一种单管检测多靶标的多重PCR熔解曲线分析方法、试剂盒及应用与流程

一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法、试剂盒及应用
技术领域
1.本技术涉及基因检测领域，更具体地说，它涉及一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法、试剂盒及应用。


背景技术：

2.目前，对于基因分型的检测，常见方法为pcr-荧光探针法、pcr-反向点杂交法、荧光pcr熔解曲线法以及半导体测序法、pcr毛细电泳片段分析、流式荧光杂交法、微阵列芯片法、恒温扩增法等。这些方法在推广上都或多或少存在如操作复杂，易产生污染，产生一定假阴性和假阳性等缺陷。
3.其中，多色熔解曲线分析技术(multicolor melting curve analysis,mmca)基于探针法和熔解曲线分析法，结合多色荧光检测，可同时检测一个反应中的多个靶标。该技术中的探针采用双标记、自淬灭的taqman探针或分子信标，检测原理为：当taqman探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，因荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,fret)使得荧光信号较弱。而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。当pcr扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升升降温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。
4.然而，检测多个靶标的多重pcr体系中同时含有多条引物、探针或者分子信标，反应体系复杂；且可能会出现多个靶点之间扩增条件不兼容，扩增位点相互的抑制，以及多条引物、探针之间相互干扰的情况。这些因素都会导致实验难度急剧增大，检测的灵敏度和准确度不佳。
5.所以如何既能简化多重pcr反应体系的复杂度又能保证多靶标检测的性能是解决多重pcr检测应用的关键。


技术实现要素：

6.为了消除检测多个靶标的多重pcr体系中荧光探针对pcr扩增的影响，提高检测的灵敏度和准确度，本技术提供一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法、试剂盒及应用。
7.本技术提供如下技术方案：第一方面，本技术提供一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其包括:针对每种待测的靶标基因位点序列，分别设计特异性的上游引物、下游引物和荧光探针；配制多重pcr反应体系，多重pcr反应体系包括每种靶标基因的模版dna、上游引物
和下游引物；在多重pcr反应体系中加入成膜剂，成膜剂漂浮于多重pcr反应体系的表面并凝固形成无色透明的隔离膜；在隔离膜上加入每种靶标基因对应的荧光探针后，进行多重pcr扩增程序；扩增完成后，熔化隔离膜，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断靶标基因的基因型。
8.进一步地，成膜剂包括热塑性树脂和石蜡。
9.进一步地，热塑性树脂的熔程为95-107℃，熔点为96℃-100℃，熔化后为无色透明液体。
10.进一步地，热塑性树脂为聚乙烯蜡。
11.进一步地，聚乙烯蜡的分子量为1000-3500。
12.进一步地，在进行熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序为：将多重pcr扩增程序的产物在闭管条件下于94-98℃下保持1-3min后，升降温至40℃下保持3-8min,再继续升升降温至82-88℃,连续采集荧光信号。
13.进一步地，熔解曲线程序中的升升降温速率为0.04-0.08℃/s。
14.进一步地，加热熔化隔离膜的参数为：加热温度98-100℃，加热时间为1-3min。
15.进一步地，荧光探针为双标记、自淬灭的taqman探针或分子信标。
16.第二方面，本技术还提供一种用于同时检测多靶标的多重pcr试剂盒，其包括：成膜剂；用于扩增对应靶标序列的pcr引物；用于特异性结合靶标序列的荧光探针；用于构建多重pcr反应体系的缓冲试剂。
17.第三方面，本技术还提供一种上述多重pcr试剂盒在基因分型中的应用，其包括：配制多重pcr反应体系，多重pcr反应体系包括每种靶标基因的模版dna、上游引物和下游引物；在多重pcr反应体系中加入成膜剂，成膜剂漂浮于多重pcr反应体系的表面并凝固形成无色透明的隔离膜；在隔离膜上加入每种靶标基因对应的荧光探针后，进行多重pcr扩增后，熔化隔离膜，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断靶标基因的基因型。
