一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用。


背景技术：

2.逆转录酶是科学研究和医学检验分析中常用的一种工具酶，以rna为模板合成cdna，在现代生物技术领域发挥着重要作用，被广泛应用于转录组分析、病原体检测等各种场景。目前最常用的是来自莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，mmlv)的逆转录酶(reverse transcriptase)。mmlv逆转录酶在1970年被edward scolnick发现，被证实具有以rna为模板合成dna的逆转录活性、以dna为模板合成dna的聚合酶活性和在rna/dna杂合链中水解rna的rnaseh活性。尽管迄今为止发现的逆转录酶有数十种，但mmlv逆转录酶俨然是最常用的，已成为逆转录催化研究的模式酶。相较于其他逆转录酶，mmlv逆转录酶具有更强的逆转录活性，并且表达纯化工艺更适于商业化。尽管与其他逆转录酶相比，mmlv逆转录酶综合性能更好，但其野生型热稳定性差、扩增效率不够高、合成的产物少等问题依然对各种应用场景造成掣肘。因此，各种研究致力于改进mmlv逆转录酶的性能，使其能适用于更多的应用场景。目前研究较多的是提高逆转录酶的热稳定性，对于提高酶活力和扩增效率的研究较少。而在提高热稳定性时，往往又会发现一些氨基酸位点的突变会导致逆转录酶活性降低，热稳定性和酶活力难以兼得。
3.综上所述，目前现有野生型mmlv逆转录酶存在，酶活性低、扩增效率低、合成的产物少等问题，难以适用于多种技术应用场景。如何提供一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其制备方法，获得催化活性高，扩增效率高的鼠白血病病毒逆转录酶突变体已成为目前生物技术领域亟待解决的问题之一。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用，解决了现有野生型mmlv逆转录酶存在的扩增效率差、灵敏度低，产量少等问题，获得的突变型逆转录酶展示出更高的逆转录酶活性、更高的扩增效率和更多的cdna产物。
5.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供了一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变：
7.p127、t128、l203、a46、s60、l207、d216、a254、d339、q345、t420、a439、l452、a481、a500、g504、p515、a589、t590、a591、g602、l604、t605、s606或g608中任意一种或至少两种的组合。
8.本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高鼠白血病病毒逆转录酶突变体的逆转录酶活力，在相同的酶量投入下能够实现更佳的扩增效率，能够生成更多的逆转录产物。
9.本发明中，所述seq id no.1所示的氨基酸序列如下：
10.tlniedehrlhetskepdvslgstwlsdfpqawaetggmglavrqapliiplkatstpvsikqypmsqearlgikphiqrlldqgilvpcqspwntpllpvkkpgtndyrpvqdlrevnkrvedihptvpnpynllsglppshqwytvldlkdaffclrlhptsqplfafewrdpemgisgqltwtrlpqgfknsptlfdealhrdladfriqhpdlillqyvddlllaatseldcqqgtrallqtlgnlgyrasakkaqicqkqvkylgyllkegqrwltearketvmgqptpktprqlreflgtagfcrlwipgfaemaaplypltktgtlfnwgpdqqkayqeikqalltapalglpdltkpfelfvdekqgyakgvltqklgpwrrpvaylskkldpvaagwppclrmvaaiavltkdagkltmgqplvilaphavealvkqppdrwlsnarmthyqallldtdrvqfgpvvalnpatllplpeeglqhncldilaeahgtrpdltdqplpdadhtwytdgssllqegqrkagaavtteteviwakalpagtsaqraelialtqalkmaegkklnvytdsryafatahihgeiyrrrglltsegkeiknkdeilallkalflpkrlsiihcpghqkghsaeargnrmadqaarkaaitetpdtstll。
11.在本发明的一些实施例中，突变前的氨基酸序列不限定于与seq id no.1完全相同，例如，由与seq id no.1氨基酸序列一致性为90％以上、优选的95％以上、进一步优选的98％以上的氨基酸序列均是有效的。
12.优选地，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变：
13.所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下位点突变：
14.p127s、t128n、l203f、a46p、s60k或s60r或s60h、l207f、d216q、a254v、d339e、q345d或q345e、t420v、a439t、l452c或l452k或l452r或l452h、a481d或a481e、a500p、g504p、p515l、a589k或a589r或a589h、t590i、a591v、g602p、l604g或l604n或l604y或l604d或l604e、t605d或t605e或t605s或t605r或t605k或t605i或t605p或t605v、s606r或s606v或s606g或s606f或s606h或s606k、g608s或g608r或g608k中任意一种或至少两种的组合。
