试剂盒及其制备方法和使用方法以及即用型测定培养基的制备方法与流程

1.本发明涉及培养基领域，具体而言，涉及一种试剂盒及其制备方法和使用方法以及即用型测定培养基的制备方法。


背景技术：

2.现有技术中，水溶性b维生素的检测在国标方法中多采用微生物方法，以叶酸为例，作为鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus(atcc 7469)生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌接种至含有试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率(或吸光度值)，根据叶酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。此方法中，维生素检测培养基的性能对最终检测结果有着关键影响。该培养基成分复杂、微量成分繁多、保质期短，对于维生素快速检测产品——即用型试剂盒而言，培养基的处理方式一直是一个难点。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的在于提供一种试剂盒及其制备方法和使用方法以及即用型测定培养基的制备方法，以解决现有技术中即用型测定培养基的稳定性差、保质期短的问题。
4.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种试剂盒的制备方法，试剂盒用以制备即用型测定培养基，即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基、维生素b
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即用型测定培养基、生物素即用型测定培养基与泛酸即用型测定培养基中的任一种，试剂盒的制备方法包括：将基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中；将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，微量成分包括光热敏感成分，光热敏感成分中包括冻干保护成分；其中，在即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基的情况下，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、三水合乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：葡萄糖、l-色氨酸、l-盐酸半胱氨酸、l-天冬氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、聚山梨酯-80、还原型谷胱甘肽、七水合硫酸镁、氯化钠、七水合硫酸亚铁、一水合硫酸锰、核黄素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、尼克酸以及生物素；在即用型测定培养基为维生素b
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即用型测定培养基的情况下，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：葡萄糖、天门冬酰胺、l-胱氨酸、dl-色氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、核黄素、盐酸硫胺素、生物素、烟酸、ρ-氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、烟酸吡哆胺、叶酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰以及聚山梨糖单油酸酯；在即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基的情况下，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：无水葡萄糖、l-胱氨酸、dl-色氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、盐酸硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、ρ-氨基苯甲酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁以及硫酸锰；在即
用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基的情况下，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：无水葡萄糖、l-胱氨酸、l-色氨酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、核黄素、盐酸硫胺素、生物素、ρ-氨基苯甲酸、烟酸、盐酸吡哆醇以及聚山梨糖单油酸酯。
5.在一个实施方式中，试剂盒用以进行维生素测定，试剂盒的制备方法还包括：将预定量的标准品装至第三试剂瓶中并制备为冻干；和/或，将预定量的检测菌球装至第四试剂瓶中并制备为冻干；其中，在即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基的情况下，标准品为叶酸标准品，检测菌球为叶酸检测菌球；在即用型测定培养基为维生素b
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即用型测定培养基的情况下，标准品为维生素b
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标准品，检测菌球为维生素b
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检测菌球；在即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基的情况下，标准品为生物素标准品，检测菌球为生物素检测菌球；在即用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基的情况下，标准品为泛酸标准品，检测菌球为泛酸检测菌球。
6.在一个实施方式中，将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，微量成分包括光热敏感成分，光热敏感成分中包括冻干保护成分，包括：将微量成分按配方配置成浓缩50倍的浓缩溶液并将预定量的浓缩溶液装入第二试剂瓶中，微量成分包括光热敏感成分，光热敏感成分中包括冻干保护成分；将第二试剂瓶放入设备中以进行冻干操作；密封第二试剂瓶。
7.在一个实施方式中，在即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白10g、无水葡萄糖39g、三水合乙酸钠40g、磷酸氢二钾2g以及磷酸二氢钾2g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：葡萄糖1g、l-色氨酸0.4g、l-盐酸半胱氨酸0.4g、l-天冬氨酸0.6g、硫酸腺嘌呤20mg、盐酸鸟嘌呤20mg、尿嘧啶20mg、黄嘌呤20mg、聚山梨酯-80 0.1g、还原型谷胱甘肽5mg、七水合硫酸镁0.4g、氯化钠20mg、七水合硫酸亚铁20mg、一水合硫酸锰20mg、核黄素1mg、对氨基苯甲酸2mg、盐酸吡哆醇4mg、盐酸硫胺素400μg、泛酸钙800μg、尼克酸800μg以及生物素20μg；在即用型测定培养基为维生素b
