抗严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV2)感染的作为ACE-2和S1亚基模拟物的肽及其缀合物的制作方法

抗严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov2)感染的作为ace-2和s1亚基模拟物的肽及其缀合物
技术领域
1.本发明涉及蛋白质组学和病毒学领域，更特别地涉及肽及其缀合物，如ace-2和s1亚基模拟肽，通过阻止严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(下文称为“sars-cov2”)与靶细胞的结合来预防和控制严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov2)感染。


背景技术：

2.背景描述包括可以有助于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息都是现有技术或者与当前要求保护的发明有关，或者任何具体或者暗中引用的任何出版物都是现有技术。
3.严重急性呼吸综合征(sars)是一种具有高度传染性和潜在致命性的病毒性疾病，其特征是明显的呼吸道症状和肺炎。严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars cov-2)已经成为一种全球性大流行病，需要开发有助于针对sars cov-2的预防/防止以及治疗应用的生物分子、疫苗和药物。这种疾病的快速出现和传播使人们付出了大量努力以开发有效的预防和治疗方法。这些工作导致分离出引起sars的独特冠状病毒，并对这种病毒的基因组进行了完整的测序。sars病毒的基因组已经被完全测序，基于序列信息和对其他冠状病毒生命周期的了解，认为sars病毒由称为“s”的表面蛋白介导进入宿主细胞，该表面蛋白与hiv-1包膜糖蛋白类似。一些冠状病毒将s蛋白切割成两个片段，称为s1(介导受体结合)和s2(介导病毒与宿主细胞膜的融合)。在其他冠状病毒中，包括引起sars的冠状病毒，s蛋白没有被切割。尽管如此，仍然可以识别s1结构域和s2结构域，并且初始受体结合显然仍由s1介导。
4.引起sars的病毒(sars-cov)不属于任何先前定义的遗传和血清学冠状病毒群，并且介导病毒进入携带受体的细胞的sars-cov s蛋白也与其他冠状病毒的蛋白不同(marra等人，science 300：1399-1404(2003)。由于s蛋白的独特性质，sars-cov并不利用任何先前确定的冠状病毒受体来感染细胞。相反，血管紧张素转换酶2(ace2)充当该病毒的功能性受体。
5.目前针对sars的抗病毒肽是根据sars病毒的基因组序列设计的，并不针对特定的相互作用或功能。如上所述，ace-2是一个有效的靶点，在病毒与细胞表面以及肾素-血管紧张素系统的相互作用中起主要作用。除了众所周知的调节血压和电解质平衡的作用外，ace-2的这种调节作用在引发炎症性肺病方面也起着重要作用。另一种蛋白酶tmprss2由sars病毒附着的宿主细胞产生。tmprss2蛋白水解s蛋白，使其与ace-2蛋白结合。几种tmprss2抑制剂正在临床试验中。迄今为止，尚无针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)的有效疫苗或疗法，sars-cov-2是冠状病毒疾病2019(covid-19)的导致大流行病的病原体。由于肽抑制剂的安全性、有效性和特异性，其在治疗新出现的病毒病原体方面具有广阔的前景。基于已知的病毒蛋白及其细胞靶点的结构，可以合理设计并优化抗病毒肽。所得肽可以对其各自的靶标和特定的病毒病原体具有高度特异性，或者发挥广泛的抗病毒活性。已经进行了关于抑制sars-cov-2进入的肽的研究，并且已经提出了各种策略
以设计靶向ace2受体或病毒刺突蛋白及其活化蛋白酶furin、跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)或组织蛋白酶l的肽。然而，这些肽大多数都是新的化学实体，并且病毒可能很快因选择性压力而产生抗性。因此，需要开发新型有效的重点关注ace-2和刺突蛋白s1或s2之间的相互作用的肽类药物。
6.目前，缺乏针对冠状病毒感染的明确和确定的疗法、控制剂或预防剂。尽管已经确定了sars-cov的基因组序列，但是该病毒仍有许多方面有待了解，因此需要诊断和治疗该病毒及综合征的方式和方法。


技术实现要素：

7.在一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的模拟肽，其包含seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列。在一方面，本发明提供了包含seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽复合物。
8.在一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:3的氨基酸序列的模拟肽。
9.在一方面，本发明提供了特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽。
10.在一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽复合物。
11.在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，以及药学上可接受的载体。在一个实施方式中，该药物组合物包含缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:3、seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物。在一个实施方式中，药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇、选自糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇或其组合)的等渗剂。