15.优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：
16.p127、l203、a46、l207、d216、a254、d339、q345、a439、l452、a500、g504、t590、a591、g602、l604、t605、s606或g608中任意一种或至少两种的组合。
17.优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：
18.p127s、l203f、a46p、l207f、d216q、a254v、d339e、q345d或q345e、a439t、l452c或l452k或l452r或l452h、a500p、g504p、t590i、a591v、g602p、l604g或l604n或l604y或l604d或l604e、t605d或t605e或t605s或t605r或t605k或t605i或t605p或t605v、s606r或s606v或s606g或s606f或s606h或s606k、g608s或g608r或g608k中任意一种或至少两种的组合。
19.优选地，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上还发生包括如下突变：
20.m39、s56、m66、p111、v129、l139、d200、t287、g308、t330、d449、s453、n479、a502、d524、v580、d583、h594、l603、e610、i611或h634中任意一种或至少两种的组合。
21.优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：
22.m39v、s56a、m66l、p111l、v129r、l139p、d200h或d200q、t287a、g308d、t330p、d449g、s453r或s453k或s453h、n479d、a502v、d524a、v580i、d583t、h594r或h594k或h594h、l603w、e610k、i611r或i611k或i611h或h634y中任意一种或至少两种的组合。
23.优选地，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括以下任意一种
组合位点突变：
24.(1)t420v/g602p/l603w/l604d；
25.(2)g608k/i611r；
26.(3)g308d/n479d/g608s/i611r/h634y；
27.(4)d216q/a589k/g608s/i611r；
28.(5)s453k/d449g/g504p/d524a/h594k/a589r/s606k；
29.(6)s60r/g608s/i611r；
30.(7)a591v/t605d/s606r；
31.(8)l604n/t605r；
32.(9)l604g/t605s/s606v。
33.第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码序列。
34.第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
35.第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子和/或第三方面所述的重组载体。
36.第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体。
37.优选地，所述试剂盒用于以rna为模板合成cdna。
38.第六方面，本发明提供了第一方面所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用。
39.优选地，所述逆转录反应包括rt-pcr、rt-qpcr或rt-lamp中的任意一种。
40.所述突变体具有提高的逆转录酶比活力。
41.优选地，所述突变体还包括以下一个或至少两个的特性的提高：热稳定性、灵敏度、持续合成能力、逆转录速度。
42.优选地，所述突变体缺失rnaseh活性。
43.mmlv逆转录酶同时具有以rna为模板合成dna的逆转录活性、以dna为模板合成dna的dna聚合酶活性和降解dna-rna杂合链中rna链的rnaseh活性。mmlv逆转录酶的催化机制是复杂的，在合成反应中涉及到模板/引物的识别和结合、脱氧核糖核苷酸的匹配、磷酸二酯键的形成等一系列连贯的过程。在本发明的一些实施例中，发现了一些涉及底物相互作用的有益于逆转录酶酶活力提升的氨基酸替换。
44.本发明的一些实施例中，酶活力优异的突变型mmlv逆转录酶由理性设计得到。所用理性设计的策略是根据模板或引物的结合区域、rnaseh结构域等涉及模板或引物的结合区域，或参与底物的相互作用等的一种或多种。
45.本发明的一些实施例中，酶活力优异的突变型mmlv逆转录酶由半理性设计得到。所用半理性设计的策略是根据理性设计分析，选择重要的氨基酸位点进行饱和突变。
46.本发明的一些实施例中，酶活力优异的突变型mmlv逆转录酶由定向进化得到。所用策略是构建mmlv逆转录酶的全长随机突变库，并通过高通量定向进化的方法筛选酶活力优异的突变体。
47.本发明通过理性设计、半理性设计和定向进化的方法获得了对mmlv逆转录酶酶活力提升有益的突变体，经过分析，突变位点主要通过以下一种或多种途径影响mmlv逆转录酶的酶活力。
48.在本发明一些实施例中，酶活力提高的突变型逆转录酶在相对于野生型的第111位、第127位、第128位、第287位、第308位、第330位、第452位、第453位、第583位、第589位、第590位、第591位、第594位、第602位、第603位、第604位、第605位、第606位、第608位、第610位、第611位、第634位的一个或者多个位置氨基酸发生替换。这些位置主要分布于模板或引物的结合区域，参与底物的相互作用。
