一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法及其应用与流程

1.本发明涉及神经干细胞技术领域，具体为一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法及其应用。


背景技术：

2.现有的研究显示，神经干细胞微环境中主要是血管内皮细胞促进神经干细胞的自我更新，但是具体何种因子在其中起关键作用尚不清楚。因此，如何通过改变和调节神经干细胞微环境，以及在体外构建更加有利的微环境或培养环境调控神经干细胞的自我更新、分化能力和迁移的能力，是本行业研究的痛点和热点。


技术实现要素：

3.血管内皮细胞以合成和释放no进一步促进血管舒张在心血管系统中发挥着非常重要的作用，我们的研究发现其在神经干细胞周围通过调控神经干细胞微环境中no浓度，可以实现诱导神经干细胞的自我更新和迁移。no是人类机体中一种重要的功能分子参与多种生命活动过程。在生命过程调控分子这个庞大的家族中，no是第一个被揭示的气体类分子。由于no的脂溶性特征，它易于穿过磷脂双分子层而作用于细胞内部。
4.申请人经一系列实验发现no在一定浓度范围内可以促进神经干细胞增殖，抑制分化，但是超过阈值后则会抑制神经干细胞增殖，促进分化，甚至导致细胞凋亡；no作为重要信号分子，参与多种细胞活动，但浓度过高又会产生不利的影响。no既可以通过活化一氧化氮/可溶性鸟苷酸环化酶/环磷酸鸟苷信号通路(no/sgc/cgmp信号通路)，又可以活化一氧化氮/可溶性腺苷酸环化酶/环磷酸腺苷信号通路(no/cac/camp信号通路)。cgmp会促进干细胞增殖，是因为它在一定浓度下会激活蛋白激酶g，此酶属于疏基酶，它会使所有酸性非组蛋白磷酸化，同时可以使dna聚合酶的酶活性明显升高。另外，蛋白激酶g可通过自身磷酸化，使其与camp的亲和力加大，降低camp的活性，使cgmp的活性相对增强，更有利于dna复制进行。camp可以激活蛋白激酶a，蛋白激酶a可以使所有组蛋白磷酸化，使其与dna分子之间的结合变得松弛，更重要的是它还可以使一些不同的特异性酸性非组蛋白磷酸化。这些酸性非组蛋白正是基因上的特异去阻抑蛋白，当它磷酸化后，因酸性增强，负电荷分布发生变化，可与覆盖其上的、经过磷酸化后正电荷分布同样发生变化的碱性组蛋白作用，结果使二者均脱落，原来被遮蔽的基因完全暴露出来而显示出活性。因为不同的细胞中，dna链各处的酸性蛋白不同，因而被激活的基因也就各异。另外，蛋白激酶a还可以使rna聚合酶的6因子磷酸化，磷酸化后的6因子与中心酶结合形成全酶，然后与dna结合促进转录。cgmp在促进复制时，也需要一定量的camp，通过camp首先使组蛋白磷酸化，然后cgmp再使酸性非组蛋白磷酸化。cgmp促进复制，需要一定量的camp的协同，而camp促进转录，则要求cgmp达到最低值，这正是二者最本质的关系。通过控制no浓度，直接影响cgc和cac活性，进而控制cgmp与camp浓度，可能是no作用于神经干细胞决定神经干细胞的对外表型。
5.本发明的目的在于提供一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法及其应用，以解决
8269-9158ao,cahuana gm,et al.the role ofnitric oxide in stem cell biology.lid-10.3390/antiox11030497[doi]lid-497.antioxidants(basel).2022.11(3).】中也有在其它干细胞研究的成果显示一氧化氮对诱导多能干细胞的作用存在浓度依赖性。而通过本发明，申请人发现，no不仅能促进神经发生和神经干细胞增殖，还能为神经干细胞的迁移蓄积动力。为no联合神经干细胞移植疗法提供了新的思路。
附图说明
[0020]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0021]
图1为实施例1中血管内皮细胞-神经干细胞共培养体系中no的浓度测定结果，control组为没有培养过细胞的新鲜培养液，co-culture medium为血管内皮细胞-神经干细胞共培养体系中培养3天的培养液。数据采用unpaired t-test分析，展示为mean
±
sem，每组数据来源于三次独立重复实验，**代表p《0.01。
[0022]
图2为实施例1中各种培养基中no浓度测定的结果，control组为没有培养过细胞的新鲜神经干细胞贴壁培养液，co-culture medium为血管内皮细胞-神经干细胞共培养体系中培养3天的培养液，snp5μm、10μm、20μm、50μm分别是新鲜培养液中加入了相应浓度的snp，图中横线标注两个浓度比较接近。