18.综上所述，本技术具有以下有益效果：本技术中提供的这种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，在配制多重pcr反应体系时，在最后加入荧光探针前，加入熔化的成膜剂(例如液体聚乙烯蜡)，由于其具有密度小、熔点高、熔程短、无色透明的特点，加入后能够在多重pcr反应体系的表面平铺，并形成一层无色透明的隔离膜。最后，再加入荧光探针，由于隔离膜的存在使得荧光探针与其它的多重pcr反应体系的组分分隔开，从而消除了荧光探针对多重pcr反应的影响。当pcr反应结束后，再通过高温加热使隔离膜熔化，从而使荧光探针与pcr扩增体系接触，再进行熔解曲线分析，根据熔解峰tm值的差异，即可判断靶标基因的基因型。
19.本技术提供的这种方法极大的减少了pcr反应体系的复杂性，避免了多条引物、探针之间的相互干扰，同时本发明的探针分离式设计能够有效避免pcr扩增过程中现有探针
的水解消耗，保证使用少量的探针即可。通过熔解曲线分析可以获得不同靶标基因序列的熔解峰tm值，并以此来实现了闭管同时检测多个靶标基因序列的目的。该方法的灵敏度高，对于tm值相差1.0
±
0.2℃范围内的靶序列，均能够实现有效测定，准确度高。
附图说明
20.图1是实施例1中制备的检测用单管试剂中各组分的示意图；图2是实施例1中对18种中高危型的hpv病毒亚型检测的熔解曲线(通道一)；图3是实施例1中对18种中高危型的hpv病毒亚型检测的熔解曲线(通道二)；图4是实施例1中对18种中高危型的hpv亚型检测的熔解曲线(通道三)；图5是实施例1中对18种中高危型的hpv亚型检测的熔解曲线(通道四)；图6是实施例2-6中选择不同的成膜剂的hpv16熔解曲线；图7是实施例7-12中不同聚乙烯蜡隔离膜的熔化温度及融化时间下的hpv16熔解曲线。
具体实施方式
21.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
22.本技术的技术构思为：现有熔解曲线(melting curve)分析技术主要是利用不同dna序列具有不同tm值(dna双链解链50％的温度)这一原理，对pcr中不同长度或相同长度不同gc含量的双链产物进行分析。主要分为荧光染料熔解曲线分析技术和探针熔解曲线分析技术两种。
23.其中，对于探针熔解曲线分析技术，其是基于探针法和熔解曲线分析法。该探针是采用双标记、自淬灭的taqman探针或分子信标，检测原理为：当taqman探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，荧光信号较弱。而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。当扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升降温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。
24.当体系中仅有少量的待测基因靶标时，上述探针熔解曲线分析技术还能够实现有效检测。而当待测液中的待测基因靶标较多时，需要进行多重pcr扩增检测，则由于多重pcr反应体系中同时存在多条模版dna、多个对应的上游引物、下游引物、荧光探针以及pcr缓冲溶剂体系，多重pcr反应体系复杂，多条引物、荧光探针质检相互干扰，使得多重pcr扩增难以顺利进行，从而极大的影响了检测结果的灵敏度和准确性。
25.鉴于此，发明人在研发过程中，创造性的引入低密度的成膜剂(例如液体聚乙烯蜡)，利用其在低温下凝固、高温下熔解的特性，实现多条荧光探针与多重pcr反应体系之间的短暂分离，即能够实现多重pcr扩增程序的独立进行，又能够在扩增完成后在闭管状态下
仅依靠加热就能够实现荧光探针的引入，顺利进行熔解曲线分析。设计巧妙，不但解决了现有的探针熔解曲线分析技术难以同时对多个靶标基因进行有效检测的技术难题，还避免了检测过程中反复开盖加样造成污染，确保检测灵敏度和准确度的同时，提高了检测效率。
26.本发明的技术方案为：本实施方式提供了一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其包括以下步骤：步骤s1：针对每种待测的靶标基因位点序列，分别设计特异性的上游引物、下游引物和荧光探针。