49.mmlv逆转录酶在rnaseh活性失活后(d524a)，rnaseh结构域不发挥rnaseh活性，但它的存在对于整个逆转录酶的稳定性和催化活性依然十分重要。本发明一些实施例中的第589位、第590位、第591位、第594位、第602位、第603位、第604位、第605位、第606位、第608位、第610位、第611位第634位氨基酸替换就发生于rnaseh结构域且参与底物相互作用，这些位置的氨基酸替换显著提升了逆转录酶的活性。
50.在本发明的一些实施例中，酶活力提高的突变型逆转录酶在相对于野生型的第39位、第46位、第60位、第66位、第139位、第203位、第207位、第216位、第254位、第339位、第345位、第420位、第439位、第479位、第481位、第500位、第504位、第515位和第580位的一个或者多个位置发生氨基酸替换，这些位置在酶的晶体结构中不直接涉及模板或引物的相互作用，其大部分位于蛋白质表面或者其他区域的无序区。目前尚不清楚这些位置的氨基酸替换提高酶活力的具体机理，推测可能通过提高酶的构象稳定性或溶解度来提升比活力。
51.在本发明的一些实施例中，上述明确涉及模板或引物相互作用的氨基酸替换策略和不涉及模板或引物相互作用的氨基酸替换策略均能提高mmlv逆转录酶的酶活力，不限于每种策略一个或多个位点同时进行替换，也不限于多种策略独立实施或者组合实施，于提高酶活力有益的方式均适用。
52.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
53.(1)本发明通过氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高鼠白血病病毒逆转录酶突变体的酶活力，在相同的酶量投入下能够实现更佳的扩增效率，能够生成更多的逆转录产物；
54.(2)本发明的突变型逆转录酶有更高的逆转录酶活性，同时具有以下一个或者多个特性的提高：a.热稳定性；b.灵敏度；c.持续合成能力；d.逆转录速度。
附图说明
55.图1为野生型和突变型mmlv逆转录酶的比活力图；
56.图2为野生型和突变型mmlv逆转录酶的比活力比较图；
57.图3为野生型和突变型mmlv逆转录酶cdna产量图；
58.图4为mmlv逆转录酶比活力和cdna产量关系图。
具体实施方式
59.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非
对本发明的限定。
60.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
61.实施例1
62.发明人通过理性设计、半理性设计和定向进化方法多种方式结合进行mmlv逆转录酶酶活力性能的改造。通过大量的理性设计分析及实验筛选，在氨基酸序列seq id no.1的基础上进行如下氨基酸替换，获得了对酶活力提高有益的mmlv逆转录酶突变体数据库，如表1所示。表1所示氨基酸突变为在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生的突变。
63.表1
64.65.66.[0067][0068]
上述突变型mmlv逆转录酶的具体制备方法如下：将编码以上突变型mmlv逆转录酶氨基酸序列的核苷酸序列(对应的编码野生型mmlv逆转录酶氨基酸序列的核苷酸序列为seq id no.2)连接至载体pet21b(+)中获得重组载体，将重组载体转化到表达宿主大肠杆菌rosetta中，获得重组菌株。培养重组菌株，诱导mmlv逆转录酶的表达，纯化后即获得mmlv逆转录酶突变体。
[0069]
seq id no.2：
[0070]
accctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagc
agctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctctag。
[0071]
实施例2
[0072]
检测突变型逆转录酶的酶活力。
[0073]
方法：通过测定体积活力和比活力检测突变型逆转录酶的酶活力。mmlv逆转录酶酶活的定义为：在37℃下10min内将1nmol dntp转化为多核苷酸所需的酶量定义为1个酶活单位(u)。突变型逆转录酶酶活测定方法采用焦磷酸定量法，以野生型mmlv逆转录酶为参照。其原理是以单链mrna为模板，oligo dt为引物，经mmlv逆转录酶扩增后，产生dna的同时伴随着焦磷酸的产生。采用焦磷酸试剂盒对产物进行定量时，产生的荧光值与焦磷酸成正比，即所测得的荧光值与逆转录酶活成正比。
[0074]
焦磷酸检测试剂盒购自aat bioquest，mmlv逆转录酶酶活的测试具体实施方式如下：
[0075]
(1)将mmlv逆转录酶根据蛋白质浓度稀释成若干浓度梯度；
[0076]
(2)根据表2配制引物退火体系。
[0077]
表2
[0078]
组分用量oligo dt(50μm)(合成)1μldntps(10mm each)(yeasen)0.5μlmrna模板(自制)2μgdepc-h2o(yeasen)to13μl
[0079]
在65℃孵育5min，置于冰上静置2min。
[0080]
根据表3配制逆转录体系。
[0081]
表3
[0082]
[0083][0084]
振荡混匀，在金属浴中37℃反应15min，结束后立即置于冰上终止反应。
[0085]
焦磷酸检测：在96孔酶标板中加入48μldepc水，2μl混匀的酶反应液，50μl焦磷酸工作液，酶标仪震荡混匀后，25℃孵育20min后，用酶标仪测量荧光值，根据荧光值计算突变型逆转录酶活力。突变型mmlv逆转录酶的比活力结果如表4所示。
