一种丝素蛋白复合微胶囊及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白复合微胶囊及其制备方法与应用。


背景技术：

2.非病毒基因递送系统在骨关节炎(oa)治疗中具有巨大的潜力。然而，设计具有低毒性和高转染效率的递送系统仍然具有挑战性。oa中伴随的炎症进一步限制了药物、生长因子和基因对软骨再生的影响。近年来，基因治疗和组织工程取得了许多进展。目前，有10种基因治疗产品在美国上市，100多个临床试验招募患者。大多数临床试验旨在评估病毒递送系统的高和稳定转染效率。然而，病毒递送容易引起致瘤和对宿主dna整合，限制了其在临床环境中的广泛应用。因此，越来越多的研究倾向于开发非病毒递送系统。非病毒递送系统具有几个优点，例如易于设计和制造，对靶基因序列大小的要求较低，以及低免疫原性。
3.然而，提高转染效率和特异性对于推进非病毒载体的临床应用是重要的。大多数非病毒载体设计用于系统应用，需要复杂的技术才能获得高转染效率和特异性。局部递送是一种替代策略，它避免了递送系统在体液循环中被免疫系统清除，因此允许设计更简单的递送系统。选择合适的功能基因也是成功诱导受损软骨再生的关键。
4.赖氨酰氧化酶(lox)是一种铜离子依赖性胺氧化酶，已知通过赖氨酸残基催化胶原纤维和弹性蛋白的共价交联。此外，据报道，lox有助于细胞外基质(ecm)的稳定性，并在软骨层中高度表达，这表明lox可能调节软骨再生。makris等人使用软骨酶abc、tgf-β1和lox的组合构建软骨组织。这种工程软骨在与天然软骨结合时表现出优异的性能。但是体外构建软骨组织，时间漫长。
5.oa中的免疫微环境是影响基因治疗的另一个因素。其中，巨噬细胞在调节组织再生中发挥着重要作用。活性巨噬细胞分为两种经典表型，即m1和m2表型。m1巨噬细胞参与炎症的早期阶段，m2巨噬细胞发挥抗炎作用并促进组织再生。因此，提高m2：m1巨噬细胞比率可能有利于软骨再生。在实验室中，lps和inf-γ通常用于m1表型极化；使用il-4实现m2表型极化。
6.点击化学，由sharpless于2001年首次提出，此后已广泛应用于生物材料的开发。尽管肝素结合多种细胞因子，如il-4，但由于出血风险增加，其在临床组织再生中的应用仍然有限。
7.软骨组织损伤后，伤口出现炎症，软骨组织发生降解，严重影响软骨的修复。虽然已有研究利用生长因子或药物对软骨缺损进行治疗，但生物分子在体内半衰期短，可能会频繁注射，反而加剧损伤。


技术实现要素：

8.为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中材料制备需要的周期较长，丝素的保存周期较短等问题。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了一种丝素蛋白复合微胶囊及其制备方法与应用。
10.本发明的第一个目的是提供一种丝素蛋白复合微胶囊，包括若干单层复合壳、包封于所述复合壳内的赖氨酰氧化酶质粒dna和吸附在所述复合壳表面的白介素-4；
11.所述单层复合壳包含丝素蛋白和修饰在所述丝素蛋白上的肝素寡糖类物质；
12.所述单层复合壳任选地被一层或多层另外的壳所包裹；
13.所述的一层或多层另外的壳各自独立地包含丝素蛋白和任选的修饰在所述另外的壳中的肝素寡糖类物质；并且其中所述丝素蛋白和所述肝素寡糖类物质在各层壳之间是相同或不同的。
14.在本发明的一个实施例中，所述若干单层复合壳的层数为2-9。
15.在本发明的一个实施例中，所述丝素蛋白的分子量范围为3万-30万。
16.在本发明的一个实施例中，所述肝素寡糖类物质选自肝素寡糖和/或肝素二糖。
17.本发明的第二个目的是提供一种所述的丝素蛋白复合微胶囊的制备方法，包括以下步骤，
18.s1、将聚乙烯亚胺(pei)包被的聚苯乙烯(ps)颗粒加入赖氨酰氧化酶质粒dna(loxpdna)溶液中进行孵育，得到赖氨酰氧化酶质粒dna@聚乙烯亚胺/聚苯乙烯(loxpdna@pei/ps)；
19.s2、将s1所述的赖氨酰氧化酶质粒dna@聚乙烯亚胺/聚苯乙烯分散于肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白溶液中进行孵育，得到丝素蛋白包被的赖氨酰氧化酶质粒dna@聚乙烯亚胺/聚苯乙烯复合乳液；