[0023]
图3为实施例1中各种培养基中no浓度测定的结果，co-culture medium组为血管内皮细胞-神经干细胞共培养体系中培养3天的培养液；l-name 20μm组是共培养体系中加入20μm l-name继续培养3天的培养液。数据采用unpaired t-test分析，展示为mean
±
sem，每组数据来源于三次独立重复实验，**代表p《0.01。
[0024]
图4为实施例2共培养体系中干预no浓度对神经干细胞的作用，图(a)为各组细胞培养5天后，做细胞免疫荧光染色，绿色荧光信号为nestin阳性细胞，红色荧光信号为β-tublinⅲ阳性细胞，图中比例尺长度为50μm；图(b)为mnscs-mnscs与mnscs-mnscs(+10μm snp)，bend3-mnscs与bend3-mnscs(+20μm l-name)之间统计柱形图；数据统计自三次独立重复实验，使用one-wayanovafollowedby dunnett’s post test分析，展示为mean
±
sem，**代表p《0.01。
[0025]
图5为实施例2的snp处理后time lapse结果的截屏图，control组为正常贴壁培养；snp20μm组为贴壁培养的情况下加入20μm的snp；snp50μm组为贴壁培养的情况下加入50μm的snp，time lapse记录24小时，图中比例尺长度为50μm。
[0026]
图6实施例2的为撤掉培养体系中的snp后time lapse结果的截屏图，control组为正常贴壁培养；snp20μm组为贴壁培养的情况下加入20μm的snp，并在24小时后换成不含snp的新鲜贴壁培养液；snp50μm组为贴壁培养的情况下加入50μm的snp，并在24小时后换成不含snp的新鲜贴壁培养液；换液后在活细胞工作站中记录24小时，图中比例尺长度为50μm。
[0027]
图7为实施例2的time lapse 24h拍完之后的细胞免疫染色的结果，图(a)中绿色荧光信号为nestin阳性细胞，红色荧光信号为β-tublinⅲ阳性细胞；图中比例尺长度为50μm。图(b)为三个实验组阳性细胞统计柱形图；数据统计自三次独立重复实验，使用one-wayanovafollowedby dunnett’s post test分析，展示为mean
±
sem，**代表p《0.01，n.s.代表无统计学差异。
[0028]
图8为实施例3的人源神经干细胞培养的外观图。
[0029]
图9为实施例3的(3.1)中端粒酶活性检测结果柱形图；control为对照组，10μm snp和20μm snp为实验组，使用one-wayanovafollowedby dunnett’spost test分析，展示为mean
±
sem，n.s.代表无统计学差异。
[0030]
图10为实施例3的(3.2)中人源神经干细胞自发分化后细胞免疫染色的结果及细胞百分比统计图；图(a)左图为自发分化组，绿色荧光信号为nestin阳性细胞，红色荧光信号为gfap阳性细胞，紫色荧光为β-tublinⅲ阳性细胞。右图为加入了10μm snp的一组也在自发培养液中分化14天，图中比例尺长度为50μm。图(b)为阳性细胞百分比的统计柱形图，数据采用unpairedt-test分析，展示为mean
±
sem，每组数据来源于三次独立重复实验，**代表p《0.01。
[0031]
图11为实施例3的(3.3)中多巴胺标记蛋白th(tyrosine hydroxylase，酪氨酸羟化酶)的细胞免疫染色结果，图(a)为多巴胺分化组定向分化一个月后细胞免疫染色，红色荧光为th染色，蓝色荧光为dapi，图中比例尺为50μm。图(b)为阳性细胞百分比的统计柱形图，数据采用unpairedt-test分析，展示为mean
±
sem，每组数据来源于三次独立重复实验，**代表p《0.01。
[0032]
图12为实施例3的(3.4)中为人源神经干细胞加入snp作用后的细胞周期分布图，control组为不加入snp组，实验组分别加入10μm和20μm的snp，培养4天后进行细胞周期分析。
[0033]
图13为实施例4的pd小鼠模型移植人源神经干细胞后运动能力检测结果，数值对应表4。
[0034]
图14为实施例4的pd小鼠模型移植人源神经干细胞后纹状体中da及其代谢产物含量检测，数值对应表5。
[0035]
图15为实施例4的pd小鼠模型移植人源神经干细胞后纹状体中5-ht及其代谢产物含量检测，数值对应表5。