12.在一方面，本发明提供了一种抑制受试者sars cov2感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制或阻断sars-cov2刺突蛋白与受试者宿主细胞的ace-2受体的相互作用。在一个实施方式中，抑制受试者中的sars cov2感染的方法包括向受试者施用有效量的缀合物，其包含seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制或阻断sars-cov2刺突蛋白与受试者宿主细胞的ace-2受体的相互作用。
13.在一方面，本发明提供了一种治疗或实现预防受试者sars cov2感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制或阻断受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。在一个实施方式中，治疗或实现预防受试者中sars cov2感染的方法，其中包括向受试者施用有效量的缀合物、seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。
14.在一方面，本发明提供了包含seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物在抑制或阻断受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用的用途。
附图说明
15.将参考本发明的实施方式，在附图中可以示出其实例。这些图是说明性的，而非限制性的。尽管在这些实施方式的背景中概括地描述了本发明，但是应当理解的是，并不旨在将本发明的范围限制到这些特定的实施方式：
16.图1示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:1至seq id no:4的肽和结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒之间的相互作用；
17.图2a至图2f示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:1至seq id no:6的肽与刺突s1蛋白相互作用的3d模型，描绘了10种不同的结合可能性的表面；
18.图3a示出了根据本发明的一个实施方式，使用可从sars-cov刺突的晶体结构获得的结构信息模拟的ace-2和刺突s1蛋白之间的相互作用；
19.图3b示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:3的肽3与受体结合域(rbd)以及s1蛋白的其他内部区域的相互作用阻断了与ace2的相互作用和病毒的进一步复制的3d模型；
20.图3c示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:4的肽4与受体结合域(rbd)以及s1蛋白的其他内部区域的相互作用阻断了与ace2的相互作用和病毒的进一步复制的3d模型；
21.图4a示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:3的肽3与结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒的相互作用；
22.图4b示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:4的肽4与结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒之间的相互作用；
23.图4c示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:3和seq id no:4的肽复合物与结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒之间的相互作用；
24.图5a至5b描述了用与金纳米颗粒缀合的本发明的seq id no:3的肽3(p3)检测sars-cov2刺突s1蛋白；
25.图6a至6b描述了用与金纳米颗粒缀合的本发明的seq id no:4的肽4(p4)检测sars-cov2刺突s1蛋白；
26.图7a描述了用表达ace-2的细胞hek293细胞进行的实验，该实验显示了his-标签重组s1蛋白和重组ace-2在有或没有本发明的seq id no:3的肽3的情况下结合时的蛋白质-蛋白质相互作用；
27.图7b(i、ii和iii)描述了用表达ace-2的细胞hek293细胞进行的实验，该实验显示了his-标签重组s1蛋白和重组ace-2在有或没有本发明的seq id no:4的肽4的情况下结合时的蛋白质-蛋白质相互作用；和
28.图8描述了在作为肽复合物的seq id no:3的肽3和seq id no:4的肽4组合时ace-2受体与刺突s1蛋白结合的结果，其中seq id no:3的肽3和seq id no:4的肽4的浓度均为1ng。
具体实施方式
29.如以下优选实施方式所述，本发明克服了现有技术、技术手段和方法有关的问题和缺陷。
30.本发明提供了针对包膜病毒(例如sars-cov-2)的抗病毒疗法的新型肽、缀合物和组合物。本发明还提供了将这些肽单独或结合或不结合修饰物或缀合物作为抗病毒剂的用途。
31.在一方面，本发明提供了通过模拟ace-2受体来抑制病毒与宿主细胞结合的新型肽。模拟肽可以具有seq id no:1(yqkdhqm)、seq id no:2(qkhyqmk)、seq id no:3(qtfdknhedlylqakqlk)或seq id no:4(dkfnheaedlfy)的氨基酸序列，单独或组合为肽复合物。所述肽可以单独或与其他肽组合作为肽缀合物或修饰的肽或肽复合物，可以结合到sars-cov2刺突s1蛋白亚基，模拟ace-2受体竞争性抑制sars-cov2刺突蛋白s1亚基与宿主细胞的结合。图1示出了分别称为肽a至肽d(seq id no:1至seq id no:4)的所述肽可以模拟ace-2受体并阻止病毒与所述ace-2受体的结合，从而防止病毒感染宿主细胞。