27.其中，荧光探针为双标记、自淬灭的taqman探针或分子信标。该taqman探针或分子信标的5’端标记有荧光发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团。利用荧光能量共振转移(fret)原理，实现荧光信号的出现或淬灭。荧光发光基团可以选自：fam、vic、rox、cy5；荧光淬灭基团可以选自bhq1、bhq2、bhq3。
28.步骤s2：配制多重pcr反应体系，所述多重pcr反应体系包括每种所述靶标基因的模版dna、上游引物和下游引物。
29.优选地，多重pcr反应体系中还包括一些进行pcr扩增反应必不可少的物质，比如酶、dntp、阳离子等。
30.步骤s3：在所述多重pcr反应体系中加入成膜剂，所述成膜剂漂浮于所述多重pcr反应体系的表面并凝固形成无色透明的隔离膜；术语“成膜剂”，指无色透明的低密度物质，其加入溶剂体系后能够漂浮于液面之上，且具有在低温下凝固、高温下熔解的特性，有助于形成用于分隔荧光探针与多重pcr体系的隔离膜。
31.进一步地，成膜剂包括热塑性树脂和石蜡。
32.其中，热塑性树脂具有受热软化、冷却硬化的性能，而且不起化学反应，包括：pe-聚乙烯、pp-聚丙烯、pvc-聚氯乙烯、ps-聚苯乙烯、pa-聚酰胺、pom-聚甲醛、pc-聚碳酸酯、聚苯醚、聚砜、橡胶等。
33.为了更好的实现本技术的目的，优选地采用熔程为95-107℃、熔点为96℃-100℃、熔化后为无色透明液体的热塑性树脂。例如可以使用聚乙烯蜡。
34.进一步地，为了容易的实现隔离膜的形成或熔解，提高检测的灵敏度，采用分子量为1000-3500的聚乙烯蜡。且聚乙烯蜡中所含的杂质在熔解后会被反应体系造成干扰，因此，优选地采用纯度大于95％以上的聚乙烯蜡作为成膜剂。
35.为了更好的控制形成的隔离膜的质量(例如覆盖面积、厚度等)，在加入成膜剂时需要优化成膜剂的加入量。优选地，成膜剂与多重pcr反应体系之间的体积比为1:3.5；步骤s4：在所述隔离膜上加入每种所述靶标基因对应的所述荧光探针后，进行多重pcr扩增程序；多重pcr扩增程序需要根据待测的靶标基因进行针对性的调整，以实现多个靶标基因的同时有效扩增为宜。
36.优选地，pcr扩增程序如下：94℃5min；(94℃30s，55℃30s收集荧光，72℃20s)
×
40个循环。
37.步骤s5：扩增完成后，加热熔化所述隔离膜，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断所述靶标基因的基因型。
38.进一步地，加热熔化隔离膜的参数是：加热温度98-100℃，加热时间为1-3min。发明人研究发现，当成膜剂为聚乙烯蜡时，选择适宜的加热温度及条件，即可使隔离膜熔化，又能同时避免荧光探针在高温下降解，确保实现有效检测。优选地，加热温度为98℃，加热时间为2min。
39.进一步地，在进行所述熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序为：将所述多重pcr扩增程序的产物在闭管条件下于94-98℃下保持1-3min后(目的在于溶解隔离膜，同时与熔解曲线段高温变性充分解链，两程序融合为一体)，随后升降温至30-50℃下保持3-8min(目的在于使荧光探针与pcr扩增产物的dna单链互补配对、逐渐结合形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号),再继续升升降温至82-88℃(此时再对扩增产物进行升升降温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱),连续采集荧光信号，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。
40.优选地，熔解曲线程序为：将所述多重pcr扩增程序的产物在闭管条件下于96-98℃下保持1-2min后，升降温至54-55℃下保持4-6min,再继续升升降温至83-87℃,连续采集40-80℃温度段的荧光信号。
41.本实施方式还提供一种用于同时检测多靶标的多重pcr试剂盒，其包括：(1)成膜剂；(2)用于扩增对应靶标序列的pcr引物；(3)用于特异性结合所述靶标序列的荧光探针；(4)用于构建多重pcr反应体系的缓冲试剂。
42.上述多重pcr试剂盒有多种应用场景，尤其适用于多重基因分型检测的应用，例如针对hpv基因分型的检测。
43.本实施例仅是对本发明方法的举例说明，不应视为对本发明方法应用方式的限制；在一些实施例中，本发明方法还适用于呼吸道病原体、生殖道病原体、耳聋基因检测、慢病个体化用药、肿瘤用药等具有多重pcr检测需求的领域。实施例
44.实施例1本实施例提供一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，以检测18种中高危hpv病毒亚型。
