一种降血糖活性肽的制备方法和应用

1.本发明属于混合发酵和酶解结合的技术领域，具体涉及用酪蛋白发酵后再用亮氨酸氨基肽酶进行酶解获得活性更高的降血糖活性肽的制备方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病作为近年来引起代谢紊乱的最常见疾病，其发病率和死亡率都很高。合成的胰岛素和胰岛素类似物是控制高血糖的方法之一，但化学合成药物对人体有一定的副作用。因此，寻找安全、有效的天然降糖药物是研究热点。
3.一些乳源肽具有降血糖活性，其通过抑制将碳水化合物分解为葡萄糖的酶活性而控制血糖升高。降糖肽一般含有2～15个氨基酸残基，常以无活性的前体形式存在于蛋白质中，需要通过酶解、发酵、加工等方法将肽释放出来。
4.现有技术中，cn 105506046a公开了基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法，通过超高压/超声波/微波辅助技术结合模拟胃肠消化水解模式，有效提高了酪蛋白的水解度，实现了活性氨基酸序列的可控释放，提高其胃肠稳定性；采用的类蛋白反应修饰脱苦技术在无损多肽生物学活性的基础上解决了降糖降脂肽的苦味问题。可见，该制备过程只是通过水解反应将活性肽序列从酪蛋白中释放，那么如何合成新的、活性更高的降糖肽是下一步要解决的技问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种活性更高的降血糖活性肽的制备方法和应用。
6.本发明提供的制备方法利用复合乳酸菌发酵产生的特异性蛋白酶、肽酶联合外源亮氨酸氨基肽酶酶解酪蛋白，结合plastein反应将添加的外源氨基酸合成到新肽链中，得到活性更高的降糖肽。
7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.本发明提供了一种降血糖活性肽的制备方法，包括以下步骤：将酪蛋白与水配置成酪蛋白水溶液，灭菌后与复合乳酸菌混合发酵，得到酪蛋白发酵液；对酪蛋白发酵液进行灭菌处理后加入亮氨酸氨基肽酶混合酶解，得到酪蛋白水解液；将酪蛋白水解液真空浓缩后，经plastein反应，真空冷冻干燥得到降血糖活性肽。
9.优选的，所述复合乳酸菌包括：瑞士乳杆菌和植物乳杆菌；所述瑞士乳杆菌和植物乳杆菌的菌落数比为1～6:1。
10.优选的，所述发酵的温度为30～50℃，发酵至酪蛋白水溶液的ph为4.0～6.0。
11.优选的，所述酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶的重量比为500～1500:1。
12.优选的，所述酶解的ph为6.0～8.0，温度为30～45℃，时间为2～4h。
13.优选的，所述plastein反应前，还包括将酪蛋白水解液浓缩，所述浓缩后的固形物含量为40％～60％。
14.优选的，所述plastein反应时，还包括向所述酪蛋白水解液中添加氨基酸，所述氨基酸的添加量为1.0％～4.5％，所述氨基酸包括丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸中的一种或几种。
15.优选的，所述plastein反应的ph为6.5～8.0，温度为30～50℃，时间为2～8h。
16.本发明提供了利用上述的方法制得的降血糖活性肽。
17.本发明还提供了上述降血糖活性肽在制备发酵食品中的应用。
18.有益效果：本发明提供了一种降血糖活性肽的制备方法，利用复合乳酸菌发酵产生的特异性蛋白酶和肽酶，水解酪蛋白生成特定肽段，进一步通过亮氨酸氨基肽酶把这些肽段n-末端的亮氨酸游离出来，富集得到更多目标肽。再通过plastein反应修饰将氨基酸合成到新肽链中，得到活性更高的降糖肽。
19.本发明提供了利用上述的制备方法制得的降血糖活性肽，利用复合乳酸菌发酵产生的蛋白酶、肽酶联合外源亮氨酸氨基肽酶酶解酪蛋白，在肽链内切酶和外切酶的联合作用下，将酪蛋白首先分解为大分子肽，再进一步分解为一系列小肽，获得蛋白水解程度更高，肽含量更高的肽段。
20.本发明还利用上述降血糖活性肽制备发酵食品，制得的发酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制活性可达到15.78～20.14％，二肽基肽酶(dpp-iv酶)抑制活性可达到54.45～71.44％。
