一种用于检测鸭源性成分的LAMP-Taqman引物和探针组合、试剂盒及应用的制作方法

一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及肉及肉制品安全检测技术领域，尤其涉及一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合、试剂盒及应用。


背景技术：

2.近年来，随着生活水平的不断改善，肉类消费需求呈逐年增长的趋势。同时，食品加工工艺也在不断提高，肉类食材经过加工后很大程度改变了食材原有的色泽、味道、纹理、气味等特性，导致传统的感官鉴别技术已经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。肉类及肉制品掺假已成为食品质量控制面临的主要挑战之一。肉类掺杂使假主要分为全部替代和部分替换，例如，一些夜市使用鸭肉串作为羊肉串进行售卖、在羊肉卷、羊肉馅中掺加鸭肉、某些牛肉速冻水饺中原料首位也多为鸭肉、猪肉和鸡肉一种或多种混合，牛肉实际用量无法确定。肉类或肉制品掺杂使假还极可能引入过敏原，危害消费者健康。
3.目前，肉类认证检测技术以定性检测为主，主要包括光谱法、质谱法、色谱法、elisa法、pra法、聚合酶链式反应(pcr)法、激光诱导击穿光谱(libs)方法、环介导等温扩增(lamp)法等。光谱法、质谱法、色谱法、pra法和pcr法，所用试剂价格较高、检测仪器昂贵，检测成本高，且对操作人员的专业素质要求较高，限制了肉类检测的广泛推广。elisa法操作步骤繁琐，检测时间长，且样品加工处理可能导致蛋白质变性，在高度加工肉制品中的应用受到限制。lamp由于其快速简便、仪器廉价等优势迅速发展起来。然而lamp法通过凝胶成像结果只能定性，无法进行定量检测，同时具有特异性不高，易产生非特性扩增，造成“假阳性”等缺点。因此，开发快捷、简便、实用的定量检测技术对保护消费者利益，以及保证消费者身体健康、保证市场公平竞争至关重要。


