一种长双歧杆菌ZJ1发酵物及其制备方法、应用与流程

一种长双歧杆菌zj1发酵物及其制备方法、应用
技术领域
1.本发明涉及长双歧杆菌技术领域，尤其涉及一种长双歧杆菌zj1发酵物及其制备方法、应用。


背景技术：

2.当皮肤暴露于紫外线辐射下时，黑色素的生成会通过黑素生成的关键酶酪氨酸酶的激活而增强。因此，抑制酪氨酸酶的活性或其表达会减少黑色素的进一步生成，从而达到改善皮肤肤色的目的。
3.益生菌是活的微生物，给予足够的数量能给宿主带来健康益处。益生元是益生菌的食物，而后生元是指对动物健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。每种益生菌菌株都有其独特的生理生化性质，产生的次级代谢产物也丰富多样，作用也各不相同。
4.双歧杆菌属(bifidobacterium sp.)是一种革兰氏阳性菌，存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等。双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成，可以作为益生菌使用。中国专利cn 110373368 a公开了一种长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1，该菌株是从长寿老人粪便中分离筛选而得，且已于2019年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc 18032。其公开了长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌均有抑制效果，具有抑制胃肠道致病菌、降低胆固醇、耐h2o2的作用。本发明针对长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1进行进一步研究，以扩展其用途。


技术实现要素：

5.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种长双歧杆菌zj1发酵物及其制备方法、应用，本发明发现长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵物具有抑制黑色素的作用；可用于制备抑制黑色素化妆品、抑制黑色素药品、抑制黑色素保健品。
6.本发明提出了一种长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物，所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物为长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物中的至少一种。
7.长双歧杆菌属于益生菌的一种，由于益生菌的功效具有菌株特异性，发明人筛选多个长双歧杆菌菌株，发现长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物具有抑制黑色素的作用。
8.所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1，来源于长寿老人肠道中，命名为长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1，且已于2019年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc 18032。
9.本发明所使用的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1为卓源健康科技有限公司赠送得到。
10.本发明还提出了上述长双歧杆菌发酵物的制备方法，制备发酵滤液时，包括如下
步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，固液分离，取液体，调节ph＝7.2-7.4得到发酵滤液；
11.制备菌体裂解物时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液中的菌体，用pbs缓冲液重悬，然后超声破碎，固液分离，取液体得到菌体裂解物；
12.制备溶胞物时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，超声破碎，固液分离，取液体得到溶胞物；
13.制备多糖粗提物时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，经脱蛋白处理，然后对溶液进行醇沉处理，取固体得到多糖粗提物。
14.上述pbs缓冲液为磷酸缓冲盐溶液的简称，可从市场购得。
15.优选地，将长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1接种到mrsl培养液中，调节ph＝5.8-6.8，厌氧发酵培养得到长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液。
16.优选地，mrsl培养液的配方为：每1l水中含有15-25g/l的葡萄糖、8.0-12.0g/l的蛋白胨、7.0-9.0g/l的牛肉粉、3.5-4.5g/l的酵母粉、1.5-2.5g/l的磷酸氢二钾、1.5-2.5g/l的柠檬酸氢二铵、4.5-5.5g/l的乙酸钠、0.1-0.3g/l的硫酸镁、0.03-0.05g/l的硫酸锰、0.8-1.2g/l的吐温80和0.4-0.6g/l的l-半胱氨酸盐酸盐。