21.本发明将亮氨酸氨基肽酶作为肽链外切酶，使肽链n末端的亮氨酸游离出来，得到更多的目标肽。是本专利的重要发明点，这样能提高降血糖活性肽的活性。
22.本发明提供了利用上述的制备方法制得的降血糖活性肽，在蛋白酶存在条件下，plastein反应包含的缩合作用或转肽作用可将添加的外源氨基酸合成到新肽链中，进而产生原水解物中不存在的新肽序列，降糖效果更好。
23.本发明还提供了上述降血糖活性肽在制备混合发酵制品中的应用，所述混合发酵制品优选包括混合发酵乳，利用本发明的降血糖活性肽制备得到的混合发酵食品具有较好的降血糖能力。
附图说明
24.图1为利用不同氨基酸制备的牛乳源降血糖活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性对比图；
25.图2为发酵牛乳在添加降血糖活性肽前后的α-葡萄糖苷酶抑制活性对比图；
26.图3为发酵牛乳在添加降血糖活性肽前后的dpp-iv抑制活性对比图；
27.图4为发酵羊乳在添加降血糖活性肽前后的α-葡萄糖苷酶抑制活性对比图；
28.图5为发酵羊乳在添加降血糖活性肽前后的dpp-iv抑制活性对比图；
29.图6为发酵牦牛乳在添加降血糖活性肽前后的α-葡萄糖苷酶抑制活性对比图；
30.图7为发酵牦牛乳在添加降血糖活性肽前后的dpp-iv抑制活性对比图。
具体实施方式
31.本发明提供了一种降血糖活性肽的制备方法，包括以下步骤：
32.将酪蛋白水溶液与复合乳酸菌混合发酵，得到酪蛋白发酵液；将酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶混合酶解，得到酪蛋白水解液；将酪蛋白水解液进行plastein反应，得到降
血糖活性肽。
33.如无特殊说明，本发明对所述制备原料没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
34.本发明优选将酪蛋白配置成水溶液，所述酪蛋白水溶液的质量浓度优选为2％～10％，更优选为4％～8％，进一步优选为6％～7％，最优选为7％。本发明所述酪蛋白的来源优选包括牛乳、羊乳或牦牛乳。本发明对牛乳酪蛋白、羊乳酪蛋白和牦牛乳的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明优选将酪蛋白水溶液进行灭菌处理，所述灭菌温度优选为80～100℃，更优选为90～95℃，最优选为95℃；所述灭菌的时间优选为2～15min，更优选为5～10min，最优选为5min。
35.本发明优选将上述酪蛋白水溶液与复合乳酸菌混合发酵，得到酪蛋白发酵液。本发明所述复合乳酸菌优选包括：瑞士乳杆菌和植物乳杆菌，利用瑞士乳杆菌和植物乳杆菌产生的特异性蛋白酶和肽酶，水解酪蛋白生成特定肽段，利于后续肽段n-末端的亮氨酸的游离，能够富集得到更多目标肽。本发明所述瑞士乳杆菌和植物乳杆菌的活菌菌落数比优选为1～6:1，更优选为2～5:1，进一步优选为3～4:1，最优选为3:1。本发明所述瑞士乳杆菌的活菌菌落数优选为3
×
107cfu，所述植物乳杆菌的活菌菌落数优选为1
×
107cfu。以酪蛋白水溶液的质量计，所述复合乳酸菌的添加量优选为4
×
107cfu/g。本发明所述发酵的温度优选为30～50℃，更优选为35～45℃，进一步优选为37～42℃，最优选为40℃；所述发酵至酪蛋白水溶液的ph为4.0～6.0，更优选为4.5～5.5，最优选为5.0。
36.本发明优选将发酵得到的酪蛋白发酵液进行灭菌处理，所述灭菌温度优选为80～100℃，更优选为90～95℃，最优选为95℃；所述灭菌的时间优选为2～15min，更优选为5～10min，最优选为5min。
37.本发明优选将灭菌后的酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶混合酶解，得到酪蛋白水解液。本发明所述酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶的重量比优选为500～1500:1，更优选为800～1200:1，进一步优选为900～1100：1，最优选为1000:1。本发明所述亮氨酸氨基肽酶活力优选为1万u/g。本发明优选预先调节酶解时发酵液的ph，所述ph优选为6.0～8.0，更优选为6.5～7.5，进一步6.8～7.2，最优选为7.0；所述酶解的温度为30～45℃，更优选为32～42℃，进一步优选为35～40℃，最优选为37℃；所述酶解的时间优选为2～4h，更优选为2～3.5h，进一步优选为2.5～3.5h，最优选为2.5h。本发明将亮氨酸氨基肽酶作为肽链外切酶，使肽链n末端的亮氨酸游离出来，得到更多的目标肽。本发明所述酶解后还优选包括灭酶处理，所述灭酶的温度优选为80～95℃，更优选为85～90℃，最优选为85℃，灭酶的时间优选为4～15min，更优选为6～10min，最优选为10min。
