SNP标记mdm2-55及引物在大菱鲆耐高温性状检测及育种中的应用的制作方法

snp标记mdm2-55及引物在大菱鲆耐高温性状检测及育种中的应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一种snp标记mdm2-55及引物在大菱鲆耐高温性状检测及育种中的应用。


背景技术：

2.大菱鲆是一种冷水性鱼类，养殖水温超过了适宜范围则很容易导致的大菱鲆的高温应激，高温应激对鱼类的生长、存活和代谢过程产生较大的影响，从而引起代谢紊乱、氧化应激、免疫力和抗病力急剧下降等不良后果，最终导致鱼体死亡，给养殖产业造成损失。因此培育耐高温的新品种对降低养殖成本、扩大养殖区域以及节能环保都有重要意义。近年来，随着现代分子生物学技术的迅速发展和后基因组时代的到来，snp作为第三代分子标记技术在水产动物分子育种研究中广泛应用，为更好的开发和培育优良品种发挥着重要的作用。因此，筛选经济性状相关的分子标记用于早期选种，对于缩短世代间隔，提高育种效率和准确性具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明针对上述技术问题提供一种snp标记mdm2-55及引物在大菱鲆耐高温性状检测及育种中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，筛选出与大菱鲆耐高温性状相关的新的分子标记，为分子标记辅助选择耐高温性状的大菱鲆品系奠定基础。
4.本发明通过以下技术方案实现上述目的：
5.本发明第一方面提供一种提供snp标记mdm2-55在大菱鲆耐高温性状检测中的应用，所述snp标记位于大菱鲆mdm2基因核苷酸序列的第5096位，其多态性形式为g/c。
6.进一步地，碱基突变位点的基因型包括gg、gc。
7.本发明第二方面提供提供一种检测上述snp标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seq id no:2-3所示。
8.本发明第三方面提供了一种检测大菱鲆耐高温性状的方法，其包括以下步骤：使用所述引物对对于大菱鲆的基因组dna进行pcr扩增，检测pcr扩增产物第55bp处的基因型，基因型为gc的个体耐高温性能显著高于gg基因型。
9.本发明第四方面提供提供一种大菱鲆耐高温性状遗传改良的方法，利用上述引物对检测群体中的个体在所述碱基突变位点出的基因型，保留基因型为gc的个体，淘汰基因型为gg的个体，来提高大菱鲆苗种耐高温性能。
10.本发明与现有技术相比的有益效果：本发明所述snp标记mdm2-55位于大菱鲆第12号染色体mdm2基因中的第5096位点处；所述位点上存在g/c碱基突变，与大菱鲆耐高温性状具有显著的相关性，其中gc基因型的个体耐高温性显著高于gg基因型。等位基因c在耐高温群体中的频率为62％，而在不耐高温群体中频率为32％。本发明提供的分子标记能够用于大菱鲆耐高温性状选育，可以不通过大规模高温实验即可进行准确筛选，能够显著促进耐
高温新品种选育的育种进程。
附图说明
11.图1为扩增产物中两种基因型测序峰图。
具体实施方式
12.下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明得保护范围不受实施例任何形式上的限制。若无特殊说明，实施例中所用的实验方法均为领域技术人员所熟知的常规方法和技术，材料试剂均通过商业购买获得。
13.实施例1大菱鲆mdm2基因多态性位点的鉴定
14.1、大菱鲆耐高温材料的获取：本实验用鱼均来自于烟台天源水产有限公司，挑选180尾体格健壮、无损伤、活力好的幼鱼，体长10.34
±
0.76cm，体重23.01
±
3.63g。分到6组实验缸，每缸30尾鱼，暂养10天，暂养期间，14
±
0.5℃，30
±
0.5ppt的水环境及自然光周期下进行，每日投喂2次。实验前24h停食，实验过程中不再投喂。利用加热棒进行升温，保持1℃/h的升温速率，直至水温升至29℃。此后，水温保持在29℃，持续观察并记录大菱鲆死亡时间。将死亡的大菱鲆按照死亡时间顺序进行编号，最先死亡的50尾为不耐高温组，最后存活且活力最强的50尾作为耐高温组。剪取鱼鳍作为提取基因组dna的实验样品，-20℃保存。
15.2、提取待测大菱鲆组织中的基因组dna：利用tiangen海洋动物组织基因组dna提取试剂盒，提取鱼鳍基因组dna。提取后利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量和完整性；采用nanodrop2000超微量分光光度计测定dna浓度，符合浓度要求及完整性良好的基因组dna样品保存于冰箱
–
20℃备用。
16.3、扩增含snp位点的核苷酸片段
17.3.1引物设计：从大菱鲆基因组数据库中找到基因mdm2(ncbi的登录号为nc_061526.1)对应的dna序列，以mdm2基因的部分dna序列为模板，设计引物，包括正向引物f：5
’‑
cacgaagccagccaacca-3’(seq id no:2)；和反向引物r：5
’‑
agagcggagggcagagcg-3’(seq id no:3)。
18.该引物的可扩展区域的长度为546bp序列，序列如seq id no:1所示，其中包含第55bp位g/c突变的分子标记位点。