17.mrsl培养液需经118℃高压高温灭菌15min后才能使用。
18.上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵前需经活化、种子培养处理，然后在mrsl培养液接种长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的种子培养基进行发酵；发酵时的接种量可以为2-4％(v/v)。
19.优选地，长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液的ph＝4.0-4.4。
20.优选地，发酵培养的温度为36-38℃，发酵时间为16-24h。
21.发明人通过对发酵时的接种量(1％、2％、4％、8％、12％、16％)、发酵初始发酵液的ph(5.0、6.0、6.5、7.0、8.0和未调节ph的mrsl培养液ph为5.7)、发酵时间(12h、15h、18h、21h、24h、36h)进行筛选，以发酵液菌体细胞密度od
600
做为指标，进行菌体培养检测，筛选出最适宜的发酵条件，能获得大量的菌体；例如发酵初始发酵液的ph的筛选结果如图1所示。
22.优选地，制备菌体裂解物时，超声破碎3-5次，每次超声的程序相同，均为：以每超声3-5s后，间隔3-5s继续超声为一个循环，超声15-25个循环，超声功率为150-225w。
23.优选地，制备溶胞物时，超声破碎3-5次，每次超声的程序相同，均为：以每超声3-5s后，间隔3-5s继续超声为一个循环，超声15-25个循环，超声功率为150-225w。
24.优选地，制备多糖粗提物时，采用tca法进行脱蛋白处理。
25.上述tca法脱蛋白为本领域常用技术手段，具体步骤可以为：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，固液分离，取液体，加入300g/l三氯乙酸水溶液(液体与三氯乙酸水溶液的体积比为3:1)，混匀后于4℃静置1h，离心取上清得到脱蛋白上清液。
26.优选地，长双歧杆菌发酵物均经过滤除菌处理后，于-20℃以下保存。
27.上述过滤除菌的滤膜孔径≤0.22μm。
28.采用浓度为1mol/l的hcl水溶液或naoh水溶液调节ph。
29.本发明还提出了上述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物在抑制黑色素中的应用。
30.优选地，在制备抑制黑色素化妆品、抑制黑色素药品、抑制黑色素保健品中的应用。
31.有益效果：
32.发明人对长双歧杆菌进行筛选，并对长双歧杆菌的发酵物进行各项试验，发现长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵物具有抑制黑色素的作用；可用于制备抑制黑色素化妆品、抑制黑色素药品、抑制黑色素保健品。
33.发明人还优化筛选了长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵工艺和各个发酵物(发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物)的制备方法，能够提高长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的菌体产量和各发酵物的收率。
附图说明
34.图1为长双歧杆菌zj1发酵初始发酵液的ph的筛选结果。
35.图2为实施例6中各发酵物的体外酪氨酸酶活性抑制率的结果图，其中，a中各发酵物浓度相同，b为不同浓度各发酵物的体外酪氨酸酶活性抑制率的结果，monophenolase为酪氨酸单酚酶，diphenolase为酪氨酸二酚酶。
36.图3为实施例7中不同长双歧杆菌菌株的各发酵提取物和β-熊果苷对b16-f10细胞内黑色素含量的影响结果图，其中，arbutin为阳性对照组，a为长双歧杆菌zj1，b为长双歧杆菌57796、c为长双歧杆菌bl-05。
37.图4为实施例8中各组对b16-f10细胞内酪氨酸酶活性的影响结果图，其中，a、b为α-msh诱导时的结果，c、d为无诱导时的结果，α-msh(-)为空白对照组、con为α-msh诱导模型组、arbutin为阳性对照组β-熊果苷。
38.图5为实施例9中各发酵物抑制b16-f10胞内酪氨酸酶活性的可逆性结果图，其中，α-msh(-)为空白对照组、con为α-msh诱导模型组、exposure为持续暴露组、recovery为恢复组。
39.图6为实施例10中各发酵物对黑色素瘤细胞b16-f10胞内黑色素相关蛋白基因表达的影响结果，其中，a为mitf、b为tyr、c为trp-1、d为trp-2，每个柱状图从左到右依次为空白对照组、α-msh诱导模型组、实验组1、实验组2。
40.图7为实施例11中长双歧杆菌zj1的各发酵物抑制斑马鱼体内黑色素生成的照片，其中，ptu为阳性对照组1，arbutin为阳性对照组2。
具体实施方式
41.下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但是应该明确提出这些实施例用于举例说明，但是不解释为限制本发明的范围。