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即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白15g、无水葡萄糖39g、乙酸钠20g、抗坏血酸4.0g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：葡萄糖1.0g、天门冬酰胺0.2g、l-胱氨酸0.4g、dl-色氨酸0.4g、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、黄嘌呤20.0mg、核黄素1.0mg、盐酸硫胺素1.0mg、生物素10.0μg、烟酸2.0mg、ρ-氨基苯甲酸2.0mg、泛酸钙1.0mg、盐酸吡哆醇4.0mg、盐酸吡哆醛4.0mg、烟酸吡哆胺800μg、叶酸200μg、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg、硫酸锰20mg以及聚山梨糖单油酸酯2.0g；在即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白12g、无水葡萄糖39g、乙酸钠20g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：无水葡萄糖1.0g、l-胱氨酸0.2g、dl-色氨酸0.2g、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、盐酸硫胺素2.0mg、核黄素2.0mg、烟酸2.0mg、泛酸钙2.0mg、盐酸吡哆醇4.0mg、ρ-氨基苯甲酸200.0μg、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg以及硫酸锰20mg；在即用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白5g、无水葡萄糖39g、乙酸钠33g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二
氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：无水葡萄糖1.0g、l-胱氨酸0.4、l-色氨酸0.1g、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg、硫酸锰20mg、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、核黄素400μg、盐酸硫胺素200μg、生物素0.8μg、ρ-氨基苯甲酸200.0μg、烟酸1.0mg、盐酸吡哆醇800μg以及、聚山梨糖单油酸酯0.1g。
8.在一个实施方式中，设备为真空冷冻干燥仪，真空冷冻干燥仪的固定化干燥冻干程序包括：预冻阶段、一次升华干燥阶段、二次升华干燥阶段以及解析干燥阶段。
9.在一个实施方式中，当真空冷冻干燥仪执行预冻阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度为-65℃并保持1.0h；和/或，当真空冷冻干燥仪执行一次升华干燥阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度为-55℃，真空度为0.22mbar并保持8h；和/或，当真空冷冻干燥仪执行二次升华干燥阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度在-55℃-0℃之间并保持12h；和/或，当真空冷冻干燥仪执行解析干燥阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度在25℃，真空度控制在0.010mbar，并保持8h。
10.在一个实施方式中，将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中包括：将无菌化处理后的基础成分溶液分装至两种规格的第一试剂瓶中，第一种规格和第二种规格的第一试剂瓶中分别装有250ml和20ml的基础成分溶液；将预定量的浓缩溶液装入第二试剂瓶中包括：将浓缩50倍的浓缩溶液分装至两种规格的第二试剂瓶中，第一种规格和第二种规格的第二试剂瓶中在进行冻干操作之前分别装有5ml和0.4ml的浓缩溶液。
11.在一个实施方式中，将基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中包括：将基础成分溶解于去离子水或蒸馏水中，完全溶解后，使用孔径为0.22μm～0.45μm无菌滤膜过滤除菌设备将溶解后的溶液过滤装至无菌的第一试剂瓶中。
12.根据本发明的另一方面，提供了一种即用型测定培养基的制备方法，制备即用型测定培养基所使用的试剂盒为通过上述的即用型测定培养基的试剂盒的制备方法获得的试剂盒，即用型测定培养基的制备方法包括：将第二试剂瓶中的试剂溶解并加入第一试剂瓶中的试剂中，混匀。
13.根据本发明的又一方面，提供了一种试剂盒的使用方法，试剂盒为上述的试剂盒，使用方法包括：制备即用型测定培养基，将第二试剂瓶中的试剂溶解并加入第一试剂瓶中的试剂中，混匀，再将第四试剂瓶中的检测菌球全部加入至第一试剂瓶中，混匀；制备标准溶液，将预定量的无菌水加入至第三试剂瓶中混匀，再将混匀后的液体取预定量加入至预定量的无菌水中。
14.根据本发明的再一方面，提供了一种试剂盒，试剂盒采用上述的即用型测定培养基的试剂盒的制备方法获得。
15.根据本发明的最后一方面，提供了一种试剂盒，试剂盒采用上述的即用型测定培养基的试剂盒的制备方法获得，试剂盒具有两种规格，其中一种规格的试剂盒包括第一种规格的第一试剂瓶与第一种规格的第二试剂瓶，另一种规格的试剂盒包括第二种规格的第一试剂瓶与第二种规格的第二试剂瓶。
16.应用本发明的技术方案，将即用型测定培养基所需要的成分按照其特性分为稳定性主成分(即基础成分)与敏感成分(即光热敏感成分)两大类，其中稳定成分可以以液体形式稳定存放，将这些成分单独溶解，通过无菌过滤形式分装至无菌试剂瓶中，作为测定培养
基基础可在冷藏避光条件下保存1年以上；敏感成分是培养基的重要组成部分，化学活性较强，为了不影响培养基的检测效果，将其通过先进的真空冻干工艺制备成冻干状态，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。因此采用本实施例所制得的基础成分溶液与冻干均可稳定保存，为后续制备稳定性良好的即用型测定培养基打下良好的基础，最终实现保障培养基的检测效果，增加培养基的稳定性的目的。此外，应用实施例一的技术方案，使用时以培养基添加剂形式溶解后加入基础成分溶液中，简化了配制过程，即开即用，为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解决方案。最后，应用实施例一的技术方案，由于即用型测定培养基所需的光热敏感成分本身还包括葡萄糖、天冬氨酸和色氨酸等氨基酸(低分子量化合物保护剂，防止活性成分变性)、氯化钠(使溶液具有一定的离子强度)或聚山梨酯-80(一种表面活性剂)等能够在冻干过程中起到一定的保护作用的成分，因此无需额外添加其他成分的保护剂，简化了制备过程，提高了制备效率。