32.在另一方面，本发明提供了具有结合至sars-cov2刺突蛋白s1亚基的亲和性的肽。所述seq id no:5和/或seq id no:6的肽可以具有与sars-cov2刺突蛋白s1亚基结合的亲和性。所述肽的氨基酸序列可以分别为qtnkyqfqtnkyqf或kyqfqtnkyqfqtn。所述肽可以单独或与其他肽缀合或修饰组合，并且可以结合到sars-cov2刺突s1蛋白亚基，竞争性地抑制sars-cov2刺突蛋白s1亚基与宿主细胞的结合。这些肽在图1中称为肽e(pepe-seq id no:5)至肽f(pepf-seq id no:6)和(标号4)。肽e和肽f(seq id no:5和seq id no:6)单独或与其他缀合或修饰的肽组合，模拟sars cov-2刺突蛋白s1亚基，与s1蛋白(2)结合并同时使s1蛋白三聚体化，并且也与ace-2受体(1)结合，从而竞争性地阻止病毒的结合以及进入到细胞感染。因此，本发明的seq id no:5(pep-e)和seq id no:6(pep-f)的肽与所述s1蛋白亚基的结合可以阻止或防止病毒进入细胞，因此可以防止和/或阻止宿主细胞的感染。
33.图1示出了根据本发明的一个实施方式，分别结合到刺突蛋白或细胞表面上的ace-2受体的本发明的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6的肽和病毒的相互作用。图1示出了模拟肽(标号3、4)可以单独或组合模拟ace-2受体并防止病毒(标号2)与所述ace-2受体(标号1)结合，从而防止宿主细胞(标号6)病毒感染。在所述图1中，seq id no:1至seq id no:4的ace-2抑制剂肽称为肽a(pepa)、肽b(pepb)、肽c(pepc)和肽d(pepd)。表达血管紧张素转换酶受体-2(ace-2)(标号1)的宿主细胞(标号6)通常结合sars-cov2病毒(标号2)中s1刺突蛋白的受体结合域(rbd)。基于这种相互作用，设计了一种鉴定相互作用氨基酸以研发本发明的肽的具体方法，所述肽可以与sars-cov2病毒(标号2)中刺突s1蛋白的受体结合域(rbd)相互作用。使用从sars-cov刺突(蛋白质数据库-pdb编码6ack)和ace-2(pdb编码1r42)的晶体结构中能够获得的结构信息，模拟ace-2(1)和刺突s1蛋白之间的相互作用。使用dock软件(http://zdock.umassmed.edu/)分析结构并鉴定相互作用交互界面。鉴定了刺突s1蛋白和ace-2之间的相互作用的氨基酸。发现相互作用的氨基酸不仅是线性的，而且有几个氨基酸与超过一个的氨基酸相互作用，这表明它们的相互作用更为重要。使用这类氨基酸和其他氨基酸，产生了形成本发明的肽seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4的几种氨基酸组合。
34.在本发明的另一方面，本发明的实施方式的肽可以相互偶联/连接或缀合。肽可以是线性的和/或环状/环形的。组合肽或缀合肽也可以由两种以上的肽构成。本发明的肽可以通过例如可变长度的间隔子直接连接或间接连接。此外，肽可以共价连接或非共价连接。它们也可以是融合蛋白或缀合物的一部分。
35.在一个实施方式中，本发明提供了缀合物或修饰的肽，其中本发明的seq id no:1至seq id no:6的肽可以进一步缀合或修饰或配制至免于蛋白水解和降解的特异性保护性化合物。保护性化合物可以是聚乙二醇。缀合或修饰的肽或制剂可用于治疗或预防sars cov-2。这些肽可以单独使用或组合使用，以实现对病毒感染的保护作用或用于治疗。
36.在表1和图2a至图2f中，由与刺突s1蛋白相互作用的ace-2氨基酸产生的几种肽中，使用对接分数计算它们的结合强度。
37.肽的对接分数如下表1所示：
[0038][0039]
如图3a至3c所示，发现本发明的seq id no:3的肽3和seq id no:4的肽4的相互作用与刺突s1蛋白相互作用，并显示出具有不同对接分数的10种不同的结合可能性。基于最佳对接分数，选择本发明的seq id no:3的肽3(图3b)和seq id no:4的肽4(图3b)进行进一步评估。
[0040]
因此，在一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的模拟肽，其包含seq id no:3(qtfdknhedlylqakqlk)或seq id no:4(dkfnheaedlfy)的氨基酸序列。模拟肽可以与保护肽免受蛋白水解和/或降解的保护性化合物(例如聚乙二醇)缀合。所述肽可以单独或与其他肽缀合或修饰组合，并且可以与sars-cov2刺突s1蛋白亚基结合，竞争性地抑制sars-cov2刺突s1蛋白亚基与宿主细胞的结合。根据图4a至4b所示的本发明实施方式，本发明的seq id no:3至seq id no:4与结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒相互作用。如图4c所示，在本发明的一个实施方式中，本发明的seq id no:3和seq id no:4的肽复合物与结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒相互作用。
[0041]
在一个实施方式中，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒s1刺突蛋白的模拟肽，其包含seq id no:4(dkfnheaedlfy)。模拟肽可以与保护性化合物缀合，以保护模拟肽免受蛋白水解和/或降解。保护性化合物可以是聚乙二醇。所述肽缀合物可以与其他肽缀合或修饰组合，并且可以结合到sars-cov2刺突s1蛋白亚基，竞争性地抑制sars-cov2刺突s1蛋白亚基与宿主细胞的结合。
[0042]
在一个实施方式中，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的模拟肽复合物。该肽复合物包含seq id no:3(qtfdknhedlylqakqlk)和seq id no:4