38.本发明将制得的酪蛋白水解液进行plastein反应，得到降血糖活性肽。本发明优选先将酪蛋白水解液浓缩，所述浓缩液的固形物含量优选为40％～60％，更优选为45％～55％，最优选为50％。本发明优选还包括往所述酪蛋白水解浓缩液中添加中性蛋白酶，中性蛋白酶是一种肽链内切酶，能将大分子蛋白质分解为多肽及氨基酸等产物，进一步水解酪蛋白形成新的肽链，为plastein反应做准备。本发明所述酪蛋白水解浓缩液与中性蛋白酶的重量比优选为2500～3500:1，更优选为2800～3200:1，进一步优选为2900～3100:1，最优选为3000:1；所述中性蛋白酶的活力优选为10万u/g。本发明优选还包括往所述酪蛋白水解浓缩液中添加氨基酸，所述氨基酸优选包括丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸中的一种或几
种，所述氨基酸的添加重量优选为酪蛋白水解浓缩液的1.0％～4.5％，更优选为1.5％～4.0％，进一步优选为1.7％～3.0％，最优选为2.0％。本发明所述plastein反应的ph优选为6.5～8.0，更优选为7.0～7.5，最优选为7.2；所述plastein反应的温度为30～50℃，更优选为35～45℃，最优选为40℃；所述plastein反应的时间优选为2～8h，更优选为3～6h，最优选为4.5h。本发明上述水解得到的目标肽，通过plastein反应修饰将氨基酸合成到新肽链中，进而产生原水解物中不存在的新肽序列，得到活性更高的降血糖活性肽；且水解产生的游离亮氨酸可在plastein反应中被包埋聚集，从而降低制备的降血糖活性肽的苦味。
39.本发明提供了利用上述的制备方法制得的降血糖活性肽，在蛋白酶存在条件下，plastein反应包含的缩合作用或转肽作用可将添加的外源氨基酸合成到新肽链中，进而产生原水解物中不存在的新肽序列，降糖效果更好。
40.本发明还提供了上述降血糖活性肽在制备发酵食品中的应用，所述发酵食品优选包括发酵乳，利用本发明的降血糖活性肽制备得到的发酵食品具有较好的降血糖能力。
41.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种降血糖活性肽的制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.实施例1
43.用牛乳酪蛋白和牛乳制备具有高降血糖活性的发酵乳，具体为以下步骤：
44.酪蛋白水解液的制备
45.步骤一，将市售牛乳酪蛋白粉配置成质量浓度为7％的水溶液，于95℃灭菌5min。按每克酪蛋白水溶液加入4
×
107cfu瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)cicc 6024和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cicc 20263的复合乳酸菌，瑞士乳杆菌：植物乳杆菌＝3:1，搅拌均匀后在37℃发酵酪蛋白水溶液至ph5.0，制备得到牛乳酪蛋白发酵液。
46.步骤二，将牛乳酪蛋白发酵液搅拌破乳，于90℃加热10min后，用碱液调节发酵液ph至7.0。按重量比，发酵液：亮氨酸氨基肽酶＝1000:1加入亮氨酸氨基肽酶，亮氨酸氨基肽酶活力为1万u/g蛋白。于37℃恒温酶解2.5h，85℃加热10min灭酶后，得到牛乳酪蛋白水解液。
47.对比例1
48.按照实施例1的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于制备得到牛乳酪蛋白发酵液后，未进行步骤二的水解过程。
49.试验例1
50.1.蛋白水解酶活力测定方法