20.s3、将s2所述的复合乳液通过化学和/或物理处理进行固化、干燥，得到干粉状固体；
21.s4、将s3所述的干粉状固体重新悬浮于s2所述的复合乳液中进行孵育，重复s2至s3一次或多次，利用有机溶剂将聚苯乙烯溶解，得到具有多层壳的微胶囊；
22.s5、将s4所述的具有多层壳的微胶囊加入白介素-4溶液中进行孵育，得到所述的丝素蛋白复合微胶囊；
23.其中，所述丝素蛋白和所述肝素寡糖类物质在各层壳之间是相同或不同的。
24.在本发明的一个实施例中，在s1中，所述聚乙烯亚胺选自支链型聚乙烯亚胺(bpei)，分子量为25kda-50kda。bpei是一种具有较高阳离子正电荷密度的有机大分子，细胞毒性低，很稳定，可以通过正负电荷的吸附作用，吸附带负电荷的loxpdna，实现基因的装载，具体原理是：带正电荷的bpei可以和带负电荷的loxpdna形成带正电荷的复合物后，与细胞表面带负电荷的蛋白多糖相互作用，并进一步通过内吞作用进入细胞。
25.在本发明的一个实施例中，在s1中，聚苯乙烯(ps)的作用是牺牲模板，丝素在ps表面进行组装，最后将ps融掉，得到丝素蛋白复合微胶囊。
26.在本发明的一个实施例中，在s2中，所述肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白溶液中肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白的浓度独立地为1mg/ml-2mg/ml。
27.在本发明的一个实施例中，在s2中，所述肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白的制备方法具体包括以下步骤：
28.s21、向丝素蛋白溶液中加入叠氮化合物、对甲苯磺酸和亚硝酸钠，反应得到叠氮
化合物/丝素蛋白；
29.s22、将n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、氨基-二硬脂酸酯-炔和肝素寡糖溶于溶剂，反应得到炔烃化肝素寡糖；
30.s23、向s22所述的炔烃化肝素寡糖中加入抗坏血酸钠、硫酸铜、叔丁基三氯乙酰亚胺酯、s21所述的叠氮化合物/丝素蛋白，反应得到所述的肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白。
31.在本发明的一个实施例中，在s4中，所述有机溶剂选自四氢呋喃。
32.在本发明的一个实施例中，在s5中，所述白介素-4溶液中白介素-4的浓度为10ng/ml-50ng/ml。
33.在本发明的一个实施例中，在pei处理后，ps球呈正点性，随着组装层数的增加，逐渐变为负电。这说明初期的组装是以静电吸附为主，后面的组装是以β折叠为主。后期实验中，使用的是8层丝素层自组装后制备的丝素蛋白复合微胶囊。
34.本发明的第三个目的是提供一种所述的丝素蛋白复合微胶囊在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
35.本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
36.(1)本发明所述的丝素蛋白复合微胶囊将loxpdna封装到丝素蛋白复合微胶囊中并吸附il-4，然后转染到软骨细胞中以促进ecm沉积和胶原交联，显著促进了受损软骨的修复。
37.(2)本发明所述的丝素蛋白复合微胶囊是一种具有生物活性的基因递送载体，利用层层自组装制备丝素微囊，内含具有促进基质合成的赖氨酰氧化酶质粒dna(loxpdna)，同时丝素经过点击化学修饰上肝素寡糖，利用肝素寡糖特异性吸附白介素4(il-4)，il-4可以促进巨噬细胞向促进修复的m2型极化，调控了损伤处的免疫微环境，抑制炎症。
38.(3)本发明所述的丝素蛋白复合微胶囊以丝素蛋白为基材，丝素蛋白作为天然聚合物具有良好的生物相容性与力学特性，能够制备多种结构的生物支架材料并可以服务于组织工程与药物释放领域。丝素蛋白也具有与细胞可粘附位点rgd多肽相类似的氨基酸序列，有利于细胞的粘附、增殖与迁移。