42.以下实施例中所用tpy固体培养基的配方为：每1l去离子水中含有5.0g/l的葡萄糖、10.0g/l的水解酪蛋白、5.0g/l的大豆胨、2.0g/l的酵母粉、2.0g/l的磷酸氢二钾、0.5g/l的氯化镁、0.25g/l的硫酸锌、0.15g/l的氯化钙、0.0001g/l的氯化铁、1.0g/l的吐温80、0.5g/l的l-半胱氨酸和20.0g/l的琼脂，ph＝6.4-6.6。经121℃高压灭菌15-20min，备用。
43.以下实施例中所用种子培养液和发酵时的培养液相同，均为mrsl培养液，其配方为：每1l去离子水中含有20g/l的葡萄糖、10.0g/l的蛋白胨、8.0g/l的牛肉粉、4.0g/l的酵
母粉、2.0g/l的磷酸氢二钾、2.0g/l的柠檬酸氢二铵、5.0g/l的乙酸钠、0.2g/l的硫酸镁、0.04g/l的硫酸锰、1.0g/l的吐温80和0.5g/l的l-半胱氨酸盐酸盐。
44.实施例1
45.制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，具体包括如下步骤：
46.s1、活化：取保存于-80℃冰箱的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1甘油冻存管(为卓源健康科技有限公司赠送)，置于室温融化，然后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于tpy固体培养基平板上，于37℃厌氧培养箱(或厌氧培养袋)培养24-28h，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌且无污染；
47.s2、种子培养：在超净台内，挑取活化后的tpy固体培养基平板上的单菌落接入种子培养基中，于37℃厌氧培养箱(或厌氧培养袋)中100-120rpm(或静置)培养12-16h得到一级种子液；然后按2.0％(v/v)接种量将一级种子液接种于新鲜的种子培养基中，于37℃厌氧培养箱(或厌氧培养袋)中100-120rpm(或静置)培养12-16h，当od
600
达到2.5-3.5时得到种子液；
48.s3、发酵：按照4％(v/v)的接种量将种子液接种至mrsl培养液中，调节ph＝5.8-6.8，于37℃厌氧发酵时间16-24h，得长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，此时发酵液ph＝4.0-4.4。
49.实施例2
50.制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵滤液，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，于4℃，离心力10000g离心25min，取上清液，调节ph＝7.2-7.4得到发酵滤液，用孔径0.22μm一次性滤器过滤除菌，然后于-20℃冰箱保存备用。
51.可以用bca试剂盒检测上述发酵滤液中的蛋白浓度。
52.实施例3
53.制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的菌体裂解物，包括如下步骤：取实施例2中离心后的沉淀(即菌体)，加入与发酵液等体积的pbs缓冲液重悬，然后于4℃，离心力10000g离心25min，弃上清液，再用pbs缓冲液重悬；
54.然后超声破碎4次，每次超声的程序相同，均为：以每超声4s后，间隔5s继续超声为一个循环，超声20个循环，超声频率为25％；然后离心力10000g离心20min，收集上清液得到菌体裂解物(0.1g湿菌泥得到0.8ml菌体裂解物)，用孔径0.22μm一次性滤器过滤除菌，然后于-20℃冰箱保存备用。
55.可以用bca试剂盒检测上述菌体裂解物中的蛋白浓度。
56.实施例4
57.制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的溶胞物，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，超声破碎4次，每次超声的程序相同，均为：以每超声4s后，间隔5s继续超声为一个循环，超声20个循环，超声频率为25％；然后离心力10000g离心20min，收集上清液得到溶胞物(1ml发酵液得到1ml溶胞物)，用孔径0.22μm一次性滤器过滤除菌，然后于-20℃冰箱保存备用。
58.可以用bca试剂盒检测上述溶胞物中的蛋白浓度。
59.实施例5
60.制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的多糖粗提物，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵液，离心，取液体即为发酵上清，加入300g/l三氯乙酸水溶液(发酵上清与三氯乙酸水溶液的体积比为3:1)，混匀后于4℃静置1h，于4℃、10000g离心20min，取上清得到脱蛋白上清液；然后向脱蛋白上清液中加入3倍体积的无水乙醇混匀，于4℃醇沉12-16h(过夜醇沉)；然后于4℃、10000g离心20min，弃去上清，沉淀用烘箱50-60℃烘10min，去除残留液体，用去离子水将沉淀复溶(去离子水用量为：每10ml发酵上清使用2ml去离子水)，得到多糖粗提物，用孔径0.22μm一次性滤器过滤除菌，然后于-20℃冰箱保存备用。
61.可以用苯酚硫酸法测定上述多糖粗提物的浓度。
62.实施例6
