一株谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用的制作方法

一株谷氨酸棒杆菌及其在生产l-谷氨酸中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物制造领域，尤其涉及一株谷氨酸棒杆菌及其在生产l-谷氨酸中的应用。


背景技术：

2.l-谷氨酸一般是以l-谷氨酸
·
单钠的形式摄入体内的，l-谷氨酸
·
单钠，俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用，广泛应用烹饪调味、改善和加强食品的自然风味、食品加工等领域。在胃中胃酸将l-谷氨酸
·
单钠再次转化为l-谷氨酸，l-谷氨酸被吸收后参与蛋白质的构成，参与人体大多数重要的代谢，拥有非常高的营养价值。l-谷氨酸在氨基的脱离、转运，还有羧基的脱落等反应中起着相当重要的作用，l-谷氨酸还大量存在于脑部的血液中，对大脑皮质和中枢神经非常重要。l-谷氨酸参与构成蛋白质，是人体和动物的重要营养物质，具有特殊的生理作用，在食品、医药、工业、农业等方面都有广泛应用。
3.l-谷氨酸的生产方法目前主要采用微生物发酵法生产。微生物发酵法生产l-谷氨酸，具有更低的生产成本、更加绿色环保、更易于大规模生产等显著的优越性。近些年，为了进一步提高谷氨酸生产能力，提升企业的市场竞争力，我国在优良菌株选育、开发生产谷氨酸的新原料、研究发酵新工艺等方面都做了很多努力，同时也取得了非常显著的效果，但仍存在很多问题，如菌种不稳定、培养基成分波动引起发酵波动、原料转化率低、发酵杂酸多影响产品提取纯度等。在谷氨酸提纯过程中，l-谷氨酰胺与谷氨酸的化学结构最为相似，更容易在谷氨酸结晶过程中进入晶体或吸附在晶面上，影响谷氨酸的结晶过程，使谷氨酸结晶过程中出现颗粒幼小，转晶前就出现大量β晶形，结晶形状散乱，晶形不均匀界面模糊等问题。


技术实现要素：

4.本发明提出了一种谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-谷氨酸中的应用。
5.本发明的目的之一，是提供一种谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cglzh1008，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为cgmcc no.25471。
6.本发明的目的之二，是提供一种谷氨酸棒杆菌的应用，采用谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cglzh1003生产l-谷氨酸。
7.所述生产l-谷氨酸的方法包括：（1）菌种斜面活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cglzh1008甘油管恢复至室温，在无菌超净台上划线至斜面培养基上进行活化培养，培养温度32℃；（2）菌种扩大培养：将菌种接种于液体种子培养基中扩大培养，培养温度32~35℃；（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养；
（4）提取纯化：对发酵液进行提取纯化工艺得到l-谷氨酸产品。
8.进一步地，每升斜面培养基包含葡萄糖5~10g、酵母粉5~10g、蛋白胨10~20g、磷酸二氢钾1~5g、琼脂粉15~30g。
9.进一步地，每升液体种子培养基包含葡萄糖5~50g、酵母粉5~20g、硫酸铵5~10 g、磷酸二氢钾2~5g、硫酸镁0.05~1g、氯化钾0.05~1g、消泡剂0.1~5g。
10.进一步地，每升发酵培养基包含葡萄糖5~60g、多肽粉5~20g、玉米浆干粉1~30g、硫酸铵1~10g、磷酸1~10g、硫酸镁0.05~5g、氯化钾0.1~10g、消泡剂0.1~5g。
11.进一步地，发酵培养条件为：温度32~35℃、ph值6.5~7.5、溶氧10~30%、罐压0.02~0.10mpa、发酵过程中残糖含量控制在0.5~2%；发酵培养至中期提高发酵温度至36~40℃。
12.进一步地，发酵液提取纯化的具体步骤为：将l-谷氨酸发酵液进行蒸发浓缩，然后进行连续等电结晶，然后进行离心分离，分离得到麸酸晶体，将麸酸晶体进行转晶，真空抽滤得到l-谷氨酸晶体。