(dkfnheaedlfy)的氨基酸序列。所述肽复合物可以与sars-cov2的刺突s1蛋白亚基结合，并竞争性抑制sars-cov2的刺突蛋白s1亚基与宿主细胞的结合。图8描述了在存在组合的情况下，即存在seq id no:3的肽3和seq id no:4的肽4的肽复合物的情况下，ace-2受体与刺突s1蛋白的结合。已经观察到，seq id no:3的肽3和seq id no:4的肽在10ng的浓度下单独抑制或阻断sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。人们惊讶地发现，含有seq id no:3的肽3和seq id no:4的组合的肽复合物甚至在1ng的浓度下，也可以完全抑制或阻断sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。
[0043]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:3的氨基酸序列的模拟肽。本发明的模拟肽缀合物可以特异性地检测刺突s1蛋白。图5a示出了以具有模拟肽seq id no:3(p3)的模拟肽缀合物检测s1蛋白(标号10和标号11)。图5b示出了模拟肽对s1蛋白具有特异性，无法结合mers病毒和sars-cov1病毒的刺突蛋白(标号12)。seq id no:3(p3)的模拟肽或其缀合物阻断了ace-2受体和sars-cov2刺突s1蛋白之间的相互作用。图7a标号13所示的结果显示在肽seq id no:3(p3)存在的情况下，ace-2受体和sars-cov2的刺突s1蛋白之间的相互作用被阻断。
[0044]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽。本发明的模拟肽缀合物可以特异性地检测刺突s1蛋白。图6a示出了以具有模拟肽seq id no:4(p4)的模拟肽缀合物检测s1蛋白(标号16和标号17)。图6b示出了模拟肽对s1蛋白具有特异性，无法结合mers病毒和sars-cov1病毒的刺突蛋白(标号18)。seq id no:4(p4)的模拟肽或其缀合物阻断了ace-2受体和sars-cov2的刺突s1蛋白之间的相互作用。图7b标号21所示的结果显示在肽seq id no:4(p4)存在的情况下，ace-2受体和sars-cov2的刺突s1蛋白之间的相互作用被阻断。
[0045]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽复合物。本发明的模拟肽缀合物可以特异性地检测刺突s1蛋白。
[0046]
在一个实施方式中，本发明提供了一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的模拟肽或肽复合物或缀合物，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的模拟肽，优选与10nm或15nm或20nm纳米颗粒缀合。
[0047]
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，以及药学上可接受的载体。在一个实施方式中，该药物组合物包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的seq id no:3或seq id no:4的模拟肽，优选与10nm、15nm或20nm纳米颗粒缀合。
[0048]
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含由seq id no:3或seq id no:4组成的模拟肽复合物，以及药学上可接受的载体。在一个实施方式中，该药物组合物包含由seq id no:3和seq id no:4组成的模拟肽复合物，其与10nm至20nm纳米颗粒缀合，优选与10nm、15nm或20nm纳米颗粒缀合。
[0049]
在一个实施方式中，药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇、选自糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇或其组合)的等渗剂。
[0050]
在一个实施方式中，本发明的组合物可以通过制备此类肽制剂的常规方法制备，并且可以包括药物赋形剂，包括载体和稳定剂。在一个实施方式中，该组合物可以配制成口服组合物、局部组合物、皮下组合物、静脉内组合物、关节内组合物、雾化器或鼻用组合物。优选地，包含本发明肽的组合物是鼻用喷雾组合物。所述组合物可以优选为雾化器组合物。
[0051]
在一方面，本发明提供了一种抑制受试者中sars cov2感染的方法，该方法包括向受试者施用有效量的seq id no:4的模拟肽，从而抑制或阻断sars-cov2刺突蛋白与受试者的宿主细胞的ace-2受体的相互作用。在一个实施方式中，抑制受试者中sars cov2感染的方法，包括向受试者施用有效量的缀合物，所述缀合物包含seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。
[0052]
在一方面，本发明提供了一种治疗或实现预防受试者中sars cov2感染的方法，该方法包括向受试者施用有效量的seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制或阻断受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。在一个实施方式中，治疗或实现预防受试者中sars cov2感染的方法，包括向受试者施用有效量的缀合物，所述缀合物包含seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。
[0053]
在一方面，本发明提供了包含seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物在抑制或阻断受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用的方面的用途。
[0054]