51.取样品2g和去离子水1ml混匀，加入0.75mol/l三氯乙酸5ml，混合均匀并静置10min，离心后收集上清液。取上清液200μl加入opa试剂4ml，混匀。以去离子水加opa试剂为空白，室温下反应10min后于340nm测定吸光值，折算成mmol/l样品。用0～10mmol/l的l-亮氨酸制作标准曲线，通过标准曲线计算蛋白水解活力。
52.y＝0.3011x-0.0145，r2＝0.9993。
53.式中，y表示蛋白水解活力，单位为mmol/l；x表示l-亮氨酸的含量，单位为mmol/l。
54.2.肽含量测定方法
55.样品经离心后取上清液，使用1mol/l氢氧化钠调节上清液的ph为7.5，过0.45μm亲水滤膜。取20μl上清样品用于rp-hplc分析。肽在30℃被c
18
色谱柱分离。洗脱程序：0～
10min，0.1％三氟乙酸水溶液；10～90min，乙腈由0％逐步上升至48％。流速：1ml/min，检测波长：210nm。通过肽谱中210nm处峰面积的累加，来计算样品中肽含量。测定保留时间在10.0～90.0min的肽面积。
56.对实施例1得到的牛乳酪蛋白水解液与对比例1得到的未水解前牛乳酪蛋白发酵液进行检测，得到的结果，如表1所示。
57.表1牛乳酪蛋白水解液水解前后的蛋白水解活力及肽含量
[0058] 蛋白水解活力(mmol/l)肽含量(
×
105mau*s)实施例10.76
±
0.047.92
±
0.11对比例10.57
±
0.016.68
±
0.21
[0059]
从表1中可以看出，实施例1牛乳酪蛋白发酵液经亮氨酸氨基肽酶水解后，其蛋白水解活力和肽含量均显著高于对比例1未水解前的牛乳酪蛋白发酵液，这表明利用本发明复合乳酸菌发酵技术联合氨基肽酶酶解酪蛋白，比只进行复合乳酸菌发酵技术获得蛋白水解程度更高的酪蛋白水解液和含量更高的肽段。
[0060]
实施例2
[0061]
降血糖活性肽的制备
[0062]
将实施例1制得的酪蛋白水解液真空浓缩至固形物含量为50％，调节牛乳酪蛋白水解液ph至7.2，按重量比，酪蛋白水解浓缩液：中性蛋白酶＝3000:1添加中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为10万u/g。再按酪蛋白水解浓缩液重量的2％加入赖氨酸，在40℃保温4.5h进行plastein反应。将plastein反应液真空冷冻干燥得到牛乳源降血糖活性肽。
[0063]
实施例3
[0064]
按照实施例2的方式进行，区别在于将赖氨酸替换为丙氨酸。
[0065]
实施例4
[0066]
按照实施例2的方式进行，区别在于将赖氨酸替换为脯氨酸。
[0067]
实施例5
[0068]
按照实施例2的方式进行，区别在于将赖氨酸替换为甘氨酸。
[0069]
对比例2
[0070]
按照实施例2的方式进行，区别在于将赖氨酸替换为精氨酸。
[0071]
对比例3
[0072]
按照实施例2的方式进行，区别在于将赖氨酸替换为苯丙氨酸。
[0073]
对比例4
[0074]
按照实施例2的方式进行，区别在于将赖氨酸替换为苏氨酸。
[0075]
试验例2
[0076]
1.α-淀粉酶抑制活性测定方法
[0077]
吸取样品溶液100μl及1u/ml的α-淀粉酶(溶解于ph6.8，0.1mol/l磷酸盐缓冲液)100μl，混匀后于37℃孵育5min，再加入250μl 1％淀粉溶液(溶解于ph6.8，0.1mol/l磷酸盐缓冲液)，混匀后于37℃孵育5min。加入200μl的dns试剂，于沸水浴中加热15min后取出，并迅速冷却，再加入2ml去离子水，混匀后于540nm测定吸光度。通过下面公式计算α-淀粉酶抑制活性。
[0078]
α-淀粉酶抑制活性(％)＝[1-(a
s-ab)/ac]100％。其中，as为样品反应液的吸光值；ab
为磷酸盐缓冲液代替酶的吸光值；ac为磷酸盐缓冲液代替样品的吸光值。
[0079]
2.α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法
[0080]
吸取样品溶液50μl及1u/ml的α-葡萄糖苷酶(溶解于ph6.8，0.1mol/l磷酸盐缓冲液)100μl，混匀后于37℃孵育10min，加入50μl 5mmol/l的pnpg溶液(溶解于ph6.8，0.1mol/l磷酸盐缓冲液)，混匀，37℃孵育30min，再加入0.1mol/l碳酸钠溶液1ml，并于400nm测定吸光值。通过下面公式计算α-葡萄糖苷酶抑制活性。
[0081]
α-葡萄糖苷酶抑制活性(％)＝[1-(a