63.酪氨酸酶具有多种生物学功能，近年来对其在医药、美容、食品和环保等领域的应用，引起了国内外的广泛关注。酪氨酸酶是一种含铜的金属酶，普遍存在于哺乳动物、植物和微生物中，在生物体中具有重要的生理功能。同时，它也与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关。酪氨酸酶参与黑色素合成的反应为：在ph6.8的磷酸溶液中，酪氨酸酶可催化酪氨酸转化为多巴(单酚酶活性)，再由多巴转化成多巴醌(二酚酶活性)，这两步反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能。因此，体外检测待测物对酪氨酸酶活性的抑制能力，可以用于评判待测物是否具有抑制黑色素生成的活性。
64.分别以实施例2-5所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物(发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物)、25μg/ml曲酸溶液作为样品，分别检测各样品对酪氨酸酶活性的抑制作用，具体包括如下步骤：
65.取96孔板按照表1中实验t组、实验t0组的加样信息，分别加入各样品和物质，作为各个实验组；
66.同时按照表1中对照c组、对照c0组的加样信息加入各物质，作为对照组；
67.当底物为酪氨酸时，底物溶液的浓度为0.5mg/ml，反应60min后，于475nm检测反应液的紫外吸光度，并检测反应相同时间的对照组的紫外吸光度，计算实验组的酪氨酸酶活性抑制率；
68.当底物为左旋多巴时，底物溶液的浓度为1.0mg/ml，反应30min后，于475nm检测反应液的紫外吸光度，并检测反应相同时间的对照组的紫外吸光度，计算实验组的酪氨酸酶活性抑制率。
69.表1各组加样信息表
70.[0071][0072]
结果如图2所示，图2为实施例6中各发酵物的体外酪氨酸酶活性抑制率的结果图，其中，a中各发酵物浓度相同，b为不同浓度各发酵物的体外酪氨酸酶活性抑制率的结果，monophenolase为酪氨酸单酚酶，diphenolase为酪氨酸二酚酶。
[0073]
由图2可以看出：在实验浓度下，长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1四种发酵提取物对酪氨酸单酚酶以及二酚酶两种酶活性有一定的抑制作用，但抑制效果不明显。
[0074]
实施例7
[0075]
小鼠黑素瘤细胞b16-f10是常用的研究黑色素生成的细胞模型，黑色素细胞能合成并分泌黑色素，黑色素是一种氨基酸衍生物，与氢氧化钠反应后，产生能溶于水的化合物，于405nm检测紫外吸光度来计算黑色素的含量。
[0076]
黑色素细胞刺激素(melanocyte-stimulating hormone，α-msh)，主要为激活酪氨酸酶，并促进酪氨酸酶合成，从而促进黑色素合成，使皮肤及毛发颜色加深。使用黑色素细胞刺激素作用小鼠黑素瘤细胞b16-f10，通过计算细胞分泌的黑色素与样品组细胞分泌的黑色素的差异值来计算、判定黑色素的抑制情况，评价美白活性作用。
[0077]
长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物分别由实施例2-5制得。
[0078]
取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)57796、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)bl-05进行发酵，然后按照实施例2-5分别制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)57796、bl-05的发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物。
[0079]
分别考察长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1、57796、bl-05的发酵物对b16-f10细胞黑色素合成的抑制作用，具体步骤如下：
[0080]
a.首先检测长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1、57796、bl-05的发酵物对黑色素瘤细胞b16-f10增殖的影响，选择对b16-f10细胞没有增殖影响的浓度进行后续实验；
[0081]
b.取6孔板，每孔分别加入b16-f10细胞悬液2ml，使细胞的密度为4
×
104cells/孔，然后置于含5％co2的培养箱中培养24h，取出弃去上清培养液；根据表2的加样信息，分别向各孔中加入2ml的溶液，分别记作空白对照组、模型组、阳性对照组和实验组；置于含5％co2的培养箱中，37℃继续孵育72h(以给药时间计时)，弃去上清培养液；
[0082]
c.再按照表2重新加样，然后每孔加入2ml dmem完全培养基，在含5％co2的培养箱中，37℃继续孵育48-72h，培养至显微镜下观察细胞的融合率达到90％以上；
[0083]
d.然后弃去培养上清液，每孔用1ml无菌pbs缓冲液洗涤2次；弃去pbs缓冲液，每孔加入胰酶溶液200μl消化3min；再每孔加入1ml的pbs缓冲液吹打消化后的细胞，并吸取细胞悬液至1.5ml的ep管中，300g离心5min，弃上清；再每管加入150μl黑色素提取液，置于90℃水浴中1h，使黑色素完全溶解。
[0084]