39.(4)本发明所述的丝素蛋白复合微胶囊具有免疫调控和组织修复的双重功能，其中免疫调控是通过丝素微囊表面修饰的il-4实现的，组织修复是通过丝素微囊内部的loxpdna实现的。能够有效调节受损软骨的免疫微环境和胞外基质合成、促进软骨再生。并且可根据实际场景改换活性物质，是一种有效、高效的药物递送系统。
40.(5)本发明所述的丝素蛋白复合微胶囊为了减轻oa的炎症环境，用肝素二糖(hd)修饰sf，这是一种能够通过点击化学特异性吸附il-4的二价化合物。hd被用作低分子量的肝素，在保持有益的生物功能的同时，会产生较少的副作用。
41.(6)本发明所述的丝素蛋白复合微胶囊预先与gelma水凝胶结合，随后注射到损伤部位发现sfm持续释放loxpdna。此外，loxpdna的释放速率可以通过调节复合壳的层数来控制，转染效率稳定在近55％。此外，lox pdna和il-4的协同作用有效地促进了受损软骨的再生。
42.(7)本发明所述的制备方法对生物活性分子影响小，能保持其功能性；层层自组装是利用静电吸附和丝素β折叠这一特殊结构来实现的，丝素可以自发地层层组装在一起，可实现微囊大小、组装层数(厚度)可调。药物释放的速率快慢可通过调控组装层数来实现，利
用这一方法，可以根据实际应用场景，针对不同疾病针制备不同药物释放速率的载体。
附图说明
43.为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
44.图1为本发明丝素蛋白复合微胶囊的制备和表征；其中：a为sfm准备示意图；b为ps、8l-sf/ps形态的sem表征和8l-sfm的ps芯去除；比例尺＝500nm；c为用fitc标记sf，丝素蛋白复合微胶囊的sf沉积层通过激光共聚焦显微镜(clsm)成像，左边的图像显示丝素蛋白复合微胶囊的低放大率，比例尺＝20μm；右边的图像显示丝素蛋白复合微胶囊的放大率更高，比例尺＝10μm。
45.图2为本发明lox质粒dna加载使用预方法；其中：a为用loxpdna加载丝素蛋白复合微胶囊的示意图；b为cy3-il-4和fitc-loxpdna的使用在clsm上的丝素蛋白复合微胶囊中产生红色外周和绿色核心，表明丝素蛋白复合微胶囊内部含有lox-pdna；比例尺＝10μm；c为15μg/mlloxpdna的最佳负载效率(1.68
×
108sfm)。
46.图3为本发明丝素蛋白复合微胶囊的细胞毒性和转染效率；其中：a为cck-8测定表明，sfm和丝素蛋白复合微胶囊是生物相容的；b为loxpdna释放；c为il-4释放；d为通过测量gfp+细胞的百分比来测定loxpdna的转染效率，比例尺＝200μm。
47.图4为本发明体外研究丝素蛋白复合微胶囊对巨噬细胞极化的影响，分别染色cd86和cd206指标，比例尺＝400μm。
48.图5为本发明体内研究丝素蛋白复合微胶囊对受损软骨再生的影响；其中：a为h&e染色显示细胞分布、结构完整性和组织形态，比例尺＝100μm；b为藏红花o-快绿染色显示ecm再生，比例尺＝100μm。
具体实施方式
49.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
50.在本发明中，除非另有说明，gfp标记的loxpdna溶液购自南京金斯瑞生物科技股份有限公司，型号为c8673gi100-1。
51.实施例1丝素蛋白的纯化和异硫氰酸荧光素(fitc)标记
52.(1)丝素蛋白的纯化：将蚕茧在0.02mna2co3水溶液中煮沸1h，并用去离子水洗涤4次。将洗涤的sf(silkfibroin，丝素)在37℃下干燥过夜。然后将干燥的sf浸泡在9.3mlibr溶液中，在60℃下加热并搅拌4h。随后将溶液倒入透析袋(mwco3.5kda)中，并用去离子水透析3天；每12h更换一次水。透析液最终过滤并在4℃下储存，得到sf溶液。
53.(2)异硫氰酸荧光素(fitc)标记：首先将上述sf溶液稀释至2％(w/v)。然后，将10ml2％sf溶液用2-(吗啉基)乙磺酸(mes)缓冲液(0.1m，0.9％nacl)透析24h。然后，将80mg1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(edc)和220mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)与溶液混合15min。为了修饰sf的活化羧基，加入1.5mg乙二胺2h。将反应的溶液用0.1mmes缓冲液透析24h以除去残余试剂，并加入8.23mgfitc粉末；将混合物缓慢搅拌2h。最后，在透析后获得fitc标记的sf。