17.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
18.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
19.图1示出了根据本发明的即用型测定培养基的试剂盒的制备方法的实施例一的流程图。
具体实施方式
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
21.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
22.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的术语在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
23.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
24.如图1所示，实施例一的试剂盒用以制备叶酸即用型测定培养基，试剂盒的制备方
法包括：将基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中；将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，微量成分包括光热敏感成分以及冻干保护成分；其中，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、三水合乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：葡萄糖、l-色氨酸、l-盐酸半胱氨酸、l-天冬氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、聚山梨酯-80、还原型谷胱甘肽、七水合硫酸镁、氯化钠、七水合硫酸亚铁、一水合硫酸锰、核黄素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、尼克酸以及生物素。
25.应用实施例一的技术方案，发明人将叶酸即用型测定培养基所需要的成分按照其特性分为稳定性主成分(即基础成分)与敏感成分(即光热敏感成分)两大类，其中稳定成分可以以液体形式稳定存放，将这些成分单独溶解，通过无菌过滤形式分装至无菌试剂瓶中，作为测定培养基基础可在冷藏避光条件下保存1年以上；敏感成分是培养基的重要组成部分，化学活性较强，为了不影响培养基的检测效果，将其通过先进的真空冻干工艺制备成冻干状态，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。因此采用本实施例所制得的基础成分溶液与冻干均可稳定保存，为后续制备稳定性良好的叶酸即用型测定培养基打下良好的基础，最终实现保障培养基的检测效果，增加培养基的稳定性的目的。此外，应用实施例一的技术方案，使用时以培养基添加剂形式溶解后加入基础成分溶液中，简化了配制过程，即开即用，为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解决方案。最后，应用实施例一的技术方案，由于叶酸即用型测定培养基所需的光热敏感成分本身还包括葡萄糖、天冬氨酸和色氨酸等氨基酸(低分子量化合物保护剂，防止活性成分变性)、氯化钠(使溶液具有一定的离子强度)和聚山梨酯-80(一种表面活性剂)等能够在冻干过程中起到一定的保护作用的成分，因此无需额外添加其他成分的保护剂，简化了制备过程，提高了制备效率。
26.如图1所示，在实施例一中，试剂盒用以进行维生素测定，试剂盒的制备方法还包括：将预定量的标准品装至第三试剂瓶中并制备为冻干；将预定量的检测菌球装至第四试剂瓶中并制备为冻干；其中，标准品为叶酸标准品，检测菌球为叶酸检测菌球。在本实施例中，上述制备方法一方面省去了标准品购买、配置标准品储备液、标准中间液、标准工作液和无菌过滤等步骤，也无需大量容量瓶存放和稀释标准液。另一方面，本制备方法，可提供标准菌株的来源说明，用于存档溯源。省去了国标中菌种购买、活化、保存、制备接种液的操作步骤，同时保证了菌种的纯度和活力，还提供菌种的溯源证明。当然，在其他实施例中，试剂盒内可以不放有第三试剂瓶和第四试剂瓶，试剂盒仅用以制备即用型测定培养基。需要说明的是，图1中的制备方法的步骤无先后之分，可根据实际情况按需制作。
27.在实施例一中，将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，微量成分包括光热敏感成分以及冻干保护成分这一步骤具体包括：将微量成分按配方配置成浓缩50倍的溶液并将预定量的浓缩溶液装入第二试剂瓶中；将第二试剂瓶放入设备中以进行冻干操作；密封第二试剂瓶。上述步骤使得冻干不与空气接触，保证冻干的性能良好。
28.在实施例一中，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白10g、无水葡萄糖39g、三水合乙酸钠40g、磷酸氢二钾2g以及磷酸二氢钾2g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：葡萄糖1g、l-色氨酸0.4g、l-盐酸半胱氨酸0.4g、l-天冬氨酸0.6g、硫酸腺嘌呤20mg、盐酸鸟嘌呤20mg、尿嘧啶20mg、黄嘌呤20mg、聚山梨酯-80 0.1g、还
原型谷胱甘肽5mg、七水合硫酸镁0.4g、氯化钠20mg、七水合硫酸亚铁20mg、一水合硫酸锰20mg、核黄素1mg、对氨基苯甲酸2mg、盐酸吡哆醇4mg、盐酸硫胺素400μg、泛酸钙800μg、尼克酸800μg以及生物素20μg。
29.在实施例一中，制作冻干的设备为真空冷冻干燥仪，真空冷冻干燥仪的固定化干燥冻干程序包括：预冻阶段、一次升华干燥阶段、二次升华干燥阶段以及解析干燥阶段。经过上述程序所制得的冻干具有良好的性能。
30.在实施例一中，当真空冷冻干燥仪执行预冻阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度为-65℃并保持1.0h；和/或，当真空冷冻干燥仪执行一次升华干燥阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度为-55℃，真空度为0.22mbar并保持8h；和/或，当真空冷冻干燥仪执行二次升华干燥阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度在-55℃-0℃之间并保持12h；和/或，当真空冷冻干燥仪执行解析干燥阶段的程序时，真空冷冻干燥仪内的温度在25℃，真空度控制在0.010mbar，并保持8h。
31.在实施例一中，将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中包括：将无菌化处理后的基础成分溶液分装至两种规格的第一试剂瓶中，第一种规格和第二种规格的第一试剂瓶中分别装有250ml和20ml的基础成分溶液；将预定量的浓缩溶液装入第二试剂瓶中包括：将浓缩50倍的溶液分装至两种规格的第二试剂瓶中，第一种规格和第二种规格的第二试剂瓶中在进行冻干操作之前分别装有5ml和0.4ml的浓缩溶液。经过上述制备方法能够制备出两种规格的第一试剂瓶以及两种规格的第二试剂瓶，以满足不同的测定需要。
