一种中药组合物在制备调节SRC表达水平的药物中的应用的制作方法

一种中药组合物在制备调节src表达水平的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于人用中药技术领域，具体涉及一种中药组合物新的治疗用途。


背景技术：

2.随着医药技术的不断进步，越来越多的新药上市为人类的健康提供保障，与此同时，药物研发的成本也与日俱增，新药的研发愈加困难。因此，对已有药物新用途的开发成为近年来的发展趋势。
3.中国专利cn1778358a公开了一种治疗前列腺增生的药物及其制备方法，所述药物是由原料药黄芪、滑石、夏枯草、女贞子、荔枝核、琥珀、肉桂、黄柏制备而成，可明显降低前列腺重量和指数，明显缩小前列腺腺腔面积，对大、小鼠前列腺增生模型均有明显减轻作用；对大鼠细菌性前列腺炎模型和非细菌性前列腺炎模型均有较强的抗炎作用；对水负荷大鼠有利尿和促进尿液中na
+
、k
+
、cl
－
离子的排泄作用；对耳廓微循环障碍有明显改善作用；有抗急性炎症作用；有镇痛作用。
4.人类基因编码中包含了 518 种蛋白激酶的基因，它们参与人体的各种生理活动，对维持人体正常生理功能的进行起着非常重要的作用。在蛋白激酶中，存在一类通过自身的酪氨酸残基与 atp 相互作用，从而催化蛋白磷酸化反应的激酶。由于其作用位点均为酪氨酸残基，这一类激酶被称为酪氨酸蛋白激酶。酪氨酸蛋白激酶主要参与细胞的生长、分化和增殖，对细胞的正常生理活动进行起着重要的作用。迄今为止，已发现的酪氨酸蛋白激酶大多属于原癌蛋白家族，在肿瘤的发生、增殖、恶化过程中都起着重要作用。src 激酶家族属于酪氨酸蛋白激酶，其具有蛋白激酶共同的结构以及特性。
5.src 家族属于酪氨酸蛋白激酶，其最早发现于 rous 肉瘤(sarcoma)，src 也因此而得名。随着研究的深入，src 激酶家族的其他成员渐渐为人们所认知，如 blk、fgr、hck、c-src、c-yes 等。src 对癌细胞的生长、增值、血管生成以及细胞迁移等方面都有着调节作用，成为抗肿瘤药物研究的重要靶点以及热门方向。从结构上来看，src 家族的成员都拥有相似的结构，其具有一个独特 n端末区，与之相连的是 2 个保守的 src 同源结构域（sh3 和 sh2），然后再与其蛋白激酶活性区（ptk 区，也称sh1 区）相连，再连接到一个具有保守酪氨酸磷酸化位点的 c 端。在正常细胞中，sh2 区与 c 端的 tyr527 相结合，tyr527 与 ptk区磷酸化结合，这样使得整个分子呈卷曲状，tyr527 与 sh2 区结合后将 ptk 区包裹在中间，使得其活性无法得到表达，整个分子活性处于抑制状态。当分子接受外界刺激，如当其遇到受体型酪氨酸激酶（vegfr、egfr 等）时，这些酪氨酸激酶与 tyr527 的磷酸基团作用，使得 tyr527 去磷酸化，从而与 sh2 区的结合消失，src 激酶活性得到释放；另外，当 src 遇到磷酸化的酪氨酸蛋白激酶时，这些蛋白激酶与 tyr527 竞争结合 sh2 区，也使得 src 分子内的这种磷酸化作用消失，ptk 区得到裸露，从而激活 src。在癌细胞中往往能观测到 src 的过度表达，使细胞失去对自身活性反馈调节的能力。
6.src 参与众多生命活动，其涉及信号通路也多种多样。src首先在遇到 ptk(酪氨酸蛋白激酶)、pak(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)等时发生去磷酸化反应，使得其 ptk 活性区
域裸露而被激活，被激活的 src 进一步激活其下游的多种信号通路，影响细胞的各项生命活动，如细胞生长、增殖、血管生成等。因此，抑制 src 的活性有利于抑制肿瘤细胞的生长。
7.李军等人发表的题为《src在舌鳞状细胞癌组织中的表达及对舌鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用》的文章中记载了检测src 信号通路相关蛋白src 在舌鳞状细胞癌（tscc）组织中的表达水平及其对tscc细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究，结果显示src蛋白在口腔癌组织表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（p 《 0.01），实验中入选病例均为口腔癌中最为常见的舌鳞状细胞癌患者。