技术实现要素：

4.针对现有lamp方法鸭源性成分检测方法存在的假阳性概率高、无法定量检测、以及检测方法繁琐、检测成本高等问题，本发明提供一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合、试剂盒及应用。利用本发明提供的检测鸭源性成分的引物和探针组合，可在60℃-63℃恒温条件下快速检测鸭源性成分，且特异性好、灵敏度高，同时又具备定性定量、避免非特异性扩增、降低气溶胶污染等优势，有利于促进鸭源性成分快速定性定量检测技术的实际市场应用推广。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合，包括：
7.内引物fip：5
′‑
ttacggtagctcctcagaacgattatagcaactgcct tcgtag-3
′
(seq id no:1)；
8.内引物bip：5
′‑
accctggtagaatgagcctgatgaatggcgaagaat cgg-3
′
(seq id no:
1.4mm，内引物fip 2.0μm，内引物bip 2.0μm，外引物f3 0.5μm，外引物b3 0.5μm，环引物lf 1.5μm，环引物探针lbp 1.5μm，ddh2o补足24μl。
29.需要说明的是，ddh2o根据实验试剂的用量确定是否需要进行添加，若各试剂总体积不足24μl则加入ddh2o补足，若各试剂总体积已满足24μl，则无需加入ddh2o。
30.优选的，所述lamp扩增的反应温度为60℃-63℃，反应时间为26-50min。
31.进一步优选的，所述lamp扩增的反应温度为60℃，反应时间为30min。
32.优选的lamp扩增条件，可以提高鸭源性成分的检测效率。
33.本发明提供的用于鸭源性成分检测的引物和探针组合，具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速鉴别出肉制品中是否含有鸭源性成分，并且能够从含有多种肉制品中特异性扩增出鸭源性成分的dna，有效避免了假阳性检测结果的出现，为准确定量检测鸭源性成分提供了有效手段，对于防止敏感人群食入含鸭肉制品后过敏现象的发生和促进市场公平竞争具有重要意义，为我国动物源性产品的检测、监测提供了便捷、可靠的技术保障，在肉制品检测领域具有较高的实用价值。
附图说明
34.图1是本发明实施例2中lamp-taqman检测方法的特异性测试结果图；
35.图2是本发明实施例4中lamp-taqman检测方法的稳定性测试结果图。
具体实施方式
36.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
38.实施例1
39.1.材料与方法
40.1.1样本与试剂盒
41.鸭肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、马肉、驴肉、虾肉、鸽子肉、鹦鹉肉、狐狸肉、鱿鱼、鲤鱼、鼠肉、水貂均购自各大商超的单一品类生鲜肉，并经国家标准方法进行分离鉴定后保存。
42.1.2引物和探针的设计
43.根据鸭源的保守序列(sequence id:ku577585)设计引物和探针，设计得到的引物序列如表1所示，并由上海生工生化有限公司合成并标记。
44.表1引物和探针
45.引物名称引物序列(5
′‑3′
)内引物fipttacggtagctcctcagaacgattatagcaactgccttcgtag内引物bipaccctggtagaatgagcctgatgaatggcgaagaatcgg外引物f3gagtaatcctactgctcactc外引物b3gcctgattcgtgtaggaag环引物lftcctcatggcaggacataac
环引物探针lbpggaggattctcagtggataacc
46.1.3.dna/rna的提取
47.根据市售baypure磁珠法动物组织基因组dna提取试剂盒的说明书要求对各样品进行dna提取，将提取的dna/rna保存于-20℃用于后续试验。
48.1.4检测鸭源性成分方法的建立
49.检测鸭源性成分的试剂盒包括内引物fip、内引物fip、外引物f3、外引物b3、环引物lf、环引物探针lbp、thermopol buffe、bst dna polymerase large fragment、taq dna polymerase、硫酸镁溶液、dtnps和去离子水。
50.提取鸭源性核酸为模板，结合上述试剂盒构建lamp-taqman反应体系(24μl)：1
×
thermopol buffer，bst dna polymerase large fragment 8u，taq dna polymerase 5u，mgso
4 1.4mm，dntps 1.4mm，内引物fip 2.0μm，内引物bip 2.0μm，外引物f3 0.5μm，外引物b3 0.5μm，环引物lf 1.5μm，环引物探针lbp 1.5μm，ddh2o补足24μl。
51.向含有24μl反应液的反应管中加入1μl待测核酸为模板，进行lamp扩增，于60℃扩增40min，每分钟采集一次荧光。