e.分别从每个ep管中各吸取100μl溶液至96孔板，以黑色素提取液为调零对照，用
酶标仪于405nm处检测吸光度值，以od
405
的大小表示黑色素的多少，计算黑色素合成抑制率，计算公式如下：
[0085][0086]
式中：t为模型组、阳性对照组或实验组的吸光度；c为空白对照组的吸光度；c0为黑色素提取液的吸光度。
[0087]
表2孔板的加样信息表
[0088][0089]
备注：实验组1-2、实验组3-4、实验组5-6中，发酵物的浓度不同；菌体裂解物、多糖粗提物均有50μg/ml、100μg/ml两个浓度，发酵滤液、溶胞物均有100μg/ml、500μg/ml两个浓度；每组设置3个平行样。
[0090]
结果如图3所示，图3为实施例7中不同长双歧杆菌菌株的各发酵提取物和β-熊果苷对b16-f10细胞内黑色素含量的影响结果图，其中，arbutin为阳性对照组，a为长双歧杆菌zj1，b为长双歧杆菌57796、c为长双歧杆菌bl-05。
[0091]
由图3a可以看出：长双歧杆菌zj1的四种发酵提取物在不影响细胞活力的浓度下均能够显著抑制黑色素瘤细胞b16-f10细胞内黑色素的生成。经过α-msh诱导后的模型组细胞黑色素较空白对照组明显升高，与模型组相比，100μg/ml的溶胞物和发酵滤液分别可以减少b16-f10细胞黑色素合成的18％
±
12％和20％
±
11％，而同浓度的菌体裂解物抑制黑色素优于溶胞物和发酵滤液，可以减少b16-f10细胞黑色素合成的54％
±
10％；多糖粗提物也有较好的黑色素抑制，可以减少b16-f10细胞黑色素合成的48％
±
13％。
[0092]
比较图3a-c可以看出：长双歧杆菌57796、bl-05的四种发酵提取物对b16-f10细胞内黑色素合成的抑制率很低，甚至接近于0；长双歧杆菌zj1的四种发酵提取物对b16-f10细胞内黑色素合成的抑制率远高于长双歧杆菌57796、bl-05；可见即便是菌种相同，不同菌株的发酵物对黑色素的抑制效果也各不相同。
[0093]
实施例8
[0094]
分别考察实施例3-4所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物(即菌体裂解物、溶胞物)对黑色素瘤细胞b16-f10胞内酪氨酸酶活性的作用，具体步骤如下：
[0095]
a.首先检测长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物(即菌体裂解物、溶胞物)对黑色素瘤细胞b16-f10增殖的影响，选择对b16-f10细胞没有增殖影响的浓度进行后续实验；
[0096]
b.取6孔板，每孔分别加入b16-f10细胞悬液2ml，使细胞的密度为1
×
105cells/孔，然后置于含5％co2的培养箱中培养24h，取出弃去上清培养液；根据表3的加样信息，分别向各孔中加入等体积的溶液，分别记作空白对照组、模型组、阳性对照组和实验组1-4，分别孵育细胞72h；
[0097]
c.然后用4℃预冷的1
×
pbs缓冲液洗涤细胞两次，每孔加入350μl含0.5％(v/v)triton x-100的1
×
pbs裂解液，吹打细胞并将细胞提取液收集到1.5ml ep管中，12000g室温离心10min，分别取上清150μl置于96孔微孔板中，使用0.5％(v/v)triton x-100的1
×
pbs作为空白管，37℃下加入10μl l-多巴溶液(2mg/ml)开始酶学测定，在405nm波长处测量吸光度，使用多功能酶标仪在37℃下每10-30min记录一次，记录时间至少为1h；用蛋白检测试剂盒对细胞裂解后的上清进行蛋白定量，根据酪氨酸酶活性计算公式计算细胞内酪氨酸酶活，计算公式为：酪氨酸酶活(％)＝(od/蛋白浓度)/(od
空白对照组
/蛋白浓度)
×
100％，式中，od为模型组、阳性对照组或实验组的吸光度，od
空白对照组
为空白对照组的吸光度，蛋白浓度为对应组细胞裂解后上清中的蛋白浓度。
[0098]
表3孔板的加样信息表
[0099][0100]
备注：实验组1-4中，发酵物的浓度不同；发酵物为菌体裂解物或溶胞物；每组设置3个平行样。
[0101]
结果如图4所示，图4为实施例8中各组对b16-f10细胞内酪氨酸酶活性的影响结果图，其中，a、b为α-msh诱导时的结果，c、d为无诱导时的结果，α-msh(-)为空白对照组、con为α-msh诱导模型组、arbutin为阳性对照组β-熊果苷。
[0102]
由图4可以看出：以未经α-msh诱导组的酪氨酸酶活性记为100％，经过500nmα-msh诱导后，细胞内酪氨酸酶活性增加至194％
±
17％，而阳性对照100μg/ml熊果苷能够显著抑制胞内酪氨酸酶活性，处理后降为81％
±
22％，抑制率为60％
±
10％。25、50、100、200μg/ml菌体裂解物处理72小时后，胞内酪氨酸酶活为173％
±
13％、122％
±
15％、85％
±
20％、62％
±
24％，相应酪氨酸酶抑制率分别为11％
±
5％、34％
±
13％、54％
±
15％、63％
±
16％。100、200、400μg/ml溶胞物处理72小时后，胞内酪氨酸酶活为198％
±
17％、197％
±
20％、95％
±
29％，相应酪氨酸酶抑制率分别为﹣22％
±
15％、﹣4％
±
13％、34％
±