8.罗华荣等人发表的题为《ros /src /fak 信号通路在膀胱癌疾病进展中的作用机制研究》一文中采用免疫组化检测了膀胱癌组合、癌旁组织中src的阳性表达，结果显示，膀胱癌患者癌组织中src阳性表达率显著高于癌旁组织。
9.在郭建南发表的题为《胃腺癌组织中 fmnl2、src 和 cortactin 的表达及其临床意义》的硕士学位论文中，通过研究 formin-like2（fmnl2）、src 和 cortactin 在 60 例癌旁正常胃黏膜组织和 113 例胃腺癌组织中的表达情况，探讨它们之间是否存在联系及其与患者临床病理参数的关系，结果显示，src 在胃腺癌中呈现出的阳性表达百分比显著高于其癌旁正常的胃组织，说明 src蛋白可能导致了胃腺癌的发生，并促进了它的发展。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种中国专利cn1778358a中公开的中药组合物的新用途。
11.本发明所述中药组合物即中国专利cn1778358a中公开了的组合物，以重量份数计，所述中药组合物的原料组成为：黄芪30-150份、滑石7-28份、夏枯草10-40份、女贞子7-28份、荔枝核10-40份、琥珀1-4份、肉桂1.5-6份、黄柏3-15份。
12.以重量份数计，所述中药组合物的原料组成优选为：黄芪70份、滑石14份、夏枯草21份、女贞子14份、荔枝核21份、琥珀2.1份、肉桂2.8份、黄柏7份。
13.以重量份数计，所述中药组合物的原料组成还可以优选为：黄芪30份、滑石7份、夏枯草10份、女贞子7份、荔枝核10份、琥珀1份、肉桂1.5份、黄柏3份。
14.以重量份数计，所述中药组合物的原料组成还可以优选为：黄芪150份、滑石28份、夏枯草40份、女贞子28份、荔枝核40份、琥珀4份、肉桂6份、黄柏15份。
15.本发明所述中药组合物的剂型包括胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂、口服液。
16.上述中药组合物胶囊剂的制备方法，包括以下步骤：1) 、取组方中原料药材，分别选净，粉碎，按组方量称量；2) 、取黄芪、黄柏，加50-70% 乙醇，加热回流提取1-3 次，第一次加8-12 倍量，提取1-3 小时，第二次加6-9 倍量，提取0. 5-2 小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25 的清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa 条件下减压干燥，干膏备用；3) 、取女贞子，加6-10 倍量70-90% 乙醇，加热回流提取1-3 次，时间为每次1-3 小时，提取液滤过，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1. 20-1. 25 的清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.01-0.06mpa 条件下减压干燥，干膏备用；4) 、取肉桂，加4-8 倍量水浸泡1-2 小时后，提取挥发油2-6 小时，挥发油另器收集，出油率不得少于l. 0%，水提取液过滤收集，残渣备用；
5) 、取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8-10 倍量水，煎煮二次，第一次1-3 小时，第二次1-2 小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25 的清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa 条件下减压干燥，干膏与黄芪、黄柏、女贞子干膏粉碎成100 目粉备用；6) 、取滑石、琥珀，粉碎成100 目粉，备用；7) 、取干膏粉、原药粉和淀粉，混和均匀，用80% 乙醇为粘合剂，高速搅拌制粒， 60-70℃烘干，整粒；8) 、筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀，密闭，装胶囊，即得。
17.本发明提供了上述中药组合物在制备调节src表达水平的药物中的应用。
18.优选地，本发明提供了上述中药组合物在制备上调src mrna表达水平的药物中的应用。所述上调src mrna表达水平的药物的作用浓度为1667μg/ml，作用溶剂为pbs。或者所述上调src mrna表达水平的药物的作用浓度为200μg/ml，作用溶剂为dmso。