32.在实施例一中，将基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中包括：将基础成分溶解于去离子水或蒸馏水中，完全溶解后，使用孔径为0.22μm～0.45μm无菌滤膜过滤除菌设备将溶解后的溶液过滤装至无菌的第一试剂瓶中。
33.下面以一具体的实例介绍一下叶酸即用型测定培养基的试剂盒的制备方法：
34.将基础成分(1000ml)溶解于去离子水或蒸馏水中，其中，基础成分(1000ml)包括：酸水解无维生素酪蛋白10g、无水葡萄糖39g、三水合乙酸钠40g、磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钾2g；完全溶解后，使用孔径为0.22μm～0.45μm无菌滤膜过滤除菌设备将其过滤分装至无菌试剂瓶中，参考国标试管法和微孔板法用量，试管法每支用量5ml，标准曲线管要用100ml-150ml，每个样品至少用15ml；微孔板每孔用150μl，每板96孔，共需14.4ml，根据实际包装瓶情况，同时考虑正常试验损耗，选择最适当的体积，最终每瓶分别定量分装250ml和20ml，在冷藏条件下可稳定保存1年以上。
35.将微量成分(1000ml)与基础成分分开，制备成能即开即用、稳定存放的添加剂形式，可有效提高培养基性能，保持培养基原有的测定效果。其中，微量成分(1000ml)包括：葡萄糖1g、l-色氨酸0.4g、l-盐酸半胱氨酸0.4g、l-天冬氨酸0.6g、硫酸腺嘌呤20mg、盐酸鸟嘌呤20mg、尿嘧啶20mg、黄嘌呤20mg、聚山梨酯-80 0.1g、还原型谷胱甘肽5mg、七水合硫酸镁0.4g、氯化钠20mg、七水合硫酸亚铁20mg、一水合硫酸锰20mg、核黄素1mg、对氨基苯甲酸2mg、盐酸吡哆醇4mg、盐酸硫胺素400μg、泛酸钙800μg、尼克酸800μg、生物素20μg。按照配方中微量成分的含量，按需配制一定体积的微量成分，将每种成分的称量数扩大50倍，溶解在相应体积的水中(即将微量成分配制成浓缩50倍的溶液；如，配制1000ml的微量成分浓缩液，每种成分的称量数按配方含量扩大50倍溶解水中，即为50倍浓缩液)，再根据每瓶基础
成分溶液(250ml/20ml)用量，计算所需浓缩50倍微量成分浓缩液的体积数，250ml/20ml基础培养基需要微量成分浓缩液分别为5ml和0.4ml，微量成分浓缩液分别加入7ml和2ml棕色避光西林瓶中，将装有浓缩液的西林瓶依次放入真空冷冻干燥仪中，固定化干燥冻干程序为：预冻阶段为-65℃，保持1.0h；一次升华干燥阶段为-55℃，将真空度降至0.22mbar，达到最终真空度时间为8h；二次升华干燥阶段为-55℃-0℃，真空度控制在0.22mbar，达到最终温度时间为12h；解析干燥阶段最终温度为25℃，真空度控制在0.010mbar，达到最终温度时间为8h。结束冷冻干燥过程，在真空下压盖密封，取出备用。
36.发明人针对叶酸即用型培养基与常规培养基进行了对比试验，参考国标gb5009.211-2022，将制备的3批叶酸即用型培养基与现配培养基对比，检测0.05ng、0.30ng、0.60ng叶酸标准品对应的菌体生长od值，对3个平行微孔进行检测，结果见表1：
37.表1 3批叶酸即用型培养基与现配培养基关于cv值的对比表
[0038][0039]
变异系数是标准差与平均数的比值，记为cv，也称为相对标准偏差(rsd)反映单位均值上离散程度，常用在两个总体均值不等的离散程度的比较，变异系数越小，表明离散度越小，数据具有较小的变异性和较高的稳定性。由表1可见，本发明制备的叶酸即用型测定
培养基，3平行之间的变异系数均小于5％，与常规培养基相比无明显差异，标曲线性基本一致，说明稳定性和精密度高。
[0040]
除与常规培养基的精密度进行对比外，发明人针对叶酸即用型培养基的保质期进行了试验，从第1个月到第12个月，每月检测0.05ng、0.30ng、0.60ng叶酸标准品对应的菌体生长od值，结果见表2：
[0041]
表2叶酸即用型培养基的cv值随时间变化表
[0042]
[0043][0044]
由上表可见，本发明制备的叶酸即用型测定培养基，1年以内性能稳定，无污染和培养基变色现象，od值没有明显变化，每个浓度3平行之间的变异系数均小于5％，说明该发明将不能稳定存放的完全培养基分为培养基分成培养基基础成分和敏感添加剂两部分，其中培养基基础以液体即用型状态可稳定保存1年，无污染和变色现象，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。
[0045]
实施例二的试剂盒的制备方法与实施例一的试剂盒的制备方法类似，区别仅在于所要制备的即用型测定培养基的类型，具体地，在实施例二中，即用型测定培养基为维生素b
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即用型测定培养基，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：葡萄糖、天门冬酰胺、l-胱氨酸、dl-色氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、核黄素、盐酸硫胺素、生物素、烟酸、ρ-氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、烟酸吡哆胺、叶酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰以及聚山梨糖单油酸酯。
[0046]
应用实施例二的技术方案，发明人同样将维生素b
12
即用型测定培养基所需要的成分按照其特性分为稳定性主成分(即基础成分)与敏感成分(即光热敏感成分)两大类，其中稳定成分可以以液体形式稳定存放，将这些成分单独溶解，通过无菌过滤形式分装至无菌试剂瓶中，作为测定培养基基础可在冷藏避光条件下保存1年以上；敏感成分是培养基的重要组成部分，化学活性较强，为了不影响培养基的检测效果，将其通过先进的真空冻干工艺制备成冻干状态，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。因此采用本实施例所制得的基础成分溶液与冻干均可稳定保存，为后续制备稳定性良好的维生素b
12
即用型测定培养基打下良好的基础，最终实现保障培养基的检测效果，增加培养基的稳定性的目的。此外，应用实施例二的技术方案，使用时以培养基添加剂形式溶解后加入基础成分溶液中，简化了配制过程，即开即用，为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解
决方案。最后，应用实施例二的技术方案，由于维生素b
12
即用型测定培养基所需的光热敏感成分本身还包括葡萄糖、色氨酸等氨基酸(低分子量化合物保护剂，防止活性成分变性)、氯化钠(使溶液具有一定的离子强度)和聚山梨糖单油酸酯(一种表面活性剂)等能够在冻干过程中起到一定的保护作用的成分，因此无需额外添加其他成分的保护剂，简化了制备过程，提高了制备效率。
[0047]
在实施例二中，标准品为维生素b
12
标准品，检测菌球为维生素b
12
检测菌球。同样地，在本实施例中，上述制备方法一方面省去了标准品购买、配置标准品储备液、标准中间液、标准工作液和无菌过滤等步骤，也无需大量容量瓶存放和稀释标准液。另一方面，本制备方法，可提供标准菌株的来源说明，用于存档溯源。省去了国标中菌种购买、活化、保存、制备接种液的操作步骤，同时保证了菌种的纯度和活力，还提供菌种的溯源证明。