45.1.检测方法：1.制备检测用的单管试剂(如图1所示)：(1)选取含有13种高危型的hpv病毒亚型(包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和5种hpv中等风险hpv病毒亚型(包括hpv26、53、66、73、82)的待测液作为模版，拷贝数为10^3-10^4copies/ul。
46.(2)分别针对hpv病毒各亚型，设计特异性的上游引物、下游引物和荧光探针，具体如表1所示：表1.hpv病毒各亚型的引物及探针序列
(3)取pcr八连管，将pcr反应缓冲液(含酶、dntp、引物、阳离子等)20ul及5μl模板加入到管底，得到多重pcr反应体系，其具体如表2所示：表2.多重pcr反应体系试剂25μl中的试剂体积/μl模版5各亚型的引物混合液5dntp0.5酶0.5阳离子1.5缓冲液12.5(4)将分子量为1000-3500、纯度为95％的聚乙烯蜡(购自江苏天问新材料科技)，加热至120℃使其熔化，每管加入10ul聚乙烯蜡，聚乙烯蜡漂浮于多重pcr反应体系的表面凝固，形成隔离膜。
47.(5)向凝固的聚乙烯蜡隔离膜上加入5ul探针混合液，盖上管盖，单管试剂完成制备。
48.2.进行多重pcr扩增程序：采用如表3所示的程序进行多重pcr扩增：表3.多重pcr扩增程序3.进行熔解曲线分析：熔解曲线程序如表4所示：表4.熔解曲线程序
绘制温度与荧光信号的变化曲线图，得到熔解曲线。
49.二、检测结果：如图2-5所示：图2为通道1的熔解曲线，其中特征峰tm值为61℃的基因亚型为hpv16；特征峰tm值为51℃的基因亚型为hpv18；特征峰tm值为56℃的基因亚型为hpv31；特征峰tm值为65℃的基因亚型为hpv33；特征峰tm值为70℃的基因亚型为hpv35。
50.图3为通道2的熔解曲线，其中特征峰tm值为51℃的基因亚型为hpv52；特征峰tm值为55℃的基因亚型为hpv39；特征峰tm值为59℃的基因亚型为hpv51；特征峰tm值为64℃的基因亚型为hpv39；特征峰tm值为69℃的基因亚型为hpv45。
51.图4为通道3的熔解曲线，其中特征峰tm值为50℃的基因亚型为hpv26；特征峰tm值为54℃的基因亚型为hpv68；特征峰tm值为58℃的基因亚型为hpv59；特征峰tm值为63℃的基因亚型为hpv58；特征峰tm值为67℃的基因亚型为hpv13。
52.图5为通道4的熔解曲线，其中特征峰tm值为54℃的基因亚型为hpv66；特征峰tm值为59℃的基因亚型为hpv73；特征峰tm值为66℃的基因亚型为hpv82；特征峰tm值为63℃的基因亚型为内标。
53.实施例2-4本实施例以hpv16为检测对象，旨在对比不同的成膜剂对检测结果的影响：1.实验方法：1.制备检测用的单管试剂：(1)参照实施例1中的方法，按照表2配制pcr反应体系，其中模版为hpv16，拷贝数为10^3-10^4copies/ul，引物为hpv16对应的引物，序列如seq id no.1-2所示，加入到管底。
54.(2)取4种聚乙烯蜡，加热至120℃使其熔化，将实验分为5组，每组每管加入10ul的如表5所示的成膜剂(其中对比例1中不加入成膜剂，作为对照组)，成膜剂漂浮于pcr反应体系缓冲液表面凝固；表5.成膜剂的选择
(3)向凝固的聚乙烯蜡层上加入5ul探针混合液，盖上管盖，单管试剂完成制备。
55.2.进行多重pcr扩增程序：采用实施例1中如表3所示的程序进行多重pcr扩增。
56.3.进行熔解曲线分析：熔解曲线程序如表6所示：表6.熔解曲线程序绘制温度与荧光信号的变化曲线图，得到熔解曲线。
57.2.实验结果：由图6可见，聚乙烯蜡的熔解曲线信号值比石蜡的高，说明当成膜剂为时，灵敏度高。同时，对比实施例1-3(成膜剂均为聚乙烯蜡)可以发现，聚乙烯蜡的分子量和纯度对熔解曲线信号的影响较大，结果显示当采用分子量为1000-3500、纯度为98％的聚乙烯蜡，检测效果最佳。
58.实施例6-11本实施例以hpv16为检测对象，以聚乙烯蜡(分子量1000-3500，纯度98％)为成膜剂，旨在探究聚乙烯蜡融化温度及时间对检测结果的影响。
59.一、实验方法：与实施例2的步骤基本相同，不同之处在于：扩增完成后，按照表7所示进行聚乙烯蜡隔离膜熔化温度及融化时间筛选：表7.隔离膜熔化温度及融化时间的筛选
3.实验结果：如图7所示，圆点为实验组1(对比例3-5)的结果，矩形为试验组2(实施例6-8)的结果，三角形为试验组3(实施例9-11)的结果。由图可见，实验组1无熔解曲线峰，原因可能是聚乙烯蜡在96℃时未融化或未完全融化，探针溶液与扩增产物未接触；实验组3信号值较实验组2低，原因可能是在100℃时，部分探针发生降解。实验组2中条件1信号值最低，条件2与条件3信号值相当，但条件2信号值最好，因此聚乙烯蜡隔离膜熔化的最佳条件是：熔化温度为98℃及融化时间为2min。