19.优选地，本发明提供了上述中药组合物在制备上调src 蛋白表达水平的药物中的应用。所述上调src 蛋白表达水平的药物的作用浓度为200μg/ml，作用溶剂为dmso。
20.本发明在人脐静脉内皮细胞实验中意外发现了本发明中药组合物对目标靶点src的作用，结果显示该中药组合物对src的表达水平具有调节作用，尤其对src mrna表达水平具有显著升高的作用，对src蛋白表达水平具有显著升高的作用。
21.依据本发明实验的结果，结合现有技术中公开的src蛋白与疾病的关系，可以得出，本发明的中药组合物能够用于预防和/或治疗与src表达相关的疾病。本发明所述与src相关的疾病主要指癌症，包括口腔癌、膀胱癌、胃腺癌。口腔癌主要指舌鳞状细胞癌。本发明的中药组合物通过降低src蛋白的表达实现预防和/或治疗癌症的目的，安全有效。
附图说明
22.图1为实施例4中pbs溶剂zhw干预组各浓度细胞的生存活性结果。
23.图2为实施例4中dmso溶剂zhw干预组各浓度细胞的生存活性结果。
24.图3为实施例4中供试品对各组细胞目标靶点src mrna表达水平的诱导作用结果。
25.图4为实施例4中供试品对各组细胞目标靶点src 蛋白表达水平的诱导作用结果。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
27.实施例1中药组合物胶囊剂的制备原料配方：黄芪700g 、滑石140g、夏枯草210g、 女贞子140g、荔枝核210g、琥珀21g、肉桂28g、黄柏70g。
28.制备方法：1)、取方中药材，分别选净，粉碎成5-10mm颗粒，按处方量称量；2)、取黄芪、黄柏，加60％乙醇，加热回流提取2次，第一次加10倍量，提取2小时，第二次加8倍量，提取1小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25(60℃热测)清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa条件下减压干燥，干膏备用；
3)、取女贞子，加8倍量80％乙醇，加热回流提取2次，时间为每次2小时，提取液滤过，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1.20-1.25(60℃热测)清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa条件下减压干燥，干膏备用；4)、取肉桂，加6倍量水浸泡1小时后，提取挥发油4小时，挥发油另器收集，出油率不得少于1.0％，水提取液过滤收集，残渣备用；5)、取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加9倍量水，煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25(60℃热测)清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa条件下减压干燥，干膏与黄芪、黄柏、女贞子干膏粉碎成100目粉备用；6)、取滑石、琥珀，粉碎成100目粉，备用；7)、取干膏粉、原药粉和淀粉，混和均匀，用80％乙醇为粘合剂，高速搅拌制粒，60-70℃烘干，20目筛网整粒；8)、筛出细粉适量，喷入挥发油，与颗粒混合均匀，密闭0.5小时，装胶囊，即得。
29.实施例2片剂的制备原料配方：黄芪300g、滑石70g、夏枯草100g、女贞子70g、荔枝核100g、琥珀10g、肉桂15g、黄柏30g。
30.制备方法：按常规制剂方法制成片剂。
31.实施例3 丸剂的制备原料配方：黄芪150g、滑石280g、夏枯草400g、女贞子280g、荔枝核40g、琥珀40g、肉桂60g、黄柏150g。
32.制备方法：按常规制剂方法制成丸剂。
33.实施例4一、实验材料1、供试品：按照实施例1制备得到的胶囊剂的内容物（zhw）。
34.2、供试细胞：人脐静脉血管内皮细胞株（huvec），购自中科院上海细胞库。
35.3、主要仪器设备4、主要试剂
5、引物序列二、实验方法1、主要溶液配制（1）pbs-zhw储备液：称取供试品胶囊内容物900mg，溶于4.5ml磷酸缓冲盐溶液（pbs）中，搅拌均匀，超声促溶0.5h，5000rpm离心30min，收集离心后的上层药物溶液，0.22μm微孔滤器过滤除菌，得到浓度为200mg/ml的zhw储备液；分装，-20℃贮存备用。实验前用无血清培养基稀释成所需工作液浓度。（2）dmso-zhw储备液：称取供试品胶囊内容物900mg，溶于4.5ml二甲基亚砜（dmso）中，搅拌均匀，超声促溶0.5h，5000rpm离心30min，收集离心后的上层药物溶液，0.22μm微孔滤器过滤除菌，得到浓度为200mg/ml的zhw储备液；分装，-20℃贮存备用，实验前用无血清培养基稀释成所需工作液浓度。