[0086]
表4
[0087]
[0088]
[0089][0090]
结果：和野生型逆转录酶相比，本发明实施例1中获得的突变型逆转录酶表现为比活力提高(图1)。具体而言，与野生型相比，突变编号为m31的突变体比活力提高7倍以上，突变编号为m14的突变体比活力提高5倍以上，突变编号为m18、m32的突变体比活力提高4倍以上，编号为m36、m42、m46、m48、m49的突变体比活力提高3倍以上。其余突变型逆转录酶的比活力也均有所提升。
[0091]
实施例3
[0092]
本实施例鼠白血病病毒逆转录酶突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上进行
如下氨基酸替换(表5)：
[0093]
表5
[0094]
突变编号突变位点m54k152e/t382a/g504s/d524am55s60k/k152e/t382a/g504s/d524am56k152e/t382a/g504s/d524a/l604nm57k152em58k152e/t420v/g608sm59d200q/d524a/l671pm60a46p/d200q/a500p/d524a/l671pm61d200q/d216q/d524a/t605p/l671pm62p100a/r211sm63p100a/r211s/g608s/i611k
[0095]
参照实施例2所示检测突变型逆转录酶的酶活力的方法，检测表5中各个突变型mmlv逆转录酶的比活力，突变型mmlv逆转录酶的比活力比较如表6所示。
[0096]
表6
[0097]
突变编号比活力(u/mg)突变体酶比活力/野生型比活力wt2000001m541400000.7m552680001.34
↑
m561860000.93
↑
m571600000.8m582300001.15
↑
m591800000.9m603120001.56
↑
m613120001.56
↑
m62800000.4m632100001.05
↑
[0098]
由表6数据和图2可知m54、m57、m59和m62突变型逆转录酶的酶活力较野生型弱。而将m54突变型逆转录酶的第60位的丝氨酸替换为赖氨酸或第604位的亮氨酸替换为天冬酰胺后，酶活力较m54分别提高1.9倍和1.3倍；将m57突变型逆转录酶的第420位苏氨酸替换为缬氨酸和第608位的甘氨酸替换为丝氨酸后，酶活力较m57提高1.4倍；将m59突变型逆转录酶的第46位和第500位、或第605位的丙氨酸替换为脯氨酸后，酶活力较m59分别提高1.7倍和1.7倍；将m62突变型逆转录酶的第608位甘氨酸替换为丝氨酸和第611位的异亮氨酸替换为赖氨酸，酶活力较m62提高2.6倍。说明本发明公开的有益于酶活力提高的氨基酸替换与已知酶活力较野生型差的突变型逆转录酶结合，同样有助于提升突变体的酶活力。
[0099]
实施例4
[0100]
挑选实施例1中获得的突变体进行逆转录反应，检测逆转录后cdna产量，其中以野生型mmlv逆转录酶为对照。逆转录体系如表7所示。
[0101]
表7
[0102]
组分用量oligo dt(50μm)1μldntps(10mm each)0.5μlmrna2μg5
×
rt buffer4μl逆转录酶0.1μgdepc-h2oto20μl
[0103]
先将逆转录酶稀释至相同的蛋白质浓度，以便在反应中加入同等体积。然后将上述体系中除逆转录酶之外的其他组分配制成mix，再分装至96孔板中，最后加入相同体积的酶液。反应体系在42℃下反应10min，然后于85℃处理5min。
[0104]
逆转录完成后，检测产物中双链dna的产量。本实施例中双链dna检测试剂盒购自翌圣生物(picogreen dsdna quantitation reagent双链dna(dsdna)定量试剂)。检测双链dna产量的具体实施过程如下：将双链dna试剂解冻后，根据用量取双链dna试剂用ddh2o稀释100倍制成检测液。在黑色96孔酶标板中每孔添加98μl检测液及2μl上述逆转录反应产物，混匀后于室温孵育5min，在ex/em＝480nm/520nm(auto cutoff)条件下测定荧光值。荧光值与双链dna浓度成正比。
[0105]
突变型mmlv逆转录酶在相同蛋白浓度下的cdna产量如下表8所示。
[0106]
表8
[0107]
[0108][0109]
由表8和图3、图4可以看出，在相同蛋白浓度下，mmlv逆转录酶的比活力越高，其逆转录生成的cdna产量也越高，能够实现更佳的扩增效果，得到更多的cdna产物。
[0110]
综上所述，本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高鼠白血病病毒逆转录酶突变体的酶活力，在相同的酶量投入下能够实现更佳的扩增效率，生成更多的逆转录产物，对于低模板量的逆转录反应比如单细胞转录组测序、cdna建库有更好的应用效果。
[0111]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下位点突变：p127、t128、l203、a46、s60、l207、d216、a254、d339、q345、t420、a439、l452、a481、a500、g504、p515、a589、t590、a591、g602、l604、t605、s606或g608中任意一种或至少两种的组合。2.