s-ab)/ac]100％。其中，as为样品反应液的吸光值；ab为磷酸盐缓冲液代替酶的吸光值；ac为磷酸盐缓冲液代替样品的吸光值。
[0082]
3.dpp-iv抑制活性测定方法
[0083]
移取25μl 12mmol/l gly-pro-ρna(溶解于ph8.0，0.1mol/l tris-hcl缓冲液)和等体积的样品溶液(溶解于ph8.0，0.1mol/l tris-hcl缓冲液)于96孔板中，37℃孵育10min，然后加入的2u/ml dpp-iv酶溶液(溶解于ph8.0，0.1mol/l tris-hcl缓冲液)50μl，37℃孵育30min。最后加入1mol/l醋酸-醋酸钠(ph4.0)溶液100μl终止反应，于405nm测定吸光值。通过下面公式计算dpp-iv抑制活性。
[0084]
dpp-iv抑制活性(％)＝[1-(a
s-a1)/(a
n-a2)]100％。其中，as为样品反应液的吸光值；a1为tris-hcl缓冲液代替酶的吸光值；an为tris-hcl缓冲液代替样品的吸光值；a2为tris-hcl缓冲液代替酶和样品的吸光值。
[0085]
对实施例2～5和对比例2～4制得的降血糖活性肽，以及不添加任何氨基酸制备得到的降血糖活性肽作为空白对照，进行α-淀粉酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性及dpp-iv抑制活性检测，取三个样，算平均值，得到的结果见图1和表2。
[0086]
表2不同氨基酸制备的牛乳源降血糖活性肽的降血糖效果
[0087][0088]
由图1和表2可以看出，其中，实施例2赖氨酸效果最好，α-淀粉酶抑制活性为40.02％，α-葡萄糖苷酶抑制活性为68.22％，dpp-iv抑制活性为96.58％；实施例3丙氨酸次之，α-淀粉酶抑制活性为39.23％，α-葡萄糖苷酶抑制活性为61.47％，dpp-iv抑制活性为92.11％；而对比例4苏氨酸的效果最差，α-淀粉酶抑制活性为25.78％，α-葡萄糖苷酶抑制活性为37.89％，但其dpp-iv抑制活性与空白及其他对比例差异不大。可见，在中性蛋白酶存在下，不同外源氨基酸通过plastein反应制备的牛乳源降血糖活性肽的降血糖效果差别
较大。
[0089]
对比例5
[0090]
将实施例1制得的酪蛋白水解液真空浓缩至固形物含量为50％，调节牛乳酪蛋白水解液ph至7.2。将牛乳酪蛋白水解液直接真空冷冻干燥得到牛乳源降血糖活性肽。
[0091]
试验例3
[0092]
采用试验例2的方法，检测实施例2和对比例5的α-淀粉酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，得到的结果见表3。
[0093]
表3牛乳源降血糖活性肽在plastein反应前后的降血糖效果
[0094] α-淀粉酶抑制活性(％)α-葡萄糖苷酶抑制活性(％)实施例240.02
±
3.1268.22
±
0.69对比例524.57
±
2.4540.58
±
0.04
[0095]
表3表明，实施例2制得的牛乳源降血糖活性肽其α-淀粉酶抑制活性达到40.02％，比对比例5的肽增加了15.45％；实施例2的α-葡萄糖苷酶抑制活性达到68.22％，比对比例5未经plastein反应的肽增加了27.64％。可见，经过plastein反应的肽显著提高了降糖效果。
[0096]
感官评价的方法
[0097]
将经过实施例2和对比例5制备的冻干粉样品以5％质量浓度溶于水中，按1:1比例进行梯度稀释，利用三点实验法进行感官评价，检测受试者能否区别它们的苦味程度；以不能尝出苦味差别的最小稀释倍数表示苦味值，该稀释倍数越大则苦味值越高，说明产品的苦味程度越重。
[0098]
感官评价的数据结果(实施例2为进行了plastein反应的，详细条件见实施例2；对比例5为省略了plastein反应的)显示，实施例2的苦味值为3，而对比例5的苦味值为11。
[0099]
实施例6
[0100]
按牛乳重量的3％加入牛乳源降血糖活性肽，将牛乳与实施例1制得的降血糖活性肽混匀后于90℃灭菌10min。按每克牛乳加入108cfu嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)菌液，在37℃发酵至凝乳，即得发酵乳。
[0101]
对比例6
[0102]