36.2、huvec细胞培养从液氮中迅速取出装有huvec细胞的冻存管，立即放入37℃水浴快速解冻约1min，700rpm离心3min，75%酒精擦试冻存管后，移入超净工作台，去除冻存液，加入dmem完全培养基（含10%胎牛血清、1%青链双抗），吹打均匀后转入培养皿，置于37℃、5%co2恒温细胞培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞状态，按1:2～1:3比例传代。取传代后生长状态良好的细胞用于实验。
37.3、安全剂量的确定3.1pbs-zhw安全剂量的确定将huvec接种于96孔细胞培养板中（1
×
105个/ml，100μl/孔）培养24小时后，将细胞分为以下几组（每组平行设置3个复孔）：（1）正常对照组（control）：用无血清dmem培养基继续培养24h。
38.（2）zhw干预组：分别用含相应浓度（78.13μg/ml、156.25μg/ml、312.50μg/ml、625μg/ml、1250μg/ml、2500μg/ml、5000μg/ml、10000μg/ml、20000μg/ml）供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
39.附图1给出了各浓度组细胞的生存活性，与control组比较，供试品胶囊内容物10000μg/ml剂量组huvec细胞生存活性显著降低。故后续实验以最大安全剂量5000μg/ml为pbs-zhw高剂量组，经3倍梯度稀释，以1667μg/ml为pbs-zhw中剂量组、以556μg/ml为pbs-zhw低剂量组。
40.3.2dmso-zhw安全剂量的确定将huvec接种于96孔细胞培养板中（1
×
105个/ml，100μl/孔）培养24小时后，将细胞分为以下几组（每组平行设置3个复孔）：（1）正常对照组（control）：用无血清dmem培养基继续培养24h。
41.（2）溶剂对照组（dmso）：用含0.1%dmso的无血清dmem培养基继续培养24h。
42.（3）zhw干预组：分别用含相应浓度（1.56μg/ml、3.13μg/ml、6.25μg/ml、12.50μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
43.附图2给出了各浓度组细胞的生存活性，与control组比较，供试品胶囊内容物dmso溶剂各组huvec细胞生存活性均无显著变化。故后续实验以200μg/ml为dmso-zhw高剂量组，经3倍梯度稀释，以67μg/ml为dmso-zhw中剂量组、以22μg/ml为dmso-zhw低剂量组。
44.4、实验分组将huvec接种于细胞培养皿中（1
×
105个/ml）培养24小时后，将细胞分为以下几组：（1）正常对照组（control）：用无血清dmem培养基继续培养24h。
45.（2）pbs-zhw低剂量组（pl）：用含556μg/ml供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
46.（3）pbs-zhw中剂量组（pm）：用含1667μg/ml供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
47.（4）pbs-zhw高剂量组（ph）：用含5000μg/ml供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
48.（5）dmso-zhw低剂量组（dl）：用含22μg/ml供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
49.（6）dmso-zhw中剂量组（dm）：用含67μg/ml供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
50.（7）dmso-zhw高剂量组（dh）：用含200μg/ml供试品胶囊内容物的无血清dmem培养基继续培养24h。
51.5、指标检测5.1celltitergloluminescentcellviabilityassay检测细胞生存活性实验结束后，将细胞培养板在室温平衡30min，弃去旧培养基，每孔加入含有atp检测试剂的无血清培养基（atp溶液：培养基=1:1）100