[0048]
在实施例二中，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白15g、无水葡萄糖39g、乙酸钠20g、抗坏血酸4.0g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：葡萄糖1.0g、天门冬酰胺0.2g、l-胱氨酸0.4g、dl-色氨酸0.4g、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、黄嘌呤20.0mg、核黄素1.0mg、盐酸硫胺素1.0mg、生物素10.0μg、烟酸2.0mg、ρ-氨基苯甲酸2.0mg、泛酸钙1.0mg、盐酸吡哆醇4.0mg、盐酸吡哆醛4.0mg、烟酸吡哆胺800μg、叶酸200μg、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg、硫酸锰20mg以及聚山梨糖单油酸酯(吐温80)2.0g。
[0049]
实施例二的维生素b
12
即用型测定培养基的试剂盒的制备方法与实施例一类似，在此不再赘述。
[0050]
发明人针对维生素b
12
即用型培养基与常规培养基进行了对比试验，参考国标gb5009.285-2022，将制备的3批维生素b
12
即用型培养基与现配培养基对比，检测0.01ng、0.04ng、0.08ng维生素b
12
标准品对应的菌体生长od值，对3个平行微孔进行检测，结果见表3：
[0051]
表3 3批维生素b
12
即用型培养基与现配培养基关于cv值的对比表
[0052]
[0053][0054]
由表3可见，本发明制备的维生素b
12
即用型测定培养基，3平行之间的变异系数均小于5％，与常规培养基相比，不同批次培养基菌体生长浊度和标曲线性基本一致，菌体生长趋势与标品浓度相关性更明显，生长梯度更趋向于直线模式，生长速度较快，说明培养基敏感度、稳定性和精密度都非常好，检测性能优于常规配制的培养基。
[0055]
除与常规培养基的精密度进行对比外，发明人针对维生素b
12
即用型培养基的保质期进行了试验，从第1个月到第12个月，每月检测0.01ng、0.04ng、0.08ng维生素b
12
标准品对应的菌体生长od值，结果见表4：
[0056]
表4维生素b
12
即用型培养基的cv值随时间变化表
[0057]
[0058]
[0059][0060]
由上表可见，本发明制备的维生素b
12
即用型测定培养基，1年以内性能稳定，无污染和培养基变色现象，od值没有明显变化，每个浓度3平行之间的变异系数均小于5％，说明该发明将不能稳定存放的完全培养基分为培养基分成培养基基础成分和敏感添加剂两部分，其中培养基基础以液体即用型状态可稳定保存1年，无污染和变色现象，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。
[0061]
实施例三的试剂盒的制备方法与实施例一的试剂盒的制备方法类似，区别仅在于所要制备的即用型测定培养基的类型，具体地，在实施例三中，即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：无水葡萄糖、l-胱氨酸、dl-色氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、盐酸硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、ρ-氨基苯甲酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁以及硫酸锰。
[0062]
应用实施例三的技术方案，发明人同样将生物素即用型测定培养基所需要的成分按照其特性分为稳定性主成分(即基础成分)与敏感成分(即光热敏感成分)两大类，其中稳定成分可以以液体形式稳定存放，将这些成分单独溶解，通过无菌过滤形式分装至无菌试剂瓶中，作为测定培养基基础可在冷藏避光条件下保存1年以上；敏感成分是培养基的重要组成部分，化学活性较强，为了不影响培养基的检测效果，将其通过先进的真空冻干工艺制备成冻干状态，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。因此采用本实施例所制得的基础成分溶液与冻干均可稳定保存，为后续制备稳定性良好的生物素即用型测定培养基打下良好的基础，最终实现保障培养基的检测效果，增加培养基的稳定性的目的。此外，应用实施例三的技术方案，使用时以培养基添加剂形式溶解后加入基础成分溶液中，简化了配制过程，即开即用，为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解决方案。最后，应用实施例三的技术方案，由于生物素即用型测定培养基所需的光热敏感成分本身还包括葡萄糖、色氨酸等氨基酸(低分子量化合物保护剂，防止活性成分变性)、氯化钠(使溶液具有一定的离子强度)等能够在冻干过程中起到一定的保护作用的成分，因此无需额外添加其他成分的保护剂，简化了制备过程，提高了制备效率。
[0063]
在实施例三中，标准品为生物素标准品，检测菌球为生物素检测菌球。同样地，在本实施例中，上述制备方法一方面省去了标准品购买、配置标准品储备液、标准中间液、标准工作液和无菌过滤等步骤，也无需大量容量瓶存放和稀释标准液。另一方面，本制备方
法，可提供标准菌株的来源说明，用于存档溯源。省去了国标中菌种购买、活化、保存、制备接种液的操作步骤，同时保证了菌种的纯度和活力，还提供菌种的溯源证明。
[0064]
在实施例三中，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白12g、无水葡萄糖39g、乙酸钠20g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：无水葡萄糖1.0g、l-胱氨酸0.2g、dl-色氨酸0.2g、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、盐酸硫胺素2.0mg、核黄素2.0mg、烟酸2.0mg、泛酸钙2.0mg、盐酸吡哆醇4.0mg、ρ-氨基苯甲酸200.0μg、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg以及硫酸锰20mg；
[0065]
实施例三的生物素即用型测定培养基的试剂盒的制备方法与实施例一类似，在此不再赘述。
[0066]
发明人针对生物素即用型培养基与常规培养基进行了对比试验，根据国标gb5009.259-2016，将制备的3批生物素即用型培养基与现配培养基对比，检测0.1ng、0.4ng、0.8ng生物素标准品对应的菌体生长od值，对3个平行微孔进行检测，结果见表5：
[0067]
表5 3批生物素即用型培养基与现配培养基关于cv值的对比表
[0068]
[0069][0070]
由表5可见，本发明制备的生物素即用型测定培养基，3平行之间的变异系数均小于5％，与常规培养基相比菌体生长趋势和标曲线性无明显差异，说明培养基性能稳定性和精密度高。
[0071]
除与常规培养基的精密度进行对比外，发明人针对生物素即用型培养基的保质期进行了试验，从第1个月到第12个月，每月检测0.1ng、0.4ng、0.8ng生物素标准品对应的菌体生长od值，结果见表6：
[0072]
表6生物素即用型培养基的cv值随时间变化表
[0073]
[0074][0075]