在另一方面，本发明提供了一种竞争性抑制sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的相互作用的方法，所述方法通过提供对结合sars-cov2刺突蛋白s1亚基和结合s1蛋白具有亲和力的seq id no:5或seq id no:6的肽，并使s1蛋白三聚体化，防止与宿主细胞的ace-2受体结合而进行。
[0055]
实施例
[0056]
下面通过实施例进一步说明本发明。以下实施例仅以说明的方式给出，因此不应理解为限制本发明的范围。
[0057]
序列表以计算机可读的文本格式与本说明书一同提供。
[0058]
抗刺突蛋白的单克隆抗体来自mp biomedicals目录号0720302。s1刺突蛋白来自sino biologicals，目录号40591-v08h；硝酸纤维素膜来自axivia scichem，德里，目录号：df20/sx04。金纳米颗粒来自sigma，美国，目录号：741957。十水四硼酸钠来自sigma-目录号：s9640-2.5kg。牛血清白蛋白来自sigma-目录号：a3294-100。刺突s2蛋白来自sino biologicals，目录号：40590-v08h1。镍nta柱来自bio rad，美国，目录号：1560123。ace-2受体蛋白来自sino biologicals，目录号：10108-h05h。pvdf膜来自bio rad，目录号：88018。ace-2来自sino bio，目录号：10108-r003，刺突s1蛋白用抗刺突蛋白抗体来自mp biomedicals目录号0720302，抗人β-微管蛋白抗体来自sino bio，目录号：100109-mm05t。
[0059]
实施例1：根据sars-cov刺突(蛋白质数据库-pdb代码6ack)和ace-2(pdb代码1r42)的晶体结构可获得的结构信息设计模拟肽。
[0060]
基于可从sars-cov刺突(蛋白质数据库-pdb代码6ack)和ace-2(pdb代码1r42)的
晶体结构获得的结构信息设计本发明的模拟肽。使用zdock软件(http://zdock.umassmed.edu/)分析了结构并鉴定了相互作用界面。鉴定了刺突s1蛋白和ace-2之间相互作用的氨基酸，列于下图1和下表2。
[0061]
[0062][0063]
表2：人ace-2蛋白与sars-cov2病毒刺突s1蛋白之间的相互作用氨基酸
[0064]
针对ace-2与sars-cov-2刺突蛋白之间的结合进一步分析氨基酸。使用低能量含量、稳定的结构完整性和相互作用作为鉴定与sars-cov-2或ace-2结合的潜在肽序列的方法。确定并合成了以下6个肽序列：
[0065]
ace-2模拟物或sars-cov-2刺突蛋白s1亚基结合肽：
[0066]
1.pep a：yqkdhqm(seq id no:1)
[0067]
2.pepb：qkhyqmk(seq id no:2)
[0068]
3.pepc：qtfdknhedlylqakqlk(seq id no:3)
[0069]
4.pepd：dkfnheaedlfy(seq id no:4)
[0070]
sars-cov-2的刺突蛋白s1亚基模拟物或ace-2结合
[0071]
5.pepe：qtnkyqfqtnkyqf(seq id no:5)
[0072]
6.pepf：kyqfqtnkyqfqtn(seq id no:6)
[0073]
肽seq id no:1至seq id no:4(pepa至pepd)模拟ace-2受体结合位点，并具有结合sars-cov-2刺突蛋白s1亚基的亲和性。如图1所示，这些肽seq id no:1至seq id no:4单独或与其他缀合或修饰的肽组合，可以结合到sars-cov-2的刺突蛋白s1亚基，并阻止病毒进入细胞，从而阻止病毒进入和感染(抗病毒活性)。
[0074]
肽seq id no:5和seq id no:6(pepe和pepf)单独或与其他缀合或修饰的肽组合，模拟sars cov-2刺突蛋白s1亚基，与s1蛋白结合并同时使s1蛋白三聚体化，还与ace-2受体结合，从而竞争性地阻止病毒结合并进入细胞进行感染(抗病毒活性)。
[0075]
实施例2：肽合成方案
[0076]
使用fmoc(芴基甲基氧羰基保护基)方法进行肽合成，其中多个氨基酸通过酰胺键连接形成肽键以产生肽。该反应通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基的缩合反应发生。通常，第一氨基酸结合到用反应性基团(例如胺基或羟基)官能化的树脂珠上，以结合第一氨基酸。在结合第一氨基酸后，连续反应中允许氨基酸通过连续反应组装。偶联反应中使用的每个氨基酸都用fmoc保护。
[0077]
实施例3：根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:1至seq id no:4的肽和结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒之间的相互作用。
[0078]
实施例3和图1描绘了细胞与结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒的如何相互作用的示意图。图1示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4的肽和结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒之间的相互作用。观察到在存在ace-2模拟肽seq id no:1至seq id no:4(pepa、pepb、pepc或pepd)的情况下，可以单独或组合与sars-cov-2的s1蛋白(模拟ace-2受体结合域)相互作用并阻止病毒感染。肽seq id no:5和seq id no:6(pepe和pepf)可以单独或组合与ace-2受体相互作用，阻断病毒与细胞的相互作用，或与s1蛋白相互作用，阻止s1蛋白的三聚体装配，从而阻断病毒。图1示出了抑制剂模拟肽(标号3、4)单独或组合可以模拟ace-2受体并防止病毒(标号2)与所述ace-2受体(标号1)结合，从而防止宿主细胞(标号6)的病毒感染。在所述图1中，seq id no:1至seq id no:4的ace-2抑制剂肽称为肽a(pepa)、肽b(pepb)、肽c(pepc)和肽d(pepd)。表达血管紧张素转换酶受体-2(ace-2)(标号1)的宿主细胞(标号6)通常结合sars-cov2病毒(标号2)中s1刺突蛋白的受体结合域(rbd)。