[0054]
实施例2丝素蛋白复合微胶囊loxpdna/il-4/sfm的制备
[0055]
(1)叠氮化合物sf的制备：将0.36mm4-叠氮苯胺盐酸盐溶于1ml乙腈水溶液(50％)中，随后与0.5ml1.43mm对甲苯磺酸一水合物水溶液混合。接着，加入0.715mm亚硝酸钠水溶液。整个过程在冰浴中反应。然后，加入2ml步骤(1)的sf溶液(ph＝9)，并在室温下与叠氮化合物基团反应30min，并用去离子水透析，叠氮化合物sf溶液。
[0056]
(2)炔hd的制备：edc(2mm)、nhs(5mm)和肝素寡糖(hd)(1.5mm)在mes缓冲液(0.1m，ph＝6)中混合。然后，溶解1.5mm氨基-peg4-炔并反应12h，透析后获得炔烃hd溶液。
[0057]
(3)hd-sf的制备：首先将上述炔烃hd溶液与抗坏血酸钠(0.2mm)、cuso4(0.1mm)和tbta(0.02mm)混合。随后加入叠氮化合物sf溶液并反应24h，得到hd-sf溶液。
[0058]
(4)微胶囊的制备：将hd-sf溶液的浓度稀释至1mg/ml，用去离子水冲洗200μl体积的5％(w/v)、4μm聚苯乙烯(ps)颗粒3次。接着，加入1ml0.5mg/ml25kda支链聚乙烯亚胺(bpei)水溶液以改变ps颗粒的表面电荷。然后将bpei25包被的ps颗粒与15μg/mlgfp标记的loxpdna溶液孵育20min。洗涤3次后，分散并与hd-sf溶液在4℃孵育15min。随后将该悬浮液离心并再次洗涤3次。将hd-sf涂覆的ps颗粒与90％甲醇孵育15min，以形成蚕丝的β-片结构，并使用氮气干燥。通过重复上述过程来操纵hd-sf壳层的层数。在获得所需数量的hd-sf壳层之后，使用四氢呋喃thf溶液完成ps的去除。最后，loxpdna@hd-sf在用去离子水透析后产生丝素微胶囊，将200μlloxpdna/sfm在37℃的20ng/ml白介素-4(il-4)溶液中孵育2h，得到lox pdna/il-4/sfm。
[0059]
测试例1
[0060]
4μmps被用作制备sf微胶囊的牺牲模板。将1mg/mlsf溶液不同的循环次数制备不同层数的sf壳(图1a)。与未经处理的ps颗粒相比，涂覆有8层sf的ps的光谱显示出3个典型的β-片结构峰，分别显示在1625cm-1
处的羰基拉伸、1516cm-1
处二次n-h弯曲和1230cm-1
处的c-n拉伸。丝素蛋白复合微胶囊的外观通过sem表征(图1b)。ps颗粒表面光滑。在用增加的sf层涂覆之后，ps颗粒的表面是粗糙的。由于sem成像之前的干燥过程，ps芯的移除导致丝素蛋白复合微胶囊内的结构坍塌。为了避免丝素蛋白复合微胶囊坍塌，用fitc预加载sf，并通过clsm进行评估(图1c)。结果显示，在较高的sf沉积层处荧光强度增加，这证实了丝素蛋白复合微胶囊的成功制造。
[0061]
测试例2lox-pdna在细胞转染效率
[0062]
使用pcdna3.1(+)-c-egfp克隆载体评估丝素蛋白复合微胶囊细胞转染效率。loxpdna先于gfppdna插入。因此，产生绿色荧光的细胞表明lox pdna表达成功。软骨细胞在24孔培养板中以每孔5
×
104培养。24h后，用500μl新鲜培养基孵育细胞。将含有负载loxpdna的丝素蛋白复合微胶囊的100倍稀释溶液添加到培养基中。最后，使用荧光显微镜在24h和48h鉴定gfp阳性细胞和lox基因表达。
[0063]
为了将loxpdna封装到丝素蛋白复合微胶囊中，首先用bpei25涂覆商业gfp标记的loxpdna，然后将其涂覆到ps颗粒的表面上，如先前的研究所述(图2a)。使用clsm证实了loxpdna的成功装载(图2b)。为了确定loxpdna负载的最佳量，使用不同剂量的loxpdna；负载效率的测定表明，15μg/ml的loxpdna最有效，为84.62％(图2c)。
[0064]
测试例3微囊调控巨噬细胞极化
[0065]
通过cck-8测定证实了bpei125/loxpdna的细胞毒性。与未经处理的细胞(对照)相