由上表可见，本发明制备的生物素即用型测定培养基，1年以内性能稳定，无污染和培养基变色现象，od值没有明显变化，每个浓度3平行之间的变异系数均小于5％，说明该发明将不能稳定存放的完全培养基分为培养基分成培养基基础成分和敏感添加剂两部分，其中培养基基础以液体即用型状态可稳定保存1年，无污染和变色现象，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。
[0076]
实施例四的试剂盒的制备方法与实施例一的试剂盒的制备方法类似，区别仅在于所要制备的即用型测定培养基的类型，具体地，在实施例四中，即用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基，基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，微量成分包括：无水葡萄糖、l-胱氨酸、l-色氨酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、核黄素、盐酸硫胺素、生物素、ρ-氨基苯甲酸、烟酸、盐酸吡哆醇以及聚山梨糖单油酸酯。
[0077]
应用实施例四的技术方案，发明人同样将泛酸即用型测定培养基所需要的成分按照其特性分为稳定性主成分(即基础成分)与敏感成分(即光热敏感成分)两大类，其中稳定成分可以以液体形式稳定存放，将这些成分单独溶解，通过无菌过滤形式分装至无菌试剂瓶中，作为测定培养基基础可在冷藏避光条件下保存1年以上；敏感成分是培养基的重要组成部分，化学活性较强，为了不影响培养基的检测效果，将其通过先进的真空冻干工艺制备成冻干状态，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。因此采用本实施例所制得的基础成分溶液与冻干均可稳定保存，为后续制备稳定性良好的泛酸即用型测定培养基打下良好的基础，最终实现保障培养基的检测效果，增加培养基的稳定性的目的。此外，应用实施例四的技术方案，使用时以培养基添加剂形式溶解后加入基础成分溶液中，简化了配制过程，即开即用，为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解决方案。最后，应用实施例四的技术方案，由于泛酸即用型测定培养基所需的光热敏感成分本身还包括葡萄糖、色氨酸等氨基酸(低分子量化合物保护剂，防止活性成分变性)、氯化钠(使溶液具有一定的离子强度)和聚山梨糖单油酸酯(一种表面活性剂，可以作为冻干保护剂)等能够在冻干过程中起到一定的保护作用的成分，因此无需额外添加其他成分的保护剂，简化了制备过程，提高了制备效率。
[0078]
在实施例四中，标准品为泛酸标准品，检测菌球为泛酸检测菌球。同样地，在本实施例中，上述制备方法一方面省去了标准品购买、配置标准品储备液、标准中间液、标准工作液和无菌过滤等步骤，也无需大量容量瓶存放和稀释标准液。另一方面，本制备方法，可提供标准菌株的来源说明，用于存档溯源。省去了国标中菌种购买、活化、保存、制备接种液的操作步骤，同时保证了菌种的纯度和活力，还提供菌种的溯源证明。
[0079]
在实施例四中，配置1000ml的浓缩液的基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白5g、无水葡萄糖39g、乙酸钠33g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的微量成分的配方为：无水葡萄糖1.0g、l-胱氨酸0.4、l-色氨酸0.1g、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg、硫酸锰20mg、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、核黄素400μg、盐酸硫胺素200μg、生物素0.8μg、ρ-氨基苯甲酸200.0μg、烟酸1.0mg、盐酸吡哆醇800μg以及、聚山梨糖单油酸酯0.1g。
[0080]
实施例四的泛酸即用型测定培养基的试剂盒的制备方法与实施例一类似，在此不再赘述。
[0081]
发明人针对泛酸即用型培养基与常规培养基进行了对比试验，参考国标gb5009.210-2016，将制备的3批泛酸即用型培养基与现配培养基对比，检测10ng、40ng、80ng泛酸标准品对应的菌体生长od值，对3个平行微孔进行检测，结果见表7：
[0082]
表7 3批泛酸即用型培养基与现配培养基关于cv值的对比表
[0083][0084]
由表7可见，本发明制备的泛酸即用型测定培养基，3平行之间的变异系数均小于5％，与常规培养基相比菌体生长趋势和标曲线性无明显差异，相同标准品浓度点对应的菌体生长od值基本一致，即用型培养基菌体生长性更好，说明即用型培养基特异性和营养性好，性能稳定性和精密度高。
[0085]
除与常规培养基的精密度进行对比外，发明人针对泛酸即用型培养基的保质期进行了试验，从第1个月到第12个月，每月检测10ng、40ng、80ng泛酸标准品对应的菌体生长od值，结果见表8：
[0086]
表8泛酸即用型培养基的cv值随时间变化表
[0087]
[0088][0089]
由上表可见，本发明制备的泛酸即用型测定培养基，1年以内性能稳定，无污染和培养基变色现象，od值没有明显变化，每个浓度3平行之间的变异系数均小于5％，说明该发明将不能稳定存放的完全培养基分为培养基分成培养基基础成分和敏感添加剂两部分，其中培养基基础以液体即用型状态可稳定保存1年，无污染和变色现象，敏感成分以冻干形式也可稳定保存1年，在1年保质期内性能良好。
[0090]
本技术还提供了一种即用型测定培养基的制备方法，根据本技术的即用型测定培养基的制备方法的实施例包括：制备即用型测定培养基所使用的试剂盒为通过上述的即用型测定培养基的试剂盒的制备方法获得的试剂盒，即用型测定培养基的制备方法包括：将第二试剂瓶中的试剂溶解并加入第一试剂瓶中的试剂中，混匀。
[0091]
优选地，在本实施例中，将部分第一试剂瓶中的试剂加入至第二试剂瓶中以对第二试剂瓶中的试剂进行溶解，将溶解后的溶液全部加入第一试剂瓶中的试剂中。应用本实施例的技术方案，使用时以培养基添加剂形式溶解后加入基础成分溶液中，简化了配制过程，即开即用，为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解决方案。
[0092]
本技术还提供了一种试剂盒的使用方法，试剂盒为上述的试剂盒，使用方法包括：制备即用型测定培养基，将第二试剂瓶中的试剂溶解并加入第一试剂瓶中的试剂中，混匀，再将第四试剂瓶中的检测菌球全部加入至第一试剂瓶中，混匀；制备标准溶液，将预定量的无菌水加入至第三试剂瓶中混匀，再将混匀后的液体取预定量加入至预定量的无菌水中。应用本实施例的技术方案，省去了菌种活化、调节菌浓度、标品配制等操作，操作简便高效，
准确性和稳定性高，可大大提高后续检测效率。
[0093]
本技术还提供了一种试剂盒，根据本技术的试剂盒的实施例一，试剂盒采用上述的即用型测定培养基的试剂盒的制备方法获得。试剂盒内包括第一试剂瓶与第二试剂瓶。通过上述制备方法制备出的试剂盒能够为微生物法检测维生素提供高效、稳定、准确的解决方案。
[0094]
实施例二的试剂盒与实施例一的试剂盒的区别仅在于，实施例二具有两个规格的试剂盒。具体地，在实施例二中，试剂盒包括第一试剂瓶与第二试剂瓶，第一试剂瓶中的试剂以及第二试剂瓶中的试剂根据上述的制备方法获得，试剂盒具有两种规格，其中一种规格的试剂盒包括前述第一种规格的第一试剂瓶与第一种规格的第二试剂瓶，另一种规格的试剂盒包括前述的第二种规格的第一试剂瓶与第二种规格的第二试剂瓶。可以根据不同的测定需要选择不同规格的试剂盒进行试验。