具体实施方式
[0036]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]
dmem/f12培养基(invitrogen公司，货号11320033)；
[0038]
na-pyruvate(thermo fisher公司100x，货号11360-070)；
[0039]
b27血清替代物(thermo fisher公司50x，货号12587010)；
[0040]
n2血清替代物(thermo fisher公司100x，货号17502048)；
[0041]
bfgf碱性成纤维生长因子(厂家thermo fisher，货号af10018b)；
[0042]
egf表皮生长因子(厂家thermo fisher，货号af10015)；
[0043]
l-glutamine(thermo fisher公司100x，货号25030-149)；
[0044]
胎牛血清(fbs)(厂家adamas life，货号c8010)；
[0045]
木瓜蛋白酶(papain)(厂家sigma，货号ls003126)；
[0046]
n-乙酰-l-半胱氨(500mm 100x)(厂家：国药，货号62024261)；
[0047]
核酸内切酶(dnase)(sigma公司，货号en0521)；
[0048]
总一氧化氮检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号s0023)；细胞与组织裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号s3090)；
[0049]
l-name(ng-nitro-l-arginine methyl ester)(厂家sigma，货号11030-5g)。
[0050]
专业术语中英文或简写对照
[0051]
硝普钠：sodiumnitroprusside，snp
[0052]
原代鼠源神经干细胞：mouse neural stem cells，mnscs
[0053]
基础培养基：base media
[0054]
木瓜蛋白酶：papain
[0055]
神经干细胞冬眠液：hibernation medium，hib
[0056]
n-乙酰-l-半胱氨：n-acetyl-l-cysteine，nac
[0057]
人源神经干细胞：human neural stem cells，hnscs
[0058]
神经干细胞：neural stem cells，nscs
[0059]
对照组：control
[0060]
酪氨酸羟化酶：tyrosine hydroxylase，th
[0061]
帕金森病：pd
[0062]
碱性成纤维生长因子：basic fibroblast growth factor，bfgf
[0063]
表皮生长因子：egf
[0064]
小鼠脑微血管内皮细胞：bend3
[0065]
人脐静脉内皮细胞：huvec
[0066]
腹侧端脑的神经节隆起，ganglionic eminence，ge
[0067]
小鼠胚胎期(e11.5)神经干细胞的获取
[0068]
基础培养基(base media)的制备：100ml dmem/f12培养基+1ml na-pyruvate(100x)+1ml l-glutamine(100x)混合，然后用0.22μm的滤器无菌过滤。
[0069]
木瓜蛋白酶(papain)组织消化裂解液的制备：5ml基础培养基(base media)+100units木瓜蛋白酶+50μlnac(500mm 100x)混合，细胞培养箱中至少孵育激活半小时，用之前加入30μl核酸内切酶(dnase)并用0.22μm的无菌滤器过滤。
[0070]
具体操作步骤如下：
[0071]
所有操作的手术器械用之前需75％乙醇消毒灭菌。
[0072]
将神经干细胞冬眠液(保护神经干细胞的缓冲液)加到3个10cm培养皿和2个35mm培养皿中，取1个加满液体的培养皿到解剖台准备迎接取出的胚胎。
[0073]
将实验用的孕鼠断颈处死，剪开腹部将胚胎连同子宫分离出来，放入加有神经干细胞冬眠液的10cm培养皿中。
[0074]
仔细逐个分离出每个胚胎，然后转移到一个新的加有神经干细胞冬眠液的10cm培养皿中，如果转移到新的培养皿中还是感觉神经干细胞冬眠液液体不够澄清，可以再次转移的新的培养皿中，保持无菌操作，最后转移到体视显微镜下进行下一步的操作。
[0075]
用极细的直镊和弯镊轻轻地将大脑的两个半球分开。
[0076]
在直镊和弯镊的配合下将大脑半球的最外层结缔膜剥离，然后再小心的剥离紧贴