13.本发明的有益效果是：本发明通过将谷氨酸棒杆菌atcc 13032变种进行多种诱变育种技术复合诱变处理，并进行高通量定向筛选，筛选得到本技术中已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为cgmcc no.25471的谷氨酸棒杆菌cglzh1008。该菌株具有独特的生理和生化特性，可在科研、工业等领域进行研究和应用。本发明中的谷氨酸棒杆菌cglzh1008，具有较好的菌种稳定性，采用该菌种发酵生产l-谷氨酸，发酵结束产酸有了显著提高，同时谷氨酸发酵液中的l-谷氨酰胺杂质大幅降低，彻底克服了谷氨酸结晶过程中出现颗粒幼小，转晶前就出现大量β晶形，结晶形状散乱，晶形不均匀界面模糊等问题。该菌种培养条件粗放，工艺操作简单，具有较好的工业化应用前景。
具体实施方式
14.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
15.一株谷氨酸棒杆菌cglzh1008，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏时间为2022年08月01日，菌种保藏编号为cgmcc no.25471，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
16.一株谷氨酸棒杆菌的应用，采用谷氨酸棒杆菌cglzh1008发酵生产l-谷氨酸。
17.发酵生产l-谷氨酸的方法如下：（1）菌种斜面活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌cglzh1008甘油管恢复至室温，在无菌超净台上划线至斜面培养基上进行活化培养，培养温度32℃；每升活化斜面培养基为包含葡萄糖5g、酵母粉6g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾4g、琼脂粉15g。
18.（2）菌种扩大培养：将活化后的谷氨酸棒杆菌cglzh1008接种于液体种子培养基中扩大培养，培养温度32~35℃；每升液体种子培养基包含葡萄糖5g、酵母粉10g、硫酸铵5 g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、消泡剂0.1g。
19.（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养，发酵培养条件：温度32~35℃、ph值6.5~7.5、溶氧10~30%、罐压0.02~0.10mpa、发酵过程中残糖含量控制在0.5~2%；发酵培养至中期提高发酵温度至36~40℃；每升发酵培养基包含葡萄糖5g、多肽粉7g、玉米浆干粉1g、硫酸铵2g、磷酸1g、硫酸镁0.05g、氯化钾0.1g、消泡剂0.1g。
20.（4）对l-谷氨酸发酵液进行提取纯化得到产品，提取纯化步骤如下：将l-谷氨酸发酵液进行蒸发浓缩，然后进行连续等电结晶，然后进行离心分离，分离得到麸酸（谷氨酸）晶体，将麸酸晶体进行转晶，真空抽滤得到l-谷氨酸晶体。
21.通过该种方式，采用30 l发酵罐培养，培养至32h，产l-谷氨酸187.85 g/l，发酵液中l-谷氨酰胺含量为0.6g/l。经过提取纯化，得到l-谷氨酸晶体3888.5g。
实施例2
22.一株谷氨酸棒杆菌的应用，采用谷氨酸棒杆菌cglzh1008发酵生产l-谷氨酸。
23.发酵生产l-谷氨酸的方法如下：（1）菌种斜面活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌cglzh1008甘油管恢复至室温，在无菌超净台上划线至斜面培养基上进行活化培养，培养温度32℃；每升活化斜面培养基为包含葡萄糖10g、酵母粉8g、蛋白胨20g、磷酸二氢钾5g、琼脂粉30g。
24.（2）菌种扩大培养：将活化后的谷氨酸棒杆菌cglzh1008接种于液体种子培养基中扩大培养，培养温度32~35℃；每升液体种子培养基包含葡萄糖50g、酵母粉20g、硫酸铵10 g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁1g、氯化钾1g、消泡剂5g。