22％。结果表明菌体裂解物在25～200μg/ml浓度范围内以浓度依赖性方式降低了由α-msh诱导的细胞内酪氨酸酶活性的增加，且在100μg/ml与200μg/ml时对酪氨酸酶活的抑制作用效果更好，接近阳性对照100μg/ml熊果苷抑制效果，而溶胞物在低于200μg/ml时不影响细胞内酪氨酸酶活性，在400μg/ml时明显降低了由促黑素α-msh诱导的细胞内酪氨酸酶的活性。
[0103]
此外，在没有α-msh诱导的条件下，b16-f10细胞经过菌体裂解物处理后，胞内酪氨酸酶活性明显下降，经溶胞物处理后细胞内酪氨酸酶酶活性也受到影响，虽然在统计学上没有明显差异，但酪氨酸酶活性随给药浓度升高呈降低趋势。结果表明菌体裂解物比溶胞物具有更好的酪氨酸酶活性抑制作用。
[0104]
结合实施例6中各发酵物对酪氨酸酶活性的抑制结果可推测，发酵提取物(菌体裂解物与溶胞物)对酪氨酸酶没有明显的直接抑制作用，可能是在细胞内间接抑制酪氨酸酶活性来发挥抑制黑色素生成的作用。
[0105]
实施例9
[0106]
酶活性抑制的可逆性被认为是反映抑制剂安全性的参数。对酪氨酸酶活性的不可逆抑制可能会导致黑色素瘤细胞生物合成能力的更大的损害。因此为了评估发酵提取物对黑色素瘤细胞b16-f10细胞内酪氨酸酶酶活性的抑制是否可逆，我们进行了一项“exposure-recovery”研究。分别考察实施例3-4所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵物(即菌体裂解物、溶胞物)对b16-f10胞内酪氨酸酶活性的抑制作用的可逆性，具体步骤如下：
[0107]
按照实施例8的步骤b进行操作(只按照表3中α-msh诱导项下的各组进行操作，实验组每组均设置6个平行样)，其中孵育细胞72h后，每个实验组的3个平行样弃去上清培养液，加入dmem完全培养基继续培养48h记作recovery(恢复)组；另外3个平行样弃去上清培养液，加入含有500nmα-msh和各个发酵物的dmem完全培养基继续培养48h记作exposure(持续暴露)组，通过测定l-左旋多巴形成多巴色素的速率来测定细胞内酪氨酸酶的酶活性。
[0108]
结果如图5所示，图5为实施例9中各发酵物抑制b16-f10胞内酪氨酸酶活性的可逆性结果图，其中，α-msh(-)为空白对照组、con为α-msh诱导模型组、exposure为持续暴露组、recovery为恢复组。
[0109]
由图5可以看出，25-200μg/ml的菌体裂解物与100-400μg/ml的溶胞物对酪氨酸酶活性的抑制具有剂量依赖性。recovery(恢复)组中b16-f10细胞酪氨酸酶活性与exposure(持续暴露)组相比明显上升，低浓度菌体裂解物或溶胞物处理的细胞酶活恢复得更显著，接近对照水平。以上结果说明发酵提取物对细胞酪氨酸酶活造成的活性抑制是可逆的，并不会产生永久性细胞毒性，提示发酵提取物具有一定安全性。
[0110]
实施例10
[0111]
在黑色素的产生过程中，它涉及到各种复杂的酶和化学催化反应。mitf是黑素合成过程中最重要的转录因子，通过调控tyr基因家族来控制黑素细胞的生存和分化以及黑素的合成、转运和分布。黑色素的合成主要涉及三种酶，包括tyr、trp-1和trp-2，其基因表达受mitf调控。
[0112]
分别考察实施例3-4所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1发酵提取物(即菌体裂解物、溶胞物)对黑色素瘤细胞b16-f10胞内黑色素相关蛋白基因表达的影响，具体步骤为：
[0113]
取6孔板，每孔分别加入b16-f10细胞悬液2ml，使细胞的密度为1
×
105cells/孔，然后置于含5％co2的培养箱中培养72h，取出弃去上清培养液；根据表4的加样信息，分别向各孔中加入等体积的溶液，分别记作空白对照组、模型组、实验组1-2，分别孵育细胞，并于12h、72h分别提取rna(参考rna提取试剂盒说明书进行操作)，然后实时荧光定量pcr检测黑色素相关蛋白基因mrna水平。
[0114]
表4加样信息
[0115]
分组加样空白对照组dmem完全培养基模型组含有500nmα-msh的dmem完全培养基实验组1含有500nmα-msh和100μg/ml菌体裂解物的dmem完全培养基实验组2含有500nmα-msh和500μg/ml溶胞物的dmem完全培养基
[0116]
结果如图6所示，图6为实施例10中各发酵物对黑色素瘤细胞b16-f10胞内黑色素相关蛋白基因表达的影响结果，其中，a为mitf、b为tyr、c为trp-1、d为trp-2，每个柱状图从左到右依次为空白对照组、α-msh诱导模型组、实验组1、实验组2。
[0117]
由图6可以看出：实时荧光定量pcr结果表明，黑色素瘤细胞b16-f10在500nm促黑素α-msh处理12小时后，mitf的mrna水平显著升高，与空白对照组相比增加至(13.2
±
3.0)倍，100μg/ml菌体裂解物或500μg/ml溶胞物处理后，能够降低其表达水平空白对照组的(4.4
±
1.2)倍、(7.0
±
1.9)倍；处理72小时后，tyr的mrna水平升高至(2.8
±
0.3)倍，菌体裂解物与溶胞物处理后，降低了tyr基因表达水平至(0.7
±
0.2)与(1.3
±
0.2)倍。trp-1和trp-2的mrna表达较空白对照组无明显差异，但100μg/ml菌体裂解物处理后，其表达水平呈现下降趋势。这些结果提示，发酵提取物可能通过调节mitf以及酪氨酸酶相关蛋白酶的基因转录水平来降低黑色素生成的。
[0118]
对比例1
[0119]