[0095]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
[0096]
本发明阐述了一种即用型维生素检测培养基及其制备方法，该培养基成分上完全符合国标，省去了维生素测定培养基溶解、高压灭菌、快速冷却处理等操作，简便高效；将繁杂的培养基组分进行了稳定成分与敏感成分的划分，针对不同组分进行不同的处理，保证了培养基的性能稳定与检测准确率，该发明应用于即用型检测试剂盒，可大大提高检测效率，为检测人员提供了准确、高效的技术产品。
[0097]
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
[0098]
为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在
……
之上”、“在
……
上方”、“在
……
上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在
……
上方”可以包括“在
……
上方”和“在
……
下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
[0099]
在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。
[0100]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技
术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒用以制备即用型测定培养基，所述即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基、维生素b
12
即用型测定培养基、生物素即用型测定培养基与泛酸即用型测定培养基中的任一种，所述试剂盒的制备方法包括：将基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中；将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，所述微量成分包括光热敏感成分，所述光热敏感成分中包括冻干保护成分；其中，在所述即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基的情况下，所述基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、三水合乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，所述微量成分包括：葡萄糖、l-色氨酸、l-盐酸半胱氨酸、l-天冬氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、聚山梨酯-80、还原型谷胱甘肽、七水合硫酸镁、氯化钠、七水合硫酸亚铁、一水合硫酸锰、核黄素、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、尼克酸以及生物素；在所述即用型测定培养基为维生素b
12
即用型测定培养基的情况下，所述基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，所述微量成分包括：葡萄糖、天门冬酰胺、l-胱氨酸、dl-色氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、核黄素、盐酸硫胺素、生物素、烟酸、ρ-氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、烟酸吡哆胺、叶酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰以及聚山梨糖单油酸酯；在所述即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基的情况下，所述基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，所述微量成分包括：无水葡萄糖、l-胱氨酸、dl-色氨酸、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、盐酸硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、ρ-氨基苯甲酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁以及硫酸锰；在所述即用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基的情况下，所述基础成分包括：酸水解无维生素酪蛋白、无水葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾以及磷酸二氢钾，所述微量成分包括：无水葡萄糖、l-胱氨酸、l-色氨酸、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤、尿嘧啶、核黄素、盐酸硫胺素、生物素、ρ-氨基苯甲酸、烟酸、盐酸吡哆醇以及聚山梨糖单油酸酯。2.根据权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒用以进行维生素测定，所述试剂盒的制备方法还包括：将预定量的标准品装至第三试剂瓶中并制备为冻干；和/或，将预定量的检测菌球装至第四试剂瓶中并制备为冻干；其中，在所述即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基的情况下，所述标准品为叶酸标准品，所述检测菌球为叶酸检测菌球；在所述即用型测定培养基为维生素b
12
即用型测定培养基的情况下，所述标准品为维生素b
12
标准品，所述检测菌球为维生素b
12
检测菌球；在所述即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基的情况下，所述标准品为生物素标准品，所述检测菌球为生物素检测菌球；在所述即用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基的情况下，所述标准品为泛酸标准品，所述检测菌球为泛酸检测菌球。3.根据权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，所述微量成分包括光热敏感成分，所述光热敏感成分中包括冻
干保护成分，包括：将微量成分按配方配置成浓缩50倍的浓缩溶液并将预定量的浓缩溶液装入第二试剂瓶中，所述微量成分包括光热敏感成分，所述光热敏感成分中包括冻干保护成分；将所述第二试剂瓶放入设备中以进行冻干操作；密封所述第二试剂瓶。4.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述即用型测定培养基为叶酸即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的所述基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白10g、无水葡萄糖39g、三水合乙酸钠40g、磷酸氢二钾2g以及磷酸二氢钾2g；配置1000ml的浓缩液的所述微量成分的配方为：葡萄糖1g、l-色氨酸0.4g、l-盐酸半胱氨酸0.4g、l-天冬氨酸0.6g、硫酸腺嘌呤20mg、盐酸鸟嘌呤20mg、尿嘧啶20mg、黄嘌呤20mg、聚山梨酯-80 0.1g、还原型谷胱甘肽5mg、七水合硫酸镁0.4g、氯化钠20mg、七水合硫酸亚铁20mg、一水合硫酸锰20mg、核黄素1mg、对氨基苯甲酸2mg、盐酸吡哆醇4mg、盐酸硫胺素400μg、泛酸钙800μg、尼克酸800μg以及生物素20μg；在所述即用型测定培养基为维生素b