大脑皮层的血管膜，小心去除突出的ge(ganglionic eminence，腹侧端脑的神经节隆起)部分，最后剩余的部分即是大脑皮层，放入带有神经干细胞冬眠液的35mm的培养皿中。
[0077]
所有的胚胎都是按照上述的操作处理，得到每个胚胎的大脑皮层组织。
[0078]
拿到所有胚胎的大脑皮层组织后，用弯镊尽量把每块组织剪碎。
[0079]
用1ml的移液枪将所有的这些组织碎片转移到15mlbd管中，300g离心5min将组织离心到管底，然后用吸管吸走多余的神经干细胞冬眠液。
[0080]
将激活的木瓜蛋白酶溶液加入30μl核酸内切酶，并用0.22μm的无菌滤器过滤，然后加入到上述标记好的15mlbd管中。
[0081]
然后在37℃培养箱中消化30min，每隔10min摇晃bd管，增大组织与消化酶的接触面积，促进消化。
[0082]
最后一次摇晃后，从培养箱中取出，放入离心机中以405g的转速离心10分钟。
[0083]
小心弃掉上层的木瓜蛋白酶裂解液，保留沉淀。
[0084]
然后用无菌的dmem/f12培养基清洗3次，每次都离心，小心去除上清保留沉淀。离心的过程是30min。
[0085]
第三次清洗细胞之后，用神经干细胞冬眠液重悬细胞然并计数，根据具体实验要求加入不同数量的细胞培养。
[0086]
一氧化氮浓度的测定
[0087]
采用总一氧化氮检测试剂盒。
[0088]
样品处理：含有高浓度蛋白的样品例如血清、含有高浓度血清的细胞培养液，在加入griess reagent i后可能会产生沉淀。可以取50微升样品，加入50微升griess reagent i进行测试，观察是否产生沉淀。如果产生沉淀，则可以把样品沸水浴加热5分钟，以变性蛋白，然后12，000g离心5分钟，取上清用于后续的测定。对于细胞或组织样品可以用碧云天生产的细胞与组织裂解液(一氧化氮检测用)进行裂解。对于尿液样品，通常需要用水稀释10-50倍后检测。不宜使用肝素抗凝的血浆，肝素抗凝的血浆在和griess reagent反应时会产生沉淀。
[0089]
稀释标准品：用制备或稀释样品时所使用的溶液把1m nano2稀释成2、5、10、20、40、60、80μm。例如样品为使用s3090裂解获得的细胞裂解液，则宜使用s3090稀释标准品；样品为细胞培养液，则用该培养液稀释标准品。如果样品为血清，则可以使用本试剂盒提供的样品稀释液(s0023-1)或简单地使用pbs、生理盐水等适当溶液稀释标准品。稀释的标准品宜现配现用，不宜冻存后使用。
[0090]
试剂的准备：a.加约1ml双蒸水或milli-q级纯水至5mgnadph中，颠倒混匀溶解后，再用双蒸水或milli-q级纯水定容至3ml，配制成2mm nadph，除立即使用的部分外，其余nadph溶液必须立即分装后-70℃冻存。b.fad已经配制在适当溶液中。fad可以适当分装后-20℃或-70℃保存。c.nitrate reductase和ldh在临用前取出，并放置在冰浴上使用(注意在使用完毕后立即-20℃保存)，试剂盒中的其余各种试剂在溶解后保存在冰浴上。griess reagent i和griess reagent ii在使用前需达到室温。根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮的浓度。实际测定时，由于反应条件、试剂盒批次的不同等因素，会导致检测结果与示例数据存在一定差异。
[0091]
注意事项：a.反应必须避光进行。如果使用96孔板进行检测，可以使用铝箔纸包裹
96孔板进行避光。b.样品的用量上限为60微升，血清、血浆或组织匀浆液通常使用40微升就足够了。样品不足60微升时，不同样品之间的体积需要保持一致，体积不足的部分用制备或稀释样品时所使用的溶液补足。标准品可以参考上表使用60微升。c.可以同时设置加入200微升水或pbs的2-3个孔为阴性对照，这2-3个孔仅仅加入水或pbs，不再加入任何其他试剂。d.第一部分37℃孵育30分钟后，直接参考上表依次加入ldh buffer和ldh，并进行后续孵育。e.第二部分37℃孵育30分钟后，直接参考上表依次加入griess reagent i和griess reagent ii。加入griess reagent i后需要轻轻混匀。f.每次混匀后，可以1000-3000g离心数秒，把液体沉淀到管底。同时需避免各检测孔中产生气泡，以免气泡干扰检测结果。g.检测时，如无540nm滤光片，520-560nm的滤光片也可以使用。如无酶标仪或合适的滤光片，也可以通过数码相机拍照后在适当图形软件中进行定量分析，并确定样品中一氧化氮的浓度。拍照比色时标准品需要更为精细的浓度梯度。