25.（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养，发酵培养条件：温度32~35℃、ph值6.5~7.5、溶氧10~30%、罐压0.02~0.10mpa、发酵过程中残糖含量控制在0.5~2%；发酵培养至中期提高发酵温度至36~40℃；每升发酵培养基包含葡萄糖60g、多肽粉20g、玉米浆干粉30g、硫酸铵10 g、磷酸10g、硫酸镁5g、氯化钾10g、消泡剂5g。
26.（4）对l-谷氨酸发酵液进行提取纯化得到产品，提取纯化步骤如下：将l-谷氨酸发酵液进行蒸发浓缩，然后进行连续等电结晶，然后进行离心分离，分离得到麸酸（谷氨酸）晶体，将麸酸晶体进行转晶，真空抽滤得到l-谷氨酸晶体。
27.通过该种方式，采用30 l发酵罐培养，培养至32h，产l-谷氨酸188.21 g/l，发酵液中l-谷氨酰胺含量为0.3g/l。经过提取纯化，得到l-谷氨酸晶体3917.4g。
实施例3
28.一株谷氨酸棒杆菌的应用，采用谷氨酸棒杆菌cglzh1008发酵生产l-谷氨酸。
29.发酵生产l-谷氨酸的方法如下：（1）菌种斜面活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌cglzh1008甘油管恢复至室温，在无菌超净台上划线至斜面培养基上进行活化培养，培养温度32℃；每升活化斜面培养基为包含葡萄糖7g、酵母粉5g、蛋白胨15g、磷酸二氢钾1g、琼脂粉20g。
30.（2）菌种扩大培养：将活化后的谷氨酸棒杆菌cglzh1008接种于液体种子培养基中扩大培养，培养温度32~35℃；每升液体种子培养基包含葡萄糖35g、酵母粉5g/l、硫酸铵6g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁0.05g、氯化钾0.05g、消泡剂4g。
31.（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养，发酵培养条
件：温度32~35℃、ph值6.5~7.5、溶氧10~30%、罐压0.02~0.10mpa、发酵过程中残糖含量控制在0.5~2%；发酵培养至中期提高发酵温度至36~40℃；每升发酵培养基包含葡萄糖40g、多肽粉5g、玉米浆干粉15g、硫酸铵1 g、磷酸2g、硫酸镁0.7g、氯化钾5g、消泡剂2g。
32.（4）对l-谷氨酸发酵液进行提取纯化得到产品，提取纯化步骤如下：将l-谷氨酸发酵液进行蒸发浓缩，然后进行连续等电结晶，然后进行离心分离，分离得到麸酸（谷氨酸）晶体，将麸酸晶体进行转晶，真空抽滤得到l-谷氨酸晶体。
33.通过该种方式，采用200吨发酵罐培养，发酵培养至32h，产l-谷氨酸186.75 g/l，发酵液中l-谷氨酰胺含量为0.5g/l。经过提取纯化，得到l-谷氨酸晶体25.63吨。
实施例4
34.一株谷氨酸棒杆菌的应用，采用谷氨酸棒杆菌cglzh1008发酵生产l-谷氨酸。
35.发酵生产l-谷氨酸的方法如下：（1）菌种斜面活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌cglzh1008甘油管恢复至室温，在无菌超净台上划线至斜面培养基上进行活化培养，培养温度32℃；每升活化斜面培养基为包含葡萄糖8g、酵母粉10g、蛋白胨18g、磷酸二氢钾3g、琼脂粉25g。
36.（2）菌种扩大培养：将活化后的谷氨酸棒杆菌cglzh1008接种于液体种子培养基中扩大培养，培养温度32~35℃；每升液体种子培养基包含葡萄糖25g、酵母粉15g、硫酸铵8g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁0.7g、氯化钾0.09g、消泡剂3g。
37.（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养，发酵培养条件：温度32~35℃、ph值6.5~7.5、溶氧10~30%、罐压0.02~0.10mpa、发酵过程中残糖含量控制在0.5~2%；发酵培养至中期提高发酵温度至36~40℃；每升发酵培养基包含葡萄糖30g、多肽粉15g、玉米浆干粉20g、硫酸铵5g、磷酸7g、硫酸镁3g、氯化钾3g、消泡剂3g。