[0079]
基于这种相互作用，设计了一种鉴定相互作用氨基酸以研发本发明的肽的具体方法，所述肽可以与sars-cov2病毒(标签2)中s1刺突蛋白的受体结合域(rbd)相互作用。使用可以从sars-cov刺突(蛋白质数据库-pdb代码6ack)和ace-2(pdb代码1r42)的晶体结构中获得的结构信息，模拟ace-2(标号1)和刺突s1蛋白之间的相互作用。使用dock软件(http://zdock.umassmed.edu/)分析了结构并鉴定了相互作用界面。鉴定了s1刺突蛋白和ace-2之间的相互作用氨基酸，如上表2列出的。发现所述相互作用氨基酸不仅是线性的，而且有几个氨基酸与超过一个的氨基酸相互作用，这表明它们的相互作用更为重要。例如，ace-2的k31氨基酸与刺突s1蛋白受体结合域的k417、i418、y421和v445氨基酸相互作用。这种相互作用被认为是重要的，是最需要的氨基酸。类似地，ace-2受体的n33与刺突s1蛋白中的y449和y453相互作用，ace-2的h34与s1刺突的y453和l455相互作用，e35与l455和f456相互作用。使用这样的氨基酸和其他氨基酸，产生了导致本发明的肽seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4的几种氨基酸组合。
[0080]
实施例4：基于对接分数对肽进行选择：
[0081]
在由上表2的与刺突s1蛋白相互作用的ace-2氨基酸的组合产生的多种肽中，使用下表3所示和图2a至2f所示的对接分数计算它们的结合强度。
[0082][0083]
表3：肽1至肽4与刺突s1蛋白相互作用的对接分数。
[0084]
根据图2a至2f和图3a至3b所示的对接分数，发现seq id no:3的肽3的相互作用与刺突s1蛋白(标号8和标号9)相互作用，显示出存在具有10种不同对接分数的结合可能性(表1和表3)。基于最佳对接分数，选择seq id no:3的该肽3进行进一步评估。肽3的序列经鉴定为(qtfdknhedlylqakqlk)。
[0085]
此外，从如图2a至图2f以及图3a和图3c所示的对接分数中，发现seq id no:4的肽4的相互作用与刺突s1蛋白(标号14和标号15)相互作用，显示出存在具有不同对接分数的10种不同的结合可能性(表1和表3)。基于最佳对接分数，选择seq id no:4的该肽4进行进一步评估。肽4序列经鉴定为dkfnheaedlfy。
[0086]
实施例5：根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:3或seq id no:4的肽或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物和结合到细胞表面的ace-2受体的病毒5之间的相互作用
[0087]
图4a至4c示出了根据本发明的一个实施方式，本发明的seq id no:3或seq id no:4的肽或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物和结合到细胞表面上的ace-2受体的病毒之间的相互作用。观察到seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物可以模拟ace-2受体，并防止病毒(标号1)与所述ace-2受体(标号5)结合，从而防止宿主细胞的病毒感染(标号4)。在所述图1和图4a中，seq id no:3的ace-2抑制剂模拟肽称为肽3(pepc)。在所述图1和图4b中，seq id no:4的ace-2抑制剂模拟肽称为肽4(pepd)。表达血管紧张素转换酶受体-2(ace-2)(标号5)的宿主细胞(标号4)通常结合sars-cov2病毒(标号1)中刺突s1蛋白(标号3)的受体结合域(rbd)。基于这种相互作用，设计了一种鉴定相互作用氨基酸的特定方法，以研发本发明的seq id no:3的肽3或seq id no:4的肽4，其可以与sars-cov2病毒(1)中刺突s1蛋白(标号3)的受体结合域(rbd)相互作用。使用从sars-cov刺突(蛋白质数据库-pdb代码6ack)和ace-2(pdb代码1r42)的晶体结构中可获得的结构信息来模拟ace-2(标号5)和刺突s1蛋白(标号3)之间的相互作用。使用dock软件
(http://zdock.umassmed.edu/)分析了结构并鉴定了相互作用界面。如图3a至3c所示，该模拟产生相互作用的3d模型(标号7)。此外，如上表2中所列出的，鉴定了刺突s1蛋白与ace-2之间的相互作用氨基酸，所述表2显示了人ace-2蛋白与sars-cov2病毒刺突s1蛋白之间的相互作用氨基酸。
[0088]
发现所述相互作用的氨基酸不仅是线性的，而且有几个氨基酸与一个以上的氨基酸相互作用，这表明它们的相互作用更为重要。例如，ace-2的k31氨基酸与刺突s1蛋白受体结合域的k417、i418、y421和v445氨基酸相互作用。这种相互作用被认为是重要的，是最需要的氨基酸。类似地，ace-2受体的n33与刺突s1蛋白中的y449和y453相互作用，ace-2的h34与s1刺突的y453和l455相互作用，e35与l455和f456相互作用。使用这样的氨基酸和其他氨基酸，产生了导致本发明的肽seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4的几种氨基酸组合。如图3b所示，发现本发明seq id no:3的肽3的相互作用与刺突s1蛋白(标号8和9)相互作用。此外，如图3c所示，发现本发明的seq id no:4的肽4的相互作用与刺突s1蛋白(标号14和15)相互作用。
[0089]
实施例6：用与本发明seq id no:3的肽3(p3)或seq id no:4的肽4(p4)缀合的金纳米颗粒检测sars-cov2刺突s1蛋白