[0092]
神经干细胞贴壁培养液：以12ml为例，12ml基础培养基+120μln2血清替代物+120μlnac+240μlb27血清替代物+bfgf(终浓度10ng/ml)，使用前用0.22μm的无菌滤器过滤。
[0093]
神经干细胞悬浮培养液：以12ml为例，12ml基础培养基+120μln2血清替代物+120μlnac+240μlb27血清替代物+bfgf(终浓度20ng/ml)+egf(终浓度20ng/ml)，使用前用0.22μm的无菌滤器过滤。
[0094]
神经干细胞自发分化培养液：以12ml为例，12ml基础培养基+120μln2血清替代物+120μlnac+240μlb27血清替代物，使用前用0.22μm的无菌滤器过滤。
[0095]
神经干细胞冬眠液：以1000ml为例，称取以下试剂组分：2.24g的kcl，0.2g的naoh，0.6g的nah2po4，0.4g的六水合mgcl2，2.2g的丙酮酸钠，1g的葡萄糖，36.4g的sorbitol，900ml注射用水溶解后调ph至7.3-7.4，最终用注射用水定容到1000ml，然后用0.22μm的无菌滤器过滤备用。
[0096]
多巴胺神经元诱导培养液：
[0097]
第一步用a液：以50ml为例，50ml基础培养基+500μln2血清替代物+500μlnac+1mlb27血清替代物+bfgf(终浓度20ng/ml)+egf(终浓度20ng/ml)，shh(终浓度200ng/ml)，fgf8b(终浓度100ng/ml)，chir00021(终浓度0.5μm)，使用前用0.22μm的无菌滤器过滤。
[0098]
第二步用b液：以50ml为例，50ml基础培养基+1ml b27血清替代物+bdnf(终浓度20ng/ml)+gdnf(终浓度20ng/ml)，tgfβ3(终浓度20ng/ml)，ascorbic acid(终浓度100μm)，camp(终浓度0.5mm)，forskolin(终浓度50nm)，使用前用0.22μm的无菌滤器过滤。
[0099]
实施例1：鼠源神经干细胞和内皮细胞共培养体系中no浓度的测定
[0100]
1)将内皮细胞以2000个细胞/transwell接种于transwell insert小室的膜上，在含有10％fbs的dmem/f12培养基中培养3天，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％；
[0101]
2)将铺有内皮细胞的transwell用dmem/f12培养基冲洗3遍并转移到神经干细胞贴壁培养液中，培养4小时，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％；
[0102]
3)选取小鼠胎龄在11.5天的皮层细胞，制取e11.5的原代鼠源神经干细胞10000个细胞/transwell(mouse neural stem cells，mnscs)；
[0103]
4)对照组(control)使用新鲜的神经干细胞贴壁培养液；co-culture medium为血管内皮细胞-神经干细胞共培养体系；snp5μm、10μm、20μm、50μm分别是新鲜培养液中分别含有相应浓度的snp；
[0104]
5)将六组样品一同放入培养箱中培养三天，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％；
[0105]
6)撤掉共培养体系中的snp后，用针对硝酸根离子的总一氧化氮检测试剂盒分别检测六组样品中的no浓度；
[0106]
7)向共培养体系中加入20μm l-name继续培养3天，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％与共培养体系中的培养液一起检测no的浓度。
[0107]
实施例2：改变共培养体系中no的浓度对神经干细胞的影响
[0108]
1)设立四个实验组：mnscs-mnscs共培养对照组、bend3-mnscs共培养组、bend3-mnscs共培养同时添加20μm l-name组、mnscs-mnscs的共培养体系同时添加10μm snp组；
[0109]
2)将四组样本同时放入培养箱培养，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％，5天后做免疫荧光染色分析下层鼠源神经干细胞的自我更新和分化情况；
[0110]
3)设立三个实验组：对照组(control)使用新鲜的神经干细胞贴壁培养液；snp20μm组和snp50μm组分别是新鲜培养液中分别含有相应浓度的snp；