60.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，其包括:针对每种待测的靶标基因位点序列，分别设计特异性的上游引物、下游引物和荧光探针；配制多重pcr反应体系，所述多重pcr反应体系包括每种所述靶标基因的模版dna、上游引物和下游引物；在所述多重pcr反应体系中加入成膜剂，所述成膜剂漂浮于所述多重pcr反应体系的表面并凝固形成无色透明的隔离膜；在所述隔离膜上加入每种所述靶标基因对应的所述荧光探针后，进行多重pcr扩增程序；扩增完成后，加热熔化所述隔离膜，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断所述靶标基因的基因型。2.根据权利要求1所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述成膜剂包括热塑性树脂和石蜡。3.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述热塑性树脂的熔程为95-107℃，熔点为96℃-100℃，熔化后为无色透明液体。4.根据权利要求3所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述热塑性树脂为聚乙烯蜡。5.根据权利要求4所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述聚乙烯蜡的分子量为1000-3500。6.根据权利要求3所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，在进行所述熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序为：将所述多重pcr扩增程序的产物在闭管条件下于94-98℃下保持1-3min后，升降温至40℃下保持3-8min，再连续至82-88℃, 连续采集荧光信号。7.根据权利要求6所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述熔解曲线程序中的升降温速率为0.04-0.08℃/s。8.根据权利要求4-7任一项所述的单管检测多靶标的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，加热熔化所述隔离膜的参数是：加热温度98-100℃，加热时间为1-3min。9.一种用于同时检测多靶标的多重pcr试剂盒，其特征在于，其包括：成膜剂；用于扩增对应靶标序列的pcr引物；用于特异性结合所述靶标序列的荧光探针；用于构建多重pcr反应体系的缓冲试剂。10.一种如权利要求9所述的多重pcr试剂盒在多靶标基因检测的应用，其特征在于，其包括：配制多重pcr反应体系，所述多重pcr反应体系包括每种所述靶标基因的模版dna、上游引物和下游引物；在所述多重pcr反应体系中加入成膜剂，所述成膜剂漂浮于所述多重pcr反应体系的表面并凝固形成无色透明的隔离膜；在所述隔离膜上加入每种所述靶标基因对应的所述荧光探针，进行多重pcr扩增后，熔
化所述隔离膜，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断所述靶标基因的基因型。

技术总结
本申请涉及基因检测领域，具体公开了一种单管检测多靶标的多重PCR熔解曲线分析方法、试剂盒及应用。该分析方法包括：设计引物和荧光探针；配制多重PCR反应体系；在多重PCR反应体系中加入成膜剂，成膜剂在多重PCR反应体系的表面形成隔离膜；在隔离膜上加入每种所述靶标基因对应的所述荧光探针后，进行多重PCR扩增程序；扩增完成后，熔化隔离膜，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰Tm值判断所述靶标基因的基因型。这种方法极大的减少了多重PCR反应体系的复杂性，避免了多条引物、探针之间的相互干扰，本发明的探针分离式设计能够有效避免PCR扩增过程中现有探针的水解消耗，保证使用少量的探针即可完成扩增后的熔解曲线分析。的探针即可完成扩增后的熔解曲线分析。的探针即可完成扩增后的熔解曲线分析。


技术研发人员：刘勋 童京京 赵瑞瑞 刘瑞娜 李博茹 刘世娇 雷炳旭 张辉
受保护的技术使用者：河南省华之源生物技术有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/6