按照实施例6的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于发酵时未添加牛乳源降血糖活性肽。
[0103]
试验例4
[0104]
采用试验例2的方法，检测实施例6和对比例6的α-葡萄糖苷酶抑制活性和dpp-iv抑制活性，得到的结果见图2、3和表4。
[0105]
表4发酵牛乳在添加降血糖活性肽前后的抑制活性
[0106][0107]
由图2、3和表4可以看出，实施例6的发酵牛乳在模拟胃肠消化前后其α-葡萄糖苷
酶抑制活性和dpp-iv抑制活性均明显高于对比例6未添加牛乳源降血糖活性肽的发酵牛乳，且这些降血糖活性肽具有良好的抵抗胃肠消化的能力。可见，利用本发明制备得到的发酵乳产品具有较好的降血糖能力。
[0108]
实施例7
[0109]
步骤一，将市售的羊乳酪蛋白粉配置成质量浓度为8％的水溶液，于90℃灭菌10min。按每克酪蛋白水溶液加入4
×
107cfu瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)cicc 6024，和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cicc 20263混合的复合乳酸菌，瑞士乳杆菌：植物乳杆菌＝3:1，搅拌均匀后在40℃发酵酪蛋白水溶液至ph5.4，制备得到羊乳酪蛋白发酵液。
[0110]
步骤二，将发酵液搅拌均匀，于90℃加热10min后，用碱液调节发酵液ph至7.0。按重量比，发酵液：亮氨酸氨基肽酶＝1000:1加入亮氨酸氨基肽酶，亮氨酸氨基肽酶活力为1万u/g蛋白。于37℃恒温酶解3h，85℃加热10min灭酶后，获得羊乳酪蛋白水解液。
[0111]
对比例7
[0112]
按照实施例7的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于制备得到羊乳酪蛋白发酵液后，未进行第二步骤的水解过程。
[0113]
试验例5
[0114]
采用试验例1的方法，检测实施例7和对比例7的蛋白水解活力和肽含量，得到的结果见表5。
[0115]
表5羊乳酪蛋白水解液经氨肽酶水解后的蛋白水解活力及肽含量
[0116][0117][0118]
从表5中可以看出，实施例7羊乳酪蛋白发酵液经亮氨酸氨基肽酶水解后，其蛋白水解活力和肽含量均显著高于对比例7未水解前的羊乳酪蛋白发酵液。可见，利用本发明复合乳酸菌发酵技术联合氨基肽酶酶解酪蛋白，比只进行复合乳酸菌发酵技术获得蛋白水解程度更高的酪蛋白水解液和含量更高的肽段。
[0119]
实施例8
[0120]
将实施例7制得的酪蛋白水解液真空浓缩至固形物含量为45％，调节羊乳酪蛋白水解液ph至7.5，按重量比，酪蛋白水解浓缩液：中性蛋白酶＝3000:1添加中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为10万u/g。再按酪蛋白水解浓缩液重量的3％加入赖氨酸，在40℃保温4h进行plastein反应。将plastein反应液真空冷冻干燥得到羊乳源降血糖活性肽。
[0121]
对比例8
[0122]
按照实施例8的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于省略加入赖氨酸进行plastein反应。
[0123]
试验例6
[0124]
采用试验例2的方法，检测实施例8和对比例8的α-淀粉酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，得到的结果见表6。
[0125]
表6羊乳源降血糖活性肽在plastein反应前后的降血糖效果
[0126] α-淀粉酶抑制活性(％)α-葡萄糖苷酶抑制活性(％)实施例854.25
±
3.4733.87
±
0.46对比例833.47
±
0.8717.57
±
0.21
[0127]
表6表明，实施例8制得的羊乳源降血糖活性肽其α-淀粉酶抑制活性达到54.25％，比对比例8未经plastein反应的肽增加了20.78％；实施例8的α-葡萄糖苷酶抑制活性达到33.87％，比对比例8的肽增加了16.30％。可见，经过plastein反应的肽显著提高了降糖效果。
[0128]
实施例9
[0129]
按照实施例6的方式进行，区别在于按羊乳重量的2％加入实施例8制得的羊乳源降血糖活性肽。