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下位点突变：p127s、t128n、l203f、a46p、s60k或s60r或s60h、l207f、d216q、a254v、d339e、q345d或q345e、t420v、a439t、l452c或l452k或l452r或l452h、a481d或a481e、a500p、g504p、p515l、a589k或a589r或a589h、t590i、a591v、g602p、l604g或l604n或l604y或l604d或l604e、t605d或t605e或t605s或t605r或t605k或t605i或t605p或t605v、s606r或s606v或s606g或s606f或s606h或s606k、g608s或g608r或g608k中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：p127、l203、a46、l207、d216、a254、d339、q345、a439、l452、a500、g504、t590、a591、g602、l604、t605、s606或g608中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：p127s、l203f、a46p、l207f、d216q、a254v、d339e、q345d或q345e、a439t、l452c或l452k或l452r或l452h、a500p、g504p、t590i、a591v、g602p、l604g或l604n或l604y或l604d或l604e、t605d或t605e或t605s或t605r或t605k或t605i或t605p或t605v、s606r或s606v或s606g或s606f或s606h或s606k、g608s或g608r或g608k中任意一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上还发生包括如下突变：m39、s56、m66、p111、v129、l139、d200、t287、g308、t330、d449、s453、n479、a502、d524、v580、d583、h594、l603、e610、i611或h634中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述突变体与seq id no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括如下突变：m39v、s56a、m66l、p111l、v129r、l139p、d200h或d200q、t287a、g308d、t330p、d449g、s453r或s453k或s453h、n479d、a502v、d524a、v580i、d583t、h594r或h594k或h594h、l603w、e610k、i611r或i611k或i611h或h634y中任意一种或至少两种的组合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：(1)t420v/g602p/l603w/l604d；(2)g608k/i611r；(3)g308d/n479d/g608s/i611r/h634y；(4)d216q/a589k/g608s/i611r；(5)s453k/d449g/g504p/d524a/h594k/a589r/s606k；(6)s60r/g608s/i611r；
(7)a591v/t605d/s606r；(8)l604n/t605r；(9)l604g/t605s/s606v。5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1-4中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码序列。6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求5所述的核酸分子。7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求6所述的重组载体。8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-4中任一项中所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组载体或权利要求7所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述试剂盒用于以rna为模板合成cdna。9.权利要求1-4中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用；优选地，所述逆转录反应包括rt-pcr、rt-qpcr或rt-lamp中的任意一种。10.根据权利要求1-4中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体具有提高的逆转录酶比活力；优选地，所述突变体还包括以下一个或至少两个的特性的提高：热稳定性、灵敏度、持续合成能力、逆转录速度；优选地，所述突变体缺失rnaseh活性。

技术总结
本发明公开了一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：P127、T128、L203、A46、S60、L207、D216、A254、D339、Q345、T420、A439、L452、A481、A500、G504、P515、A589、T590、A591、G602、L604、T605、S606或G608中任意一种或至少两种的组合。本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高鼠白血病病毒逆转录酶突变体的酶活力，在相同的酶量投入下能够实现更佳的扩增效率，能够生成更多的逆转录产物。够生成更多的逆转录产物。够生成更多的逆转录产物。


技术研发人员：刘想 商曰朋 朱思思 宋春雨 阳瑜红 刘峰 修元松
受保护的技术使用者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/8/24