52.若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为鸭源性成分阳性；若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为鸭源性成分阴性。
53.实施例2
54.lamp-taqman检测鸭源性成分的特异性试验：
55.按照实施例1的方法，以鸭肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、马肉、驴肉、虾肉、鸽子肉、鹦鹉肉、狐狸肉、鱿鱼、鲤鱼、鼠肉、水貂的15种动物源样品作为样品进行检测，以灭菌水作为阴性对照。
56.按照市售baypure磁珠法动物组织基因组dna提取试剂盒的说明书分别提取鸭肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、马肉、驴肉、虾肉、鸽子肉、鹦鹉肉、狐狸肉、鱿鱼、鲤鱼、鼠肉、水貂的dna；将提取的dna作为模板进行lamp扩增，于60℃扩增40min。
57.lamp扩增体系：1
×
thermopol buffer，bst dna polymerase large fragment 8u，taq dna polymerase 5u，mgso
4 1.4mm，dntps 1.4mm，内引物fip 2.0μm，内引物bip 2.0μm，外引物f3 0.5μm，外引物b3 0.5μm，环引物lf 1.5μm，环引物探针lbp 1.5μm，ddh2o补足24μl。
58.检测结果如图1所示，从图中可以看出，只有鸭源核酸出现典型的s型扩增曲线，而其他动物源核酸均未出现扩增，证明了本发明提供的lamp-taqman检测方法用于检测鸭源性成分具有很好的特异性。
59.实施例3
60.lamp-taqman检测鸭源性成分的敏感性试验：
61.从genbank数据库中找到鸭源序列保守区域，使用primer explorer v5网站设计lamp引物组，包括内引物(fip/bip)、外引物(f3/b3)及环引物(lb/lf)，使用lb设计为lbp探针，于3'端与5'端修饰荧光基团-fam与淬灭基团-bhq1。引物及探针由上海生工合成，序列见表1和表2。
62.表1taqman-lamp引物和探针序列
63.引物/探针名称序列(5'
→
3')fipttacggtagctcctcagaacgattatagcaactgccttcgtagbipaccctggtagaatgagcctgatgaatggcgaagaatcggf3gagtaatcctactgctcactcb3gcctgattcgtgtaggaaglbggaggattctcagtggataacclftcctcatggcaggacataaclbp(fam)ggaggattctcagtggataacc(bhq1)
64.参照gb/t38164-2019合成鸭源特异性引物和探针，序列见表2。
65.表2荧光定量pcr引物和探针序列
66.引物/探针名称序列(5'
→
3')fggccacacaaatcctcacagrtgtgttggctactgaggagaaap(fam)cctactggctatgcactacaccgcagac(eclipse)
67.将鸭肉分别与生羊肉混合，使其质量浓度分别依次为10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％，充分混匀后，进行核酸提取。然后分别采用lamp(fip+bip+f3+b3+lf，简写为lamp(lf))、lamp(fip+bip+f3+b3+lb，简写为lamp(lb))、lamp(fip+bip+f3+b3+lb+lf，简写为lamp(lb/lf))、lamp(fip+bip+f3+b3+lbp+lf，简写为lamp(lbp/lf))、pcr检测体系进行检测，检测结果见表3。
68.表3敏感性检测结果
[0069][0070][0071]
由表3可知，lamp(lf)、lamp(lb)、lamp(lb/lf)、lamp(lbp/lf)、pcr检测体系的灵敏性分别为0.001％、0.001％、0.001％、0.001％、0.0001％。相关系数r2分别为0.9975、0.9919、0.9902、0.9991、0.9998，由此可见，lamp(lbp/lf)、pcr检测体系的线性系数更好。lamp(lf)、lamp(lb)、lamp(lb/lf)检测体系在多次实验后由于气溶胶污染问题逐渐严重，空白产生假阳性结果。pcr检测法和lamp(lbp/lf)检测法的特异性更高，均无非特异性扩
增。lamp(lbp/lf)在低质量浓度条件时，检测时间比pcr短的多，与lamp(lb/lf)基本一致。lamp(lbp/lf)检测法26min即可完成检测，检测时间短，同时避免了“假阳性”结果，准确度高，证明本发明提供的检测鸭源性成分的方法具有很好的实际应用前景。
[0072]
实施例4
[0073]
lamp-taqman检测鸭源性成分方法的稳定性验证：
[0074]
采用lamp(lbp/lf)检测体系对实施例3中的低质量浓度浓度0.001％鸭源核酸样品进行8次重复测试，以ddh2o为阴性对照，检测结果如图2所示。
[0075]