[0090]
为了通过实验测试seq id no:3的肽3或seq id no:4的肽4与刺突s1蛋白的结合，将1μg的刺突s1蛋白(sino biologica，目录号40591-v08h)点在硝酸纤维素膜(axivia scichem，德里，目录号：df20/sx04)。将seq id no:3的肽3或seq id no:4的肽p4与10nm至20nm金纳米颗粒(sigma，美国，目录号：741957)缀合。如下制备金纳米颗粒和肽或抗体缀合物：将金纳米颗粒在4℃下以15000rpm离心1小时45分钟，随后去除上清液并加入800μl 2mm十水四硼酸钠(sigma-目录号：s9640-2.5kg)以及30μg seq id no:3的肽3或seq id no:4的肽，在25℃下温育1小时。1小时后，添加100μl 10％的牛血清白蛋白(sigma-目录号：a3294-100)，在25℃温育1小时。温育后，将全部溶液在4℃下以15000rpm离心1小时45分钟。弃去上清液，添加100μl 2mm的十水四硼酸钠溶液。类似地，使用抗刺突单克隆抗体(mp biomedicals目录号0720302)代替肽与金纳米颗粒缀合作为阳性对照。
[0091]
如图5a和5b所示，将点在硝酸纤维素膜上的刺突s1蛋白分别与seq id no:3的肽-金缀合物和抗体-金缀合物进行温育。如图5a所示，观察肽seq id no:3(p3)-金纳米颗粒和抗体-金纳米颗粒的结合(标号10)。然而，通过肽seq id no:3(p3)-金纳米颗粒缀合物(标号10)无法检测到点在所述膜上的刺突s2蛋白(sino biologicals，目录号：40590-v08h1)。由抗刺突s1抗体-金纳米颗粒缀合物检测刺突s1蛋白(标号11)(图5a)。图5a显示了由肽seq id no:3(p3)检测刺突s1蛋白。此外，如图5b所示，肽seq id no:3(p3)-金纳米颗粒缀合物特异性地检测到刺突s1蛋白，而无法检测到mers和sars-cov1病毒的刺突蛋白(标号12)。
[0092]
如图6a和6b所示，将点在硝酸纤维素膜上的刺突s1蛋白分别与seq id no:4的肽-金缀合物和抗体-金缀合物进行温育。如图6a所示，观察肽seq id no:4(p4)-金纳米颗粒和抗体-金纳米颗粒的结合(标号16)。然而，通过肽seq id no:4(p4)-金纳米颗粒缀合物(标号16)无法检测到点在所述膜上的刺突s2蛋白(sino biologicals，目录号：40590-v08h1)。由抗刺突s1抗体-金纳米颗粒缀合物检测刺突s1蛋白(标号17)(图6a)。图6a显示了由肽seq id no:4(p4)检测刺突s1蛋白。此外，如图6b所示，肽seq id no:4(p4)-金纳米颗粒缀合物特异性地检测到刺突s1蛋白，而无法检测到mers和sars-covl病毒的刺突蛋白(标号18)。
[0093]
实施例7：用表达ace-2的细胞hek293细胞进行的实验显示了在有和没有本发明seq id no:3的肽3或seq id no:4的肽4的情况下，his-标签重组s1蛋白和重组ace-2的蛋白-蛋白相互作用
[0094]
使用将刺突s1蛋白结合到镍nta柱的简单方法来评估用于阻断ace-2受体和sars-cov2刺突s1蛋白之间的相互作用的seq id no:3(p3)或seq id no:4(p4)的肽。将镍nta柱(bio rad，usa，目录号：1560123)上的seq id no:3(p3)或seq id no:4(p4)的肽与ace-2受体蛋白(sino biologicals，目录号：10108-h05h)温育30分钟，并以5000rpm旋转沉淀10分钟。去除上清液后，添加磷酸盐缓冲盐水并进行混合，随后以5000rpm离心10分钟。去除上清液，加入样品加载染液进行sds-page(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。进行相同的反应，但是在反应管中与seq id no:3或seq id no:4的肽一起进行。在图7a的标号13的泳道1中可以清楚地看出ace-2和刺突s1蛋白存在相互作用，而在肽seq id no:3(p3)存在的情况下则无法看到(图7a的标号13的泳道2)。在图7b(ii)的标号20的泳道2中可以清楚地看出ace-2和刺突s1蛋白存在相互作用，而在肽seq id no:4(p4)存在的情况下则无法看到(图7b(ii)的标号20的泳道3)。
[0095]
如图7a-标号14所示，用表达ace-2的细胞hek293细胞进行实验。通过超声裂解hek293细胞，将这些裂解的蛋白与结合刺突s1蛋白的镍nta的一起温育。进行类似的有肽p3和没有肽p3的反应，并运行sds-page。该凝胶用于将蛋白质转移到pvdf膜上(bio rad，目录号：88018)。使用ace-2抗体(sino bio，目录号：10108-r003)印迹该膜的ace-2，使用抗刺突抗体(mp biomedicals目录号0720302)印迹刺突s1蛋白，抗人β-微管蛋白抗体(sino bio，目录号：100109-mm05t)作为对照。如图7a所示的结果表明，在肽seq id no:3(p3)存在的情况下，ace-2受体和sars-cov2的刺突s1蛋白之间的相互作用被阻断。
[0096]
如图7b(ii)-标号20所示，用表达ace-2的细胞hek293细胞进行实验。通过超声裂解hek293细胞，将这些裂解的蛋白与结合刺突s1蛋白的镍nta的一起温育。进行类似的有肽p4和没有肽p4的反应，并运行sds-page。该凝胶用于将蛋白质转移到pvdf膜上(bio rad，目录号：88018)。使用ace-2抗体(sino bio，目录号：10108-r003)印迹该膜的ace-2，使用抗刺突抗体(mp biomedicals目录号0720302)印迹刺突s1蛋白，抗人β-微管蛋白抗体(sino bio，目录号：100109-mm05t)作为对照。如图7b(iii)标号21所示的结果表明，在肽seq id no:4(p4)存在的情况下，ace-2受体和sars-cov2的刺突s1蛋白之间的相互作用被阻断。
[0097]