µ
l，振荡器混匀2min，室温孵育10
min，酶标仪检测荧光强度。实验操作严格按照celltitergloluminescentcellviabilityassay试剂检测说明书进行。各孔细胞生存活性计算公式如下：5.2实时荧光定量pcr检测目标靶点基因表达水平实验结束后，收集细胞并按照rna提取试剂盒说明书步骤提取rna；参照primescriptrtreagentkit说明书进行cdna的反转录；参照tbgreenpremixextaqii说明书的方法进行real-timepcr，以gapdh为内参，采用2
‑△△
ct
法分析基因表达水平。
52.5.3westernblot检测目标靶点蛋白表达水平实验结束后，收集细胞并提取细胞蛋白，bca法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液置于金属浴中100℃，5min变性，分装，-80℃冰箱保存。取20ml蛋白进行sds-page并转印至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后用相应的特异性一抗孵育后，加入相应的荧光二抗并用odyssey9120双色红外激光成像系统检测目的蛋白含量。actin或gapdh作为内参，以各目的蛋白吸光度值与内参吸光度值的比值进行统计分析。
53.三、数据处理采用spss19分析软件进行统计学分析，graphpadprism5软件进行绘图。各个指标数据的计算结果用均数
±
标准差（）表示，各组间均数比较用单因素方差分析（anova），组间两两比较采用最小显著性差异法（lsd法），以p《0.05为有统计学差异。
54.四、实验结果1、供试品对目标靶点srcmrna表达水平的诱导作用结果如表4和附图3所示，与control组比较，pbs-zhw中剂量组、dmso-zhw高剂量组细胞的srcmrna表达水平均显著升高。
55.2、供试品对目标靶点src蛋白表达水平的诱导作用结果如表5和图4所示，与control组比较，dmso-zhw高剂量组细胞src蛋白表达水平显著升高。

技术特征：
3 小时，第二次加6-9 倍量，提取0. 5-2 小时，提取液过滤，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1. 20-1. 25 的清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa 条件下减压干燥，干膏备用；3) 、取女贞子，加6-10 倍量70-90% 乙醇，加热回流提取1-3 次，时间为每次1-3 小时，提取液滤过，合并，减压回收乙醇后，浓缩成相对密度为1. 20-1. 25 的清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.01-0.06mpa 条件下减压干燥，干膏备用；4) 、取肉桂，加4-8 倍量水浸泡1-2 小时后，提取挥发油2-6 小时，挥发油另器收集，出油率不得少于l. 0%，水提取液过滤收集，残渣备用；5) 、取夏枯草、荔枝核及肉桂提油后的残渣，加8-10 倍量水，煎煮二次，第一次1-3 小时，第二次1-2 小时，提取液过滤，合并，加入肉桂提油后的水溶液，浓缩成相对密度为1.20-1.25 的清膏，放入真空干燥箱，在温度60-70℃，真空度0.04-0.06mpa 条件下减压干燥，干膏与黄芪、黄柏、女贞子干膏粉碎成100 目粉备用；6) 、取滑石、琥珀，粉碎成100 目粉，备用；7) 、取干膏粉、原药粉和淀粉，混和均匀，用80% 乙醇为粘合剂，高速搅拌制粒， 60-70℃烘干，整粒；8) 、筛出细粉，喷入挥发油，与颗粒混合均匀，密闭，装胶囊，即得。

技术总结
本发明公开了一种中药组合物在制备调节SRC表达水平的药物中的应用，该中药组合物的原料组成为：黄芪、滑石、夏枯草、女贞子、荔枝核、琥珀、肉桂、黄柏，本发明提供了该中药组合物在制备调节SRC表达水平的药物中的应用。本发明采用人脐静脉内皮细胞实验了该中药组合物胶囊对目标靶点SRC的作用，结果显示该组合物对SRC的表达水平具有调节作用，尤其对SRC mRNA表达水平具有显著升高的作用，对SRC蛋白表达水平具有显著升高的作用。表达水平具有显著升高的作用。


技术研发人员：贾振华 姚兵 梁俊清 宋燕飞
受保护的技术使用者：河北以岭医药研究院有限公司
技术研发日：2022.06.13
技术公布日：2023/8/24