[0111]
4)将三组样本同时放入培养箱培养，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％，time lapse记录24小时，去除培养体系中no后继续培养，time laspe记录24h，24h后做免疫荧光染色分析下层鼠源神经干细胞的自我更新和分化情况。
[0112]
实施例3：no对人源神经干细胞作用的研究(安全性和功能性)
[0113]
人源神经干细胞来自上海市东方医院国家干细胞库的神经干细胞系，细胞扩增时所用培养液为神经干细胞悬浮培养液，神经干细胞成球生长，外观形态呈圆形，细胞大小均一，悬浮于培养液中。培养一周后肉眼可见神经球形成，神经球的形态与已有文献中展示的图片相符。此人源神经干细胞与文献中报道的人源神经干细胞形态接近，培养过程中有神经球的形成，培养到14天后神经球的大小可以用于传代。
[0114]
(3.0)人源神经干细胞和人脐静脉内皮细胞共培养体系中no浓度的测定
[0115]
1)将人脐静脉内皮细胞(huvec)以2000个细胞/transwell接种于transwell insert小室的膜上，在含有10％fbs的dmem/f12培养基中培养3天，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％；
[0116]
2)将铺有huvec的transwell用dmem/f12培养基冲洗3遍并转移到神经干细胞贴壁培养液中，培养4小时，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％；
[0117]
3)选取生长状态好的人源神经干细胞10000个细胞/transwell；
[0118]
4)对照组(control)使用新鲜的神经干细胞贴壁培养液；co-culture medium为血管内皮细胞-神经干细胞共培养体系；snp5μm、10μm、20μm、50μm分别是新鲜培养液中分别含有相应浓度的snp；
[0119]
5)将六组样品一同放入培养箱中培养三天，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％；
[0120]
6)撤掉共培养体系中的snp后，用针对硝酸根离子的no检测试剂盒分别检测六组样品中的no浓度；
[0121]
(3.1)no对人源神经干细胞的端粒酶活性的影响
[0122]
1)设立三个实验组：control组使用新鲜的神经干细胞悬浮培养液，10μmsnp组和20μm snp组培养液中分别含有对应浓度的snp；
[0123]
2)将三组样本同时放入培养箱，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％，培养5天后分别进行端粒酶活性检测。
[0124]
(3.2)no对人源神经干细胞的自发分化的影响
[0125]
1)设立三个实验组：control组使用新鲜的神经干细胞自发分化培养液，10μm snp组和20μm snp组培养液中分别含有对应浓度的snp；
[0126]
2)将三组样本同时放入培养箱，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％，培养14天后取出进行免疫荧光染色分析下层神经干细胞的自我更新和分化情况。
[0127]
(3.3)no对人源神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化的影响研究
[0128]
1)设立两个实验组：定向分化组，将hnscs用多巴胺神经元诱导培养液稀释成细胞悬液，按照5
×
104细胞/ml的密度接种于预先用laminin包被好的6孔板中培养；20μm snp组，操作按照定向分化组，只是在多巴胺神经元诱导培养液中始终保持20μm的snp；
[0129]
2)将两组样本同时放入培养箱，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％，培养一个月后取出进行免疫荧光染色分析下层神经干细胞的自我更新和分化情况。
[0130]
(3.4)no影响人源神经干细胞的周期分布
[0131]
1)设立三个实验组：control组使用新鲜的神经干细胞贴壁培养液，10μmsnp组和20μm snp组培养液中分别含有对应浓度的snp；
[0132]
2)将三组样本同时放入培养箱，细胞培养箱设置：温度35℃，co2浓度为5％，培养4天后进行细胞周期分析。
[0133]
实施例4：no对人源神经干细胞在pd(帕金森病)小鼠模型中移植的影响