19.seq id no:1：
20.tttattgtcgggttttgatccatgaggacaaaaatagtctgatgaaacatcactgattgtttttaacttcagactgttgattattgat
21.tactgattgattgtgtcccctgaaggtcctgatgtggaggagaacgaaggagtcgatgttcccgatgggaaaagggcgaa
22.aactcctcccctgacgcagtgtctgtctgactccgccccctcggcccccagctcccaggacctcctctgcttctctcagccc
23.tcgtcctcctcatccttcgtcgattcccaggagacgtcgctcacgtgttcgcccgccgcccccgagctggagcgcagcgtg
24.tcggccgagtggcggatgcccgagtcgtgtctggacccctgcctcatctgccagtcgcggcccaagaacggctccatcg
25.tccacgggcggacgggccacctaatggcctgctacgtctgcgcccgcaagctcaagaagaggaacaagctgtgtcccgtctgcaggcggcccatcgaggacgtcgtcctcacatacttcagctgagacgcccgctct。
26.3.2pcr扩增：其中pcr反应体系为20μl，包括:10μl2
×
tsingkemastermix(blue)，0.8μl正向引物(10μmol/l)，0.8μl反向引物(10μmol/l)，1.0μl模板dna(≥100ng/μl)以及7.4μlddh2o。
27.其中pcr反应的条件为：95℃预变性5min，35个扩增循环(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min。
28.4、检测pcr扩增片段，获得snp标记：对步骤3中的pcr扩增产物进行测序检测，所述pcr扩增产物的第55bp处的基因型为所述snp位点的基因型。两种基因型的测序峰图如图1所示。
29.实施例2对100尾待测样本的mdm2基因座位的多态性位点进行扩大群体分析
30.1、利用卡方检验对耐高温组和不耐高温组的100尾大菱鲆进行检验分析(表1)，上述snp位点在耐高温组中的等位基因c的频率显著高于不耐高温组(p《0.05)。验证了该处snp位点的等位基因c与大菱鲆耐高温性状的相关性。
31.2、利用pearson相关性检验对多态性位点的基因型频率和耐高温性进行相关性检验分析。上述snp位点gc基因型的频率与耐高温性之间存在显著的相关性(pearson’s r＝0.301，p《0.01)。进一步验证了该处snp位点的等位基因c与大菱鲆耐高温性状的相关性。
32.表1snp位点在大菱鲆耐高温组和不耐高温组中的基因型频率
[0033][0034]
注：*表示差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。
[0035]
在耐高温的大菱鲆品种选育过程中，可以选择保留基因型为gc的个体。淘汰基因型为gg的个体。
[0036]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，在不偏离本发明构思的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种提供snp标记mdm2-55在大菱鲆耐高温性状检测中的应用，其特征在于，所述snp标记mdm2-55位于大菱鲆mdm2基因核苷酸序列的第5095位，其多态性形式为g/c。2.根据权利要求1所述的一种提供snp标记mdm2-55在大菱鲆耐高温性状检测中的应用，其特征在于，碱基突变位点的基因型包括gg、gc。3.一种检测权利要求1所述snp标记mdm2-55的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如seq id no:2-3所示。4.一种检测大菱鲆耐高温性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：使用权利要求3所述引物对对于大菱鲆的基因组dna进行pcr扩增，检测pcr扩增产物第55bp处的基因型，基因型为gc的个体耐高温性能显著高于gg基因型。5.一种大菱鲆耐高温性状遗传改良的方法，其特征在于，利用权利要求3所述引物对检测群体中的个体在所述snp标记mdm2-55碱基突变位点的基因型，保留基因型为gc的个体，淘汰基因型为gg的个体。

技术总结
本发明公开了一种SNP标记mdm2-55及引物在大菱鲆耐高温性状检测及育种中的应用，属于分子标记技术领域，所述SNP标记mdm2-55位于的大菱鲆mdm2基因核苷酸序列的第5095位，其多态性形式为G/C。所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示，本发明还提供利用所述引物对检测大菱鲆耐高温性状的方法，以促进大菱鲆耐高温性状遗传改良的进展。高温性状遗传改良的进展。高温性状遗传改良的进展。


技术研发人员：黄智慧 赵一诺 马爱军 王新安 蒋宇航 曹郡文
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/6