然生物反应器以竖直方向显示，但它可以以任何方向使用。生物反应器也可以由刚性、柔性或半柔性材料形成，并且可以被制造用于单次或多次使用。应当理解，在实践本发明时，可以采用本文中描述的本发明的实施例的各种替代方案。以下权利要求旨在定义适用法律下的保护范围，并涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

技术特征：
1.一种用于培养细胞的设备，包括：生物反应器器皿；以及设置在所述器皿的一部分中的整体结构化细胞培养床。2.如权利要求1所述的设备，进一步包括用于使流体流过所述整体结构化细胞培养床的搅拌器。3.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床是环形的。4.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床为长方体。5.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括具有部分弯曲或圆形形状的互连物体的片材。6.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括物体的三维基质。7.如权利要求6所述的设备，其中，所述三维基质中的所述物体是直接相连的。8.如权利要求6所述的设备，其中，所述三维基质中的所述物体通过连接器连接，在所述物体之间形成空间。9.如权利要求1所述的设备，其中，所述生物反应器器皿包括用于接收所述整体结构化细胞培养床的环形腔室。10.如权利要求1至9中任一项所述的设备，其中，所述生物反应器器皿和所述整体结构化细胞培养床包括一体化结构。11.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括用于无阻碍流体流动的一条或多条路径。12.如权利要求11所述的设备，其中，所述一条或多条路径是线性的。13.如权利要求11所述的设备，其中，所述一条或多条路径是非线性的。14.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括随机布置的物体。15.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括第一区，所述第一区具有比第二区更大的物体密度。16.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床适于产生流体流动梯度。17.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床是3d打印的。18.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床是可压缩的。19.如权利要求18所述的设备，进一步包括用于压缩所述整体结构化细胞培养床的压缩机。20.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括不同孔隙率的区域。21.如权利要求20所述的设备，其中，所述区域包括用于实现培养基分布的较大孔隙区域和用于细胞截留/生长的较小孔隙区域。22.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括被处理成亲水性的至少一部分。23.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括被处理成疏水性的至少一部分。24.如权利要求1所述的设备，其中，所述整体结构化细胞培养床包括经处理以增加细
胞粘附特性的至少一部分。25.一种用于制造的方法，包括：通过增材制造而形成整体结构化细胞培养床。26.如权利要求25所述的方法，其中，所述形成步骤包括3d打印所述整体结构化细胞培养床。27.如权利要求25所述的方法，包括将生物反应器和所述整体结构化细胞培养床一起形成为一体化结构。28.如权利要求27所述的方法，其中，所述形成步骤包括同时3d打印所述生物反应器和所述整体结构化细胞培养床。29.如权利要求25所述的方法，其中，所述形成步骤包括使用两种不同的材料形成所述整体结构化细胞培养床。30.如权利要求25所述的方法，进一步包括在所述形成步骤期间或之后对所述整体结构化细胞培养床的至少一部分进行功能性改性的步骤。31.如权利要求25所述的方法，进一步包括以下步骤：将用于所述整体结构化细胞培养床的一个或多个期望目标输入计算机，以及基于所述一个或多个期望目标使用所述计算机控制所述形成步骤。32.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括一条或多条路径，所述一条或多条路径位于所述整体结构化细胞培养床内，用于促进无阻碍的流体流动。33.如权利要求32所述的设备，其中，所述一条或多条路径是线性的。34.如权利要求32所述的设备，其中，所述一条或多条路径是非线性的。35.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括随机布置的物体。36.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括第一区，所述第一区具有比第二区更大的物体密度。37.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床适于产生流体流动梯度。38.一种用于培养细胞的设备，包括：可压缩的整体结构化细胞培养床。39.如权利要求38所述的设备，进一步包括用于压缩所述整体结构化细胞培养床的压缩机。40.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括不同孔隙率的区域。41.如权利要求40所述的设备，其中，所述区域包括用于实现培养基分布的较大孔隙区域和用于细胞截留/生长的较小孔隙区域。42.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括被处理成亲水性的至少一部分。
43.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括被处理成疏水性的至少一部分。44.一种用于培养细胞的设备，包括：整体结构化细胞培养床，所述整体结构化细胞培养床包括经处理以增加细胞粘附特性的至少一部分。45.一种生物反应器，包括如权利要求32至44中任一项所述的设备。46.一种生物反应器，包括形成为一体化结构的如权利要求32至44中任一项所述的设备。

技术总结
一种用于培养细胞的设备，包括生物反应器，生物反应器包括整体结构化细胞培养床，该整体结构化细胞培养床可以使用增材制造技术，比如3D打印来制造。生物反应器和整体结构化细胞培养床可以形成一体化结构。整体结构化细胞培养床可以包括不同孔隙率和/或表面处理的区域，以实现期望的目标。还提供了相关的方法。以实现期望的目标。还提供了相关的方法。以实现期望的目标。还提供了相关的方法。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：尤尼沃尔塞尔斯技术股份公司
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2023/8/24