[0134]
1)选择6周龄，体型均匀的spf级balb/c小鼠，体重约18g～20g，随机分为四组：sham组、mptp组、hnsc组和hnsc+snp 20μm组每组7-8只；
[0135]
2)mptp组、hnsc组和hnsc+snp 20μm组腹腔注射mptp 20mg/kg/d，连续注射14天；sham组使用等体积生理盐水进行腹腔注射，操作及注意事项相同，mptp给药结束后，转棒实验选取合格的pd小鼠模型进行后续实验；
[0136]
3)hnsc组和hnsc+snp 20μm组小鼠给以相应的药物处理，每侧给细胞数量为1
×
105，细胞悬液体积为2μl/每侧鼻孔，每周给一次细胞，连续给4周细胞；sham组、mptp组使用等体积pbs给药，操作及注意事项相同，给细胞前和给细胞后每2周测试体重1次，每4周进行一次转棒实验；
[0137]
4)行为学评估完成后，各组随机选三只小鼠，处死动物后取纹状体组织。用hplc的方法检测纹状体中da递质及其代谢物dopac、5-ht及其代谢物5-hiaa的含量。
[0138]
结果与分析
[0139]
实施例1的共培养体系中no浓度的测定研究发现，根据图1显示结果，血管内皮细胞与神经干细胞共培养体系中no的浓度在5-10nm之间；根据图2显示，no浓度检测的结果显示共培养体系中no的浓度与添加10μm snp的神经干细胞贴壁培养液中no的浓度比较接近；根据图3显示，加入l-name 20μm组的培养体系中no的浓度降低了70％左右。
[0140]
实施例2的改变共培养体系中no的浓度对神经干细胞的影响研究可知，根据图4显示，共培养体系中加入20μm的l-name之后，血管内皮细胞与神经干细胞共培养体系促进神经干细胞自我更新的能力显著降低，l-name组中神经干细胞分化产生的β-tublinⅲ阳性细胞比率接近于对照组(mnscs-mnscs)。而神经干细胞与神经干细胞共培养添加10μm snp组
中的神经干细胞保持了很好的自我更新能力，保持神经干细胞属性的细胞(nestin阳性细胞的比例)，接近于血管内皮细胞-神经干细胞培养组，与mnscs-mnscs组相比有显著性差异，结果见附图4(b)。这一结果显示干预共培养体系中no的浓度能调控鼠源神经干细胞的自我更新和分化；根据图5显示，与对照组相比添加20μm snp和50μm snp的实验组都展现出细胞由贴壁的生长的状态向成球生长转换；根据图6显示，换液后原先成球的细胞能快速的向周围迁移，贴壁速度要大于未成球的细胞；根据图7显示，迁移出来的细胞多为nestin阳性的细胞，保持了分化潜能，我们还观察到神经球里的细胞迁移的能力显著强与对照组。
[0141]
实施例3的人源神经干细胞培养14天后的外观见图8，人源神经干细胞悬浮培养14天后显微镜下拍照100
×
，图中比例尺长度为500μm，左图为文献报道(svendsen et al.,1997)的人源神经干细胞图片，右图为本技术所培养的人源神经干细胞图片。此人源神经干细胞与文献中报道的人源神经干细胞形态接近，培养过程中有神经球的形成，培养到14天后神经球的大小可以用于传代。
[0142]
实施例3的(3.1)关于no对人源神经干细胞的端粒酶活性的影响，根据表1和图9显示，结论为：培养体系中加入no并不能改变人源神经干细胞端粒酶的活性，保证了这一干预的安全性。
[0143]
表1源神经干细胞端粒酶活性的检测结果(tpg/10000细胞)
[0144][0145][0146]
实施例3的(3.2)关于no对人源神经干细胞的自发分化的影响，根据图10左图显示，对照组在贴壁培养自发分化的实验条件下，能很好的分化gfap阳性的细胞(12
±
3％)，β-tublinⅲ阳性的细胞(64
±
6％)，保留了很少的nestin阳性的细胞(14
±
4％)；实验组免疫染色的结果附图10右图所示，nestin阳性的细胞占绝大多数(78
±
8％)，而分化的细胞比较少，gfap阳性细胞(4
±
2％)，β-tublinⅲ阳性的细胞(11
±
4％)。说明no抑制了人源神经干细胞的分化，这一实验结果与鼠源神经干细胞上no的作用相一致，区别在于作用于人源神经干细胞上的no的供体snp浓度为20μm，要高于鼠源神经干细胞上的浓度10μmsnp。当去除培养体系中no后，细胞又重新进入分化进程。
[0147]
实施例3的(3.3)关于no对人源神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化的影响研究，根据图11显示，经过1个月的培养，对照组细胞几乎不增殖，成单细胞状态，th阳性的细胞占到85
±