[0130]
对比例9
[0131]
按照实施例9的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于发酵时未添加羊乳源降血糖活性肽。
[0132]
试验例7
[0133]
采用试验例2的方法，检测实施例9和对比例9的α-葡萄糖苷酶抑制活性和dpp-iv抑制活性，得到的结果见图4、5和表7。
[0134]
表7发酵羊乳在添加降血糖活性肽前后的抑制活性
[0135][0136]
由图4、5和表7可以看出，实施例9的发酵羊乳在模拟胃肠消化前后其α-葡萄糖苷酶抑制活性和dpp-iv抑制活性均明显高于对比例9未添加羊乳源降血糖活性肽的发酵羊乳，且这些降血糖活性肽具有良好的抵抗胃肠消化的能力。可见，利用本发明制备得到的发酵乳产品具有较好的降血糖能力。
[0137]
实施例10
[0138]
步骤一，将市售的牦牛乳酪蛋白粉配置成质量浓度为5％的水溶液，于90℃灭菌10min。按每克酪蛋白水溶液加入4
×
107cfu瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)cicc 6024和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cicc 20263的复合乳酸菌，瑞士乳杆菌：植物乳杆菌＝3:1，搅拌均匀后在42℃发酵酪蛋白水溶液至ph5.0，制备得到牦牛乳酪蛋白发酵液。
[0139]
步骤二，将发酵液搅拌均匀，于90℃加热10min后，用碱液调节发酵液ph至7.5。按重量比，发酵液：亮氨酸氨基肽酶＝1000:1加入亮氨酸氨基肽酶，亮氨酸氨基肽酶活力为1万u/g蛋白。于37℃恒温酶解4h，85℃加热10min灭酶后，获得牦牛乳酪蛋白水解液。
[0140]
对比例10
[0141]
按照实施例10的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于制备得到牦牛乳酪蛋白发酵液后，未进行步骤二的水解过程。
[0142]
试验例8
[0143]
采用试验例1的方法，检测实施例10和对比例10的蛋白水解活力和肽含量，得到的结果见表8。
[0144]
表8牦牛乳酪蛋白水解液经氨肽酶水解后的蛋白水解活力及肽含量
[0145][0146][0147]
从表8中可以看出，实施例10牦牛乳酪蛋白发酵液经亮氨酸氨基肽酶水解后，其蛋白水解活力和肽含量均显著高于对比例10未水解前的牦牛乳酪蛋白发酵液。可见，利用本发明复合乳酸菌发酵技术联合氨基肽酶酶解酪蛋白，比只进行复合乳酸菌发酵技术获得蛋白水解程度更高的酪蛋白水解液和含量更高的肽段。
[0148]
实施例11
[0149]
将实施例10制得的酪蛋白水解液真空浓缩至固形物含量为55％，调节牦牛乳酪蛋白水解液ph至7.0，按重量比，酪蛋白水解浓缩液：中性蛋白酶＝3000:1添加中性蛋白酶，中性蛋白酶活力为10万u/g。再按酪蛋白水解浓缩液重量的2％加入丙氨酸，在40℃保温6.5h进行plastein反应。将plastein反应液真空冷冻干燥得到牦牛乳源降血糖活性肽。
[0150]
对比例11
[0151]
按照实施例11的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于省略加入丙氨酸进行plastein反应。
[0152]
试验例9
[0153]
采用试验例2的方法，检测实施例11和对比例11的α-淀粉酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，得到的结果见表9。
[0154]
表9牦牛乳源降血糖活性肽在plastein反应前后的降血糖效果
[0155] α-淀粉酶抑制活性(％)α-葡萄糖苷酶抑制活性(％)实施例1167.88
±
0.3440.08
±
0.02对比例1142.69
±
1.1420.47
±
0.12
[0156]
表9表明，实施例11制得的牦牛乳源降血糖活性肽其α-淀粉酶抑制活性达到67.88％，比对比例11未经plastein反应的肽增加了25.19％；实施例11的α-葡萄糖苷酶抑制活性达到40.08％，比对比例11的肽增加了19.61％。可见，经过plastein反应的肽显著提高了降糖效果。
[0157]
实施例12
[0158]
按照实施例6的方式进行，区别在于按牦牛乳重量的3％加入牦牛乳源降血糖活性肽。