比，空载体(sfm)和丝素蛋白复合微胶囊(loxpdna/il-4/sfm)表现出优异的生物相容性，尽管loxpdna/il-4/sfm在第3天导致细胞活力略有降低。这主要是由于loxpdna/bpei125的缓慢、连续释放产生了累积效应(图3a)。因此随后评估loxpdna的累积释放。结果表明，与8层丝素蛋白复合微胶囊相比，4层loxpdna的累积释放更高，这进一步证实了通过丝素蛋白复合微胶囊层数量的改变可以改变loxpdna-释放动力学(图3b)。hd对il-4的特异性吸附也导致缓慢和连续的释放动力学(图3c)。根据gfp阳性软骨细胞的百分比确定loxpdna的转染效率；结果显示，超过50％的软骨细胞在48h被转染(图3d)。
[0066]
为了评估丝素蛋白复合微胶囊对巨噬细胞极化调节的影响，将软骨细胞与用il-4修饰的丝素蛋白复合微胶囊孵育。为了诱导m1极化，使用100ng/mllps和20ng/mlinf-γ。为了诱导m2极化，使用20ng/ml的il-4。所有样品处理48h，用免疫荧光法测定巨噬细胞极化；cd86和cd206分别被选为m1和m2表型标记。免疫荧光一级抗体的稀释比为1：200。
[0067]
由于sf被il-4修饰，sfm可以有效调节巨噬细胞的极化。cd86用于鉴定m1巨噬细胞表型，cd206用于鉴定m2巨噬细胞表型。作为对照，lps和il-4分别诱导m1和m2极化。骨髓来源单核巨噬细胞与loxpdna/il-4/sfm孵育后，免疫荧光鉴定出更多的cd206+细胞(图4)。相反，很少观察到cd86+细胞。这些结果表明loxpdna/il-4/sfm促进m2巨噬细胞极化。
[0068]
测试例4体内组织学评估
[0069]
使用受损的大鼠膝关节软骨模型评估加载loxpdna的丝素蛋白复合微胶囊对软骨再生的影响。总共75只雄性sd大鼠(250g)使用4％水合氯醛以1ml/100g的剂量麻醉。在6周和12周收集样品。使用数码相机(olympustg-6，日本)对软骨的宏观外观进行成像。为了进行组织学评估，将样品脱钙4周，嵌入石蜡中，并使用histocorebiocut切片机(leicabiosystems，wetzlar，germany)切成8μm切片。为了评估细胞分布、结构完整性和组织形态，进行了h&e染色。使用番红o-快绿染色来评估ecm再生。
[0070]
样品用h&e染色，以评估细胞分布、结构完整性和组织形态(图5a)。健康的软骨是光滑的，大多数软骨细胞形成柱状排列。植入后6周，明显可见致密组织填充受损部位。使用不含sfm的gelma水凝胶作为对照，导致6周后水凝胶降解，松散的纤维组织覆盖受损软骨部位的表面。在sfm组中，观察到新形成的纤维组织和聚集的细胞形态；再生组织之间的一些裂缝以及新生软骨和天然软骨之间的边界也很明显，这表明再生组织和天然软骨的结合不良。重要的是，丝素蛋白复合微胶囊在新形成的组织和天然软骨之间产生了有效的整合(图5a)。植入后12周，缺损组软骨明显减少。在gelma组中也观察到类似的现象。尽管植入的sfm在受损软骨部位产生了更好的再生结果，一些软骨细胞表现出柱状排列，但仅用sfm治疗未能整合新形成的组织和天然软骨。用loxpdna/il-4/sfm处理导致新形成的组织和天然软骨的良好整合，大多数软骨细胞呈现柱状排列。尽管不平坦的表面略微影响了新形成的组织的光滑度，ecm的重建表明再生组织是透明软骨，结构与天然软骨相似(图5a)。番红o-fast绿和胶原ii染色用于评估ecm再生。与其他组相比，loxpdna/il-4/sfm组表现出更深的番红-o-fast绿染色(图5b)。
[0071]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种丝素蛋白复合微胶囊，其特征在于，包括若干单层复合壳、包封于所述复合壳内的赖氨酰氧化酶质粒dna和吸附在所述复合壳表面的白介素-4；所述单层复合壳包含丝素蛋白和修饰在所述丝素蛋白上的肝素寡糖类物质；所述单层复合壳任选地被一层或多层另外的壳所包裹；所述的一层或多层另外的壳各自独立地包含丝素蛋白和任选的修饰在所述另外的壳中的肝素寡糖类物质；并且其中所述丝素蛋白和所述肝素寡糖类物质在各层壳之间是相同或不同的。2.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合微胶囊，其特征在于，所述若干单层复合壳的层数为2-9。