6％。snp 20μm组能观察到细胞成球的特点，有细胞增殖，th阳性的细胞占细胞总数的35
±
11％，说明no能抑制神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化。
[0148]
实施例3的(3.4)关于no影响人源神经干细胞的周期分布研究，根据图12和表2显示，snp对人源神经干细胞的细胞周期分布的影响体现在，g1细胞比例减少，s期和g2/m期细胞比例增多，这一结果显示了no促进了细胞周期进程，使细胞增殖增加。
[0149]
表2hnscs细胞周期检测结果记录表
[0150][0151]
实施例4的no对人源神经干细胞在pd小鼠模型中移植的影响研究，根据图13、14、15和表3、4和5显示，鼻腔给予人源神经干细胞对mptp诱导的pd模型小鼠运能能力具有改善作用。改善效果最显著的时间是第一次给细胞后的的第8周，说明干细胞的治疗，发挥作用时间长，这符合干细胞的作用机制。鼻腔给予人源神经干细治疗可明显提高mptp诱导的pd模型小鼠中脑纹状体多巴胺的分泌量，尤其是人源神经干细胞与20μm的snp一起通过鼻腔给到pd小鼠模型体内，效果比单独给细胞显著，两组之间中脑纹状体多巴胺的分泌量有显著差异，说明no有增强人源神经干细胞移植疗法的治疗效果。
[0152]
表3各实验组小鼠体重数据(x
±
sd，g，n＝5)
[0153][0154]
表4各实验组小鼠不同时间节点转棒结果比较(x
±
sd，秒，n＝5-8)
[0155][0156]
表5第12周纹状体中神经递质及其代谢产物的含量比较结果(x
±
sd，ng/mg，n＝5)
[0157][0158]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程方法物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程方法物品或者设备所固有
的要素。
[0159]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，诱导过程中加入5-10nm的no。2.根据权利要求1所述的一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，诱导条件为：温度35℃，co2浓度为5％。3.根据权利要求1所述的一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，所述no的供体为snp。4.根据权利要求3所述的一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，所述snp的浓度为5～50μm。5.根据权利要求4所述的一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，所所述的神经干细胞为原代鼠源神经干细胞或人源神经干细胞的任意一种。6.根据权利要求5所述的一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，诱导所述的人源神经干细胞时，所述snp的浓度为20μm。7.根据权利要求5所述的一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法，其特征在于，诱导所述的原代鼠源神经干细胞时，所述snp的浓度为10μm。8.根据权利要求1～7任一所述的诱导神经干细胞增殖和迁移的方法获得的神经干细胞在治疗神经系统疾病、神经退行性疾病任意一种中的应用。9.根据权利要求6所述的诱导神经干细胞的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病为帕金森病、阿尔兹海默病、脑卒中、脊髓损伤、脑瘫其中的任意一种。

技术总结
本发明提供了一种诱导神经干细胞增殖和迁移的方法及其应用，包括使用一定浓度一氧化氮诱导神经干细胞保持干细胞特性，以及蓄积迁移动力，撤除培养体系中一氧化氮后，神经干细胞的分化能力并未丢失，能正常分化出神经元和胶质细胞，而且迁移能力显著增强。本发明使用一氧化氮的诱导浓度在5-10nM，能显著地增强干细胞自我更新的能力，并能为神经干细胞的迁移蓄积动力。为神经干细胞移植后自我更新和迁移提供干预手段和方法，更有利于神经干细胞移植疗法的推广和应用。疗法的推广和应用。疗法的推广和应用。


技术研发人员：孙希财 王晓明 赵雄飞
受保护的技术使用者：上海安集协康生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/10/8