[0159]
对比例12
[0160]
按照实施例12的方式进行，采用同批次实验原料，区别在于发酵时未添加牦牛乳源降血糖活性肽。
[0161]
试验例10
[0162]
采用试验例2的方法，检测实施例12和对比例12的α-葡萄糖苷酶抑制活性和dpp-iv抑制活性，得到的结果见图6、7和表10。
[0163]
表10发酵牦牛乳在添加降血糖活性肽前后的抑制活性
[0164][0165]
由图6、7和表10可以看出，实施例12的发酵牦牛乳在模拟胃肠消化前后其α-葡萄糖苷酶抑制活性和dpp-iv抑制活性均明显高于对比例12未添加牦牛乳源降血糖活性肽的发酵牦牛乳，且这些降血糖活性肽具有良好的抵抗胃肠消化的能力。可见，利用本发明制备得到的发酵乳产品具有较好的降血糖能力。
[0166]
由此可见，本发明利用瑞士乳杆菌和植物乳杆菌产生的特异性蛋白酶和肽酶，水解酪蛋白生成特定肽段，进一步通过亮氨酸氨基肽酶把这些肽段n-末端的亮氨酸游离出来，富集得到更多目标肽。再通过plastein反应修饰将氨基酸合成到新肽链中，得到活性更高的降糖肽。利用本发明制备得到的发酵乳产品具有较好的降血糖能力。
[0167]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种降血糖活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将酪蛋白与水配置成酪蛋白水溶液，与复合乳酸菌混合发酵，得到酪蛋白发酵液；将酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶混合酶解，得到酪蛋白水解液；将酪蛋白水解液进行plastein反应，得到降血糖活性肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合乳酸菌包括：瑞士乳杆菌和植物乳杆菌；所述瑞士乳杆菌和植物乳杆菌的活菌菌落数比为1~6:1。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为30~50℃，发酵至酪蛋白水溶液的ph为4.0~6.0。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶的重量比为500~1500:1。5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的ph为6.0~8.0，温度为30~45℃，时间为2~4h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述plastein反应前，还包括将酪蛋白水解液浓缩，所述浓缩后的固形物含量为40%~60%。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述plastein反应时，还包括向所述酪蛋白水解浓缩液中添加氨基酸，所述氨基酸的添加量为1.0%~4.5%，所述氨基酸包括丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸中的一种或几种。8.根据权利要求1或6或7所述的制备方法，其特征在于，所述plastein反应的ph为6.5~8.0，温度为30~50℃，时间为2~8h。9.利用权利要求1~8任一项所述的制备方法制得降血糖活性肽。10.权利要求9所述降血糖活性肽在制备发酵食品中的应用。

技术总结
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种降血糖活性肽的制备方法和应用，包括以下步骤：将酪蛋白水溶液与复合乳酸菌混合发酵，得到酪蛋白发酵液；将酪蛋白发酵液与亮氨酸氨基肽酶混合酶解，得到酪蛋白水解液；将酪蛋白水解液进行Plastein反应，得到降血糖活性肽。本发明利用瑞士乳杆菌和植物乳杆菌产生的特异性蛋白酶和肽酶，水解酪蛋白生成特定肽段，进一步通过亮氨酸氨基肽酶把这些肽段N-末端的亮氨酸游离出来，富集得到更多目标肽。再通过Plastein反应修饰将氨基酸合成到新肽链中，得到活性更高的降糖肽。到活性更高的降糖肽。到活性更高的降糖肽。


技术研发人员：李思宁 唐善虎
受保护的技术使用者：西南民族大学
技术研发日：2023.08.21
技术公布日：2023/10/7