对ct值的变异系数cv值进行计算，cv值为1.99％，证明taqman-lamp检测方法检测鸭源性成分的方法的稳定性好。
[0076]
实施例5
[0077]
临床样本检测：
[0078]
市售待检样品：通过菜市场、超市及各线上平台共采购了47份牛肉、羊肉、猪肉制品，包括牛肉速冻水饺、羊肉速冻水饺、猪肉速冻水饺、牛肉干、牛肉卷、黑椒牛肉馅饼半成品、合成牛排、撒娇牛丸、牛肉汉堡饼、生羊肉串、熟羊肉串、羊肉卷、羊肉烧麦、羊肉烤包子、猪肉脯、猪肉四喜丸子、猪肉香肠、猪肉小笼包、牛肉小笼包等。
[0079]
利用市售baypure磁珠法动物组织基因组dna提取试剂盒提取各待测样品的核酸，取1μl待测核酸为模板，按照实施例1提供的lamp-taqman方法进行检测，并与参考检测方法(gb/t38164-2019)进行比较。
[0080]
结果表明，47份样品经核酸提取试剂盒提取核酸后，进行lamp-taqman检测，检测到29份鸭源性成分阳性样本；gb/t38164-2019检测方法检测到29份鸭源性成分阳性样本，检测结果一致，符合率100％。
[0081]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合，其特征在于，包括：内引物fip：5
′‑
ttacggtagctcctcagaacgattatagcaactgcct tcgtag-3
′
；内引物bip：5
′‑
accctggtagaatgagcctgatgaatggcgaagaat cgg-3
′
；外引物f3：5
′‑
gagtaatcctactgctcactc-3
′
；外引物b3：5
′‑
gcctgattcgtgtaggaag-3
′
；环引物lf：5
′‑
tcctcatggcaggacataac-3
′
；环引物探针lbp：5
′‑
ggaggattctcagtggataacc-3
′
。2.如权利要求1所述的用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合，其特征在于，所述环引物探针lbp的5
′
端标记有荧光基团，3
′
端标记有荧光淬灭基团。3.如权利要求2所述的用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合，其特征在于，所述环引物探针lbp为：5
′‑
fam-ggaggattctcagt ggataacc-3
′
bhq。4.权利要求1-3任一项所述的用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合在非诊断性检测鸭源性成分中的应用。5.一种用于检测鸭源性成分的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的用于检测鸭源性成分的lamp-taqman引物和探针组合。6.如权利要求5所述的用于检测鸭源性成分的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、dna聚合酶、硫酸镁溶液、dtnps和去离子水。7.利用权利要求5所述的试剂盒检测鸭源性成分的方法，其特征在于，具体操作为：提取鸭源性成分的核酸为模板，用所述试剂盒进行lamp扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。8.如权利要求7所述的检测鸭源性成分的方法，其特征在于：所述lamp扩增的体系包括以下试剂及用量：1
×
thermopol buffer，bst dna polymerase large fragment 8u，taq dna polymerase 5u，mgso
4 1.4mm，dntps1.4mm，内引物fip 2.0μm，内引物bip 2.0μm，外引物f3 0.5μm，外引物b30.5μm，环引物lf 1.5μm，环引物探针lbp 1.5μm，ddh2o补足24μl。9.如权利要求7所述的检测鸭源性成分的方法，其特征在于：所述lamp扩增的反应温度为60℃-63℃，反应时间为26min-50min。10.如权利要求9所述的检测鸭源性成分的方法，其特征在于：所述lamp扩增的反应温度为60℃，反应时间为30min。

技术总结
本发明涉及肉及肉制品安全检测技术领域，具体公开一种用于检测鸭源性成分的LAMP-Taqman引物和探针组合、试剂盒及应用。所述检测鸭源性成分的引物和探针中，内引物FIP的序列如SEQ ID NO:1，内引物BIP的序列如SEQ ID NO:2，外引物F3的序列如SEQ ID NO:3，外引物B3的序列如SEQ ID NO:4，环引物LF的序列如SEQ ID NO:5，环引物探针的序列如SEQ ID NO:6。利用本发明的引物和探针，可实现对鸭源性成分的准确检测，且可避免非特异性扩增导致的假阳性结果的出现，特异性强、灵敏度高、最低检出质量浓度为0.001％，最快仅需26min即可完成检测。最快仅需26min即可完成检测。最快仅需26min即可完成检测。


技术研发人员：时国强 董振国 柳梦思 高娜婷
受保护的技术使用者：河北三狮生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/10/7