取长双歧杆菌(bifidobacterium longum)57796、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)bl-05进行发酵，然后按照实施例2-5分别制备长双歧杆菌(bifidobacterium longum)57796、bl-05的发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物。
[0120]
实施例11
[0121]
斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，因体侧有像斑马样的纵向条纹而得名，其在发育初期，胚胎透明，后黑色素慢慢生成。利用斑马鱼的这一特征，通过加入抑制剂，可以观察对比黑色素的生成情况，判断抑制效果。苯基硫脲(ptu)是常用的抑制黑色素生成的化合物，是酪氨酸酶抑制剂，比其它的化合物(熊果苷、曲酸)抑制黑色素活性更强。熊果苷为化妆品界公认的美白产品，其对斑马鱼黑色素有较好的抑制效果。
[0122]
分别考察实施例2-5所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1各个发酵物、对比例1所述长双歧杆菌(bifidobacterium longum)57796、bl-05的各个发酵物、商品化二裂酵母发酵产物溶胞物repair complex clrtmpf对斑马鱼体内黑色素生成的抑制作用，具体步骤如下：
[0123]
1.显微观察法
[0124]
随机挑选1dpf健康、无畸形、正常发育的斑马鱼卵，在相同条件下饲养，按表5信息分组给药，药物处理48h后，选取各组的3dpf斑马鱼，置显微镜下观察黑色素生长情况，拍照保存，拍照时斑马鱼应头朝左、腹部朝下、身体保持水平，尾部平铺并保持横平竖直，所有斑马鱼的拍照结果须在相同的仪器和环境条件下完成，且斑马鱼体位应该保持一致，记录仪器参数；
[0125]
使用imagej软件测量鱼尾总area，记为a0，测量时使用矩形选框工具，以泄殖孔为起点，以鱼尾的透明边缘为终点；使用imagej软件进行灰度值测量，得出上述矩形选框内黑色素的area值，记为a1；
[0126]
计算各组鱼尾黑色素的占比r＝a1/a0
×
100％；
[0127]
计算各组鱼尾黑色素占比相对阴性对照的黑色素抑制率，公式如下：
[0128][0129]
2.黑色素定量检测法
[0130]
取各组3dpf斑马鱼，加入脱氧胆酸钠(5mg/ml)，混匀，低温超声破碎，低温5000rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入氢氧化钠水溶液(1mol/l)，水浴90℃水浴1h，使物质完全溶解；冷却后在405nm处测量吸光值od，即为黑色素含量，计算黑色素抑制率，公式如下：
[0131][0132]
3.酪氨酸酶活性抑制检测法
[0133]
同黑色素定量检测法，取各组3dpf斑马鱼，加入脱氧胆酸钠(5mg/ml)，混匀，低温超声破碎，低温5000rpm离心5min，取上清液，加入左旋多巴(5mmol/l)，37℃孵育1h后，于475nm测量吸光度od，计算酪氨酸酶活性抑制率，公式如下：
[0134][0135]
表5分组信息
[0136]
分组加样阴性对照组斑马鱼养殖系统用水阳性对照组1含30μg/mlptu的斑马鱼养殖系统用水阳性对照组2含10000μg/mlβ-熊果苷的斑马鱼养殖系统用水实验组含80μg/ml各个发酵物的斑马鱼养殖系统用水
[0137]
实验结果如表6和图7所示。
[0138]
图7为实施例11中长双歧杆菌zj1的各发酵物抑制斑马鱼体内黑色素生成的照片，其中，ptu为阳性对照组1，arbutin为阳性对照组2。
[0139]
由图7可以看出：实验组斑马鱼存活率和活动能力没有受到明显的药物毒副作用影响；在安全浓度范围内的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵物处理48h后，实验组的斑马鱼眼睛、背部、卵黄囊的色素合成较少、点状分布并且颜色较浅，而阴性对照组的颜色特别深，色素分布密集，成片分布。
[0140]
表6检测结果
[0141][0142][0143]
备注：clr为商品化二裂酵母发酵产物溶胞物repair complex clrtmpf。
[0144]
由表6可以看出：80μg/ml的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵物中，菌体裂解物对黑色素形成抑制效果与10000μg/mlβ-熊果苷的抑制效果接近，高于80μg/ml clr的抑制效果；斑马鱼黑色素含量降低到阴性对照组的25％。证明长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1的发酵物具有较好的黑色素形成抑制效果，能够在较为安全的条件下抑制斑马鱼黑色素的形成，具有开发成为抑制黑色素形成的化妆品或药物的潜力；
[0145]
而长双歧杆菌(bifidobacterium longum)57796、bl-05的发酵物抑制黑色素的作
用远低于长双歧杆菌(bifidobacterium longum)zj1，可见即便是菌种相同，不同菌株的发酵物对黑色素的抑制效果也各不相同。