12
即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的所述基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白15g、无水葡萄糖39g、乙酸钠20g、抗坏血酸4.0g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的所述微量成分的配方为：葡萄糖1.0g、天门冬酰胺0.2g、l-胱氨酸0.4g、dl-色氨酸0.4g、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、黄嘌呤20.0mg、核黄素1.0mg、盐酸硫胺素1.0mg、生物素10.0μg、烟酸2.0mg、ρ-氨基苯甲酸2.0mg、泛酸钙1.0mg、盐酸吡哆醇4.0mg、盐酸吡哆醛4.0mg、烟酸吡哆胺800μg、叶酸200μg、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg、硫酸锰20mg以及聚山梨糖单油酸酯2.0g；在所述即用型测定培养基为生物素即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的所述基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白12g、无水葡萄糖39g、乙酸钠20g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的所述微量成分的配方为：无水葡萄糖1.0g、l-胱氨酸0.2g、dl-色氨酸0.2g、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、盐酸硫胺素2.0mg、核黄素2.0mg、烟酸2.0mg、泛酸钙2.0mg、盐酸吡哆醇4.0mg、ρ-氨基苯甲酸200.0μg、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg以及硫酸锰20mg；在所述即用型测定培养基为泛酸即用型测定培养基的情况下，配置1000ml的浓缩液的所述基础成分的配方为：酸水解无维生素酪蛋白5g、无水葡萄糖39g、乙酸钠33g、磷酸氢二钾1.0g以及磷酸二氢钾1.0g；配置1000ml的浓缩液的所述微量成分的配方为：无水葡萄糖1.0g、l-胱氨酸0.4、l-色氨酸0.1g、硫酸镁0.4g、氯化钠20.0mg、硫酸亚铁20.0mg、硫酸锰20mg、硫酸腺嘌呤20.0mg、盐酸鸟嘌呤20.0mg、尿嘧啶20.0mg、核黄素400μg、盐酸硫胺素200μg、生物素0.8μg、ρ-氨基苯甲酸200.0μg、烟酸1.0mg、盐酸吡哆醇800μg以及、聚山梨糖单油酸酯0.1g。5.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述设备为真空冷冻干燥仪，所述真空冷冻干燥仪的固定化干燥冻干程序包括：预冻阶段、一次升华干燥阶段、二次升华干燥阶段以及解析干燥阶段。6.根据权利要求5所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，当所述真空冷冻干燥仪执行所述预冻阶段的程序时，所述真空冷冻干燥仪内的温度为-65℃并保持1.0h；和/或，当所述
真空冷冻干燥仪执行所述一次升华干燥阶段的程序时，所述真空冷冻干燥仪内的温度为-55℃，真空度为0.22mbar并保持8h；和/或，当所述真空冷冻干燥仪执行所述二次升华干燥阶段的程序时，所述真空冷冻干燥仪内的温度在-55℃-0℃之间并保持12h；和/或，当所述真空冷冻干燥仪执行所述解析干燥阶段的程序时，所述真空冷冻干燥仪内的温度在25℃，真空度控制在0.010mbar，并保持8h。7.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中包括：将无菌化处理后的基础成分溶液分装至两种规格的第一试剂瓶中，第一种规格和第二种规格的第一试剂瓶中分别装有250ml和20ml的所述基础成分溶液；将预定量的浓缩溶液装入第二试剂瓶中包括：将浓缩50倍的浓缩溶液分装至两种规格的第二试剂瓶中，第一种规格和第二种规格的第二试剂瓶中在进行冻干操作之前分别装有5ml和0.4ml的所述浓缩溶液。8.根据权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，将所述基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中包括：将所述基础成分溶解于去离子水或蒸馏水中，完全溶解后，使用孔径为0.22μm～0.45μm无菌滤膜过滤除菌设备将溶解后的溶液过滤装至无菌的第一试剂瓶中。9.一种即用型测定培养基的制备方法，其特征在于，制备所述即用型测定培养基所使用的试剂盒为通过权利要求1、3至6、8中任一项所述的试剂盒的制备方法获得的试剂盒，所述即用型测定培养基的制备方法包括：将第二试剂瓶中的试剂溶解并加入第一试剂瓶中的试剂中，混匀。10.一种试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂盒为权利要求2所述的试剂盒，所述使用方法包括：制备即用型测定培养基，将第二试剂瓶中的试剂溶解并加入第一试剂瓶中的试剂中，混匀，再将第四试剂瓶中的检测菌球全部加入至第一试剂瓶中，混匀；制备标准溶液，将预定量的无菌水加入至第三试剂瓶中混匀，再将混匀后的液体取预定量加入至预定量的无菌水中。11.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1至6和8中任一项所述的试剂盒的制备方法获得。12.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求7所述的试剂盒的制备方法获得，所述试剂盒具有两种规格，其中一种规格的试剂盒包括第一种规格的第一试剂瓶与第一种规格的第二试剂瓶，另一种规格的试剂盒包括第二种规格的第一试剂瓶与第二种规格的第二试剂瓶。

技术总结
本发明提供了一种试剂盒及其制备方法和使用方法以及即用型测定培养基的制备方法，其中，试剂盒用以制备即用型测定培养基，试剂盒的制备方法包括：将基础成分溶解于液体中，进行无菌化处理，并将预定量的无菌溶液装至无菌的第一试剂瓶中；将预定量的微量成分装至第二试剂瓶中并制备为冻干，微量成分包括光热敏感成分，光热敏感成分中包括冻干保护成分。应用本发明的技术方案，能够有效地解决现有技术中即用型测定培养基的稳定性差、保质期短的问题。题。题。


技术研发人员：何艳玲 吴艳辉 刘丰瑞 胡朋
受保护的技术使用者：北京陆桥技术股份有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/9/5