3.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合微胶囊，其特征在于，所述丝素蛋白的分子量范围为3万-30万。4.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合微胶囊，其特征在于，所述肝素寡糖类物质选自肝素寡糖和/或肝素二糖。5.根据权利要求1-4任一项所述的丝素蛋白复合微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，s1、将聚乙烯亚胺包被的聚苯乙烯颗粒加入赖氨酰氧化酶质粒dna溶液中进行孵育，得到赖氨酰氧化酶质粒dna@聚乙烯亚胺/聚苯乙烯；s2、将s1所述的赖氨酰氧化酶质粒dna@聚乙烯亚胺/聚苯乙烯分散于肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白溶液中进行孵育，得到丝素蛋白包被的赖氨酰氧化酶质粒dna@聚乙烯亚胺/聚苯乙烯复合乳液；s3、将s2所述的复合乳液通过化学和/或物理处理进行固化、干燥，得到干粉状固体；s4、将s3所述的干粉状固体重新悬浮于s2所述的复合乳液中进行孵育，重复s2至s3一次或多次，利用有机溶剂将聚苯乙烯溶解，得到具有多层壳的微胶囊；s5、将s4所述的具有多层壳的微胶囊加入白介素-4溶液中进行孵育，得到所述的丝素蛋白复合微胶囊；其中，所述丝素蛋白和所述肝素寡糖类物质在各层壳之间是相同或不同的。6.根据权利要求5所述的丝素蛋白复合微胶囊的制备方法，其特征在于，在s1中，所述聚乙烯亚胺选自支链型聚乙烯亚胺，分子量为25kda-50kda。7.根据权利要求5所述的丝素蛋白复合微胶囊的制备方法，其特征在于，在s2中，所述肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白溶液中肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白的浓度独立地为1mg/ml-2mg/ml。8.根据权利要求5所述的丝素蛋白复合微胶囊的制备方法，其特征在于，在s2中，所述肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白的制备方法具体包括以下步骤：s21、向丝素蛋白溶液中加入叠氮化合物、对甲苯磺酸和亚硝酸钠，反应得到叠氮化合物/丝素蛋白；s22、将n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、氨基-二硬脂酸酯-炔和肝素寡糖溶于溶剂，反应得到炔烃化肝素寡糖；s23、向s22所述的炔烃化肝素寡糖中加入抗坏血酸钠、硫酸铜、叔丁基三氯乙酰亚胺酯、s21所述的叠氮化合物/丝素蛋白，反应得到所述的肝素寡糖类物质修饰的丝素蛋白。
9.根据权利要求5所述的丝素蛋白复合微胶囊的制备方法，其特征在于，在s5中，所述白介素-4溶液中白介素-4的浓度为10ng/ml-50ng/ml。10.一种权利要求1-4任一项所述的丝素蛋白复合微胶囊在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种丝素蛋白复合微胶囊及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明的丝素蛋白复合微胶囊，包括若干单层复合壳、包封于所述复合壳内的赖氨酰氧化酶质粒DNA和吸附在所述复合壳表面的白介素-4；所述单层复合壳包含丝素蛋白和修饰在所述丝素蛋白上的肝素寡糖类物质；所述单层复合壳任选地被一层或多层另外的壳所包裹；所述的一层或多层另外的壳各自独立地包含丝素蛋白和任选的修饰在所述另外的壳中的肝素寡糖类物质；并且其中所述丝素蛋白和所述肝素寡糖类物质在各层壳之间是相同或不同的。丝素蛋白复合微胶囊具有免疫调控和组织修复的双重功能，能够有效调节受损软骨的免疫微环境和胞外基质合成、促进软骨再生。进软骨再生。进软骨再生。


技术研发人员：夏婷婷 赵润泽 何双建 付雪杰 王亮
受保护的技术使用者：苏州科技城医院
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/10/8