[0146]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1发酵物，其特征在于，所述长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1发酵物为长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物中的至少一种。2.一种如权利要求1所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，制备发酵滤液时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵液，固液分离，取液体，调节ph＝7.2-7.4得到发酵滤液；制备菌体裂解物时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵液中的菌体，用pbs缓冲液重悬，然后超声破碎，固液分离，取液体得到菌体裂解物；制备溶胞物时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵液，超声破碎，固液分离，取液体得到溶胞物；制备多糖粗提物时，包括如下步骤：取长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵液，经脱蛋白处理，然后对溶液进行醇沉处理，取固体得到多糖粗提物。3.根据权利要求2所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，将长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1接种到mrsl培养液中，调节ph＝5.8-6.8，厌氧发酵培养得到长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵液。4.根据权利要求3所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，mrsl培养液的配方为：每1l水中含有15-25g/l的葡萄糖、8.0-12.0g/l的蛋白胨、7.0-9.0g/l的牛肉粉、3.5-4.5g/l的酵母粉、1.5-2.5g/l的磷酸氢二钾、1.5-2.5g/l的柠檬酸氢二铵、4.5-5.5g/l的乙酸钠、0.1-0.3g/l的硫酸镁、0.03-0.05g/l的硫酸锰、0.8-1.2g/l的吐温80和0.4-0.6g/l的l-半胱氨酸盐酸盐。5.根据权利要求3所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1的发酵液的ph＝4.0-4.4；优选地，发酵培养的温度为36-38℃，发酵时间为16-24h。6.根据权利要求2-5任一项所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，制备菌体裂解物时，超声破碎3-5次，每次超声的程序相同，均为：以每超声3-5s后，间隔3-5s继续超声为一个循环，超声15-25个循环，超声功率为150-225w。7.根据权利要求2-6任一项所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，制备溶胞物时，超声破碎3-5次，每次超声的程序相同，均为：以每超声3-5s后，间隔3-5s继续超声为一个循环，超声15-25个循环，超声功率为150-225w。8.根据权利要求2-7任一项所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，制备多糖粗提物时，采用tca法进行脱蛋白处理。9.根据权利要求2-8任一项所述长双歧杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，长双歧杆菌发酵物均经过滤除菌处理后，于-20℃以下保存。10.一种如权利要求1所述长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)zj1发酵物在抑制黑色素中的应用；优选地，在制备抑制黑色素化妆品、抑制黑色素药品、抑制黑色素保健品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)ZJ1发酵物，所述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)ZJ1发酵物为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ZJ1的发酵滤液、菌体裂解物、溶胞物、多糖粗提物中的至少一种。本发明还公开了上述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)ZJ1发酵物的制备方法。本发明还公开上述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)ZJ1发酵物在抑制黑色素中的应用。本发明发现长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)ZJ1的发酵物具有抑制黑色素的作用。制黑色素的作用。制黑色素的作用。


技术研发人员：肖卫华 邬婧 张富娜 余海霞 戚仕梅 吴瑜 吴振坤
受保护的技术使用者：合肥卡迪尔生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/10/8