实施例8：结合两种肽或蛋白质以形成肽复合物的方案
[0098]
如常规已知的，在酸性ph下的蛋白质或肽倾向于解折叠，并在碱性ph下制备相同的混合物时重新折叠成天然结构。在本实验中，在2mm硼酸钠中在ph5.8下，取seq id no:3的肽3和seq id no:4的肽4。在该ph下肽解折叠，然后用0.1m氢氧化钠溶液将混合物ph缓慢调整至8。观察到组合的两种肽seq id no:3和seq id no:4倾向于利用范德华力聚集在一起形成肽复合物并形成单个分子。将seq id no:3和seq id no:4的组合肽复合物进一步用于实验，以研究组合肽复合物对ace-2受体结合的影响。
[0099]
实施例9：组合肽，即seq id no:3和seq id no:4的肽复合物对与刺突s1蛋白结合的ace-2受体的影响。
[0100]
研究了seq id no:3和seq id no:4的组合肽复合物对ace-2受体结合的影响。如图8所示，观察到在存在seq id no:3和seq id no:4的组合肽复合物的情况下，即使在1ng
浓度下，与刺突s1蛋白结合的ace-2受体也被完全阻断。
[0101]
根据本发明的一个实施方式，在本发明的肽seq id no:3(p3)或肽seq id no:4(p4)或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物存在的情况下，人ace-2受体和刺突s1蛋白之间的相互作用被阻断。根据本发明的一个实施方式，产生两种蛋白质之间的相互作用和高度重复的氨基酸的过程可以用作肽设计的骨架。
[0102]
以上对本发明具体实施方式的描述是为了说明和描述的目的。它们并不旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式，并且根据上述教导，显然可以进行许多修改和变化。
[0103]
选择和描述实施方式是为了最佳地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够最佳地利用本发明和各种实施方式，并进行适合于所设想的特定用途的各种修改。
[0104]
应当理解的是，当根据情况或情况变得有利时，可以考虑各种省略和用等同物进行替换，但是这旨在涵盖应用或实施，而不脱离本发明的精神或范围。

技术特征：
1.一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的模拟肽，其包含seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的模拟肽，其是包含seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的肽复合物。3.一种特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的具有seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽。4.如权利要求3所述的特异性结合sars cov2病毒的s1刺突蛋白的缀合物，其是与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的具有seq id no:3和seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽复合物。5.一种药物组合物，其包括：seq id no:3、seq id no:4的模拟肽，或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，以及药学上可接受的载体。6.如权利要求5所述的药物组合物，其是缀合物，所述缀合物包含与10nm至20nm的纳米颗粒缀合的具有seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，以及药学上可接受的载体。7.如权利要求5或6所述的药物组合物，其中，药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇、选自糖、多元醇的等渗剂，所述多元醇为例如甘露醇、山梨糖醇或其组合。8.一种抑制受试者中sars cov2感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，或施用有效量的缀合物，所述缀合物包括seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制或阻断所述受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。9.一种治疗或实现预防受试者中sars cov2感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的seq id no:3或seq id no:4的模拟肽或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，或施用有效量的缀合物，所述缀合物包括seq id no:3或seq id no:4或包含seq id no:3和seq id no:4的肽复合物，从而抑制或阻断所述受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用。10.包含seq id no:3、seq id no:4的氨基酸序列的模拟肽或seq id no:3和seq id no:4的肽复合物在抑制或阻断受试者中sars-cov2刺突蛋白与宿主细胞的ace-2受体的相互作用中的用途。

技术总结
本发明提供了肽及其缀合物，如模拟肽的ACE-2和S1亚基，用于通过阻止严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV2)与靶细胞的结合来预防和控制严重急性呼吸综合征冠状病毒-2感染。染。染。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：纽奥姆肽私人有限公司
技术研发日：2021.10.28
技术公布日：2023/8/24