38.（4）对l-谷氨酸发酵液进行提取纯化得到产品，提取纯化步骤如下：将l-谷氨酸发酵液进行蒸发浓缩，然后进行连续等电结晶，然后进行离心分离，分离得到麸酸（谷氨酸）晶体，将麸酸晶体进行转晶，真空抽滤得到l-谷氨酸晶体。
39.通过该种方式，采用200吨发酵罐培养，发酵培养至32h，产l-谷氨酸187.95g/l，发酵液中l-谷氨酰胺含量为0.5g/l。经过提取纯化，得到l-谷氨酸晶体26.44吨。
实施例5
40.谷氨酸棒杆菌的诱变筛选方法以谷氨酸棒杆菌cicc10109变种为出发菌，经过多轮原生质体紫外诱变、硫酸二乙酯（des）化学诱变、常压室温等离子（atmospheric and room temperature plasma，artp ）诱变处理，同时结合结构类似物抗性定向筛选，获得具有底物抗性和遗传标记的谷氨酸高产菌株。谷氨酸棒杆菌cicc10109变种由天津科技大学微生物菌种保藏管理中心将中国工业微生物菌种保藏管理中心的谷氨酸棒杆菌cicc10109突变后获得原生质体紫外诱变方法：取制备好原生质体2~3 ml，加入直径5 cm的平皿中，置于20 w的紫外灯下，垂直照射60~90 s，然后用移液枪吸取0.2 ml涂布于培养皿中，避光32 ℃培养36~72 h。硫酸二乙酯（des）化学诱变方法：用菌株斜面菌株经过一次种子培养后，离心沉降10 min（3000~5000 r/min），收集菌体，用无菌水洗涤菌体2~3次，再次离心收集菌体，
加入ph 7.0的磷酸盐缓冲液至原体积，用浓度为1%（v/v）的硫酸二乙酯处理30~60 min，用无菌水稀释后，进行一级培养。artp诱变选育方法：从新鲜活化斜面上挑取一环菌种于种子培养基中，180 r/min、32 ℃ 摇床培养4.5 h，取1 ml种子液于1.5 ml ep管，4000 rpm离心，去除上清液，加入1 ml生理盐水，混匀，反复三次，将菌悬液稀释，使菌悬液od600为0.6~1.0；取10
ꢀµ
l 稀释菌液均匀涂到无菌不锈钢载片上，artp 诱变条件：射频功率120 w，处理距离2 mm，载气流量10 slm (standard liters per minute)，处理温度为室温（20~40 ℃），诱变处理时间选择致死率达到90%以上的处理时间。将处理过的载片放入装有1 ml 无菌生理盐水的ep管中，震荡混匀，然后稀释到10-1、10-2倍，取100
ꢀµ
l均匀涂布到平板上，每个梯度做两个平行，32 ℃培养24 h。
41.抗性菌株筛选方法：用接种环从诱变后的平板中取一满环菌种于无菌离心管中，用无菌水离心洗涤两次，然后悬于无菌水中制成菌悬液，按浓度梯度制备一系列的谷氨酸氧肟酸盐、卡英酸、磺胺胍抗性培养基平板，直接将菌悬液分别涂布于抗性平板上，32 ℃培养2～3 d。根据出发菌株耐受结构类似物的浓度确定诱变菌株筛选用结构类似物浓度，随机挑选生长菌落进行筛选。
42.菌种初筛：将种子培养基分装到96孔板中，每个100μl，将平板上的单菌落挑到种子液孔板中，180r/min，32℃培养16 h，并同时接种到另一块平板上，32℃ 培养24 h后放入冰箱。将发酵培养基分装到孔板中，每个90μl，种子液接10μl，180 r/min，32℃培养24 h。挑取发酵产酸较高的菌种，将平板上对应序号的菌种挑至斜面，32℃培养16 h，甘油管保存。
43.菌种复筛：将初筛甘油管保藏的菌种分别划一支斜面，32℃培养20 h。从斜面上挑一环菌至500 ml种子摇瓶中，180 r/min，32℃培养6 h，转接500 ml发酵摇瓶，180 r/min，32℃培养24 h，测发酵摇瓶产酸，挑取产酸较高的菌种保存。
44.遗传稳定性试验：将上述筛选获得的谷氨酸高产菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，每一代菌株先进行种子培养，选择遗传稳定和产酸高的菌株用于进一步研究。摇瓶传代方法：把谷氨酸高产菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至下一代摇瓶。
45.将最终获得的一株谷氨酸高产菌株cglzh1008再连续传种十次，使用30l发酵罐培养考察其l-谷氨酸的产量。结果如下：表1 菌株cglzh1008的遗传稳定性
46.从表1中可以看出，突变菌株cglzh1008的遗传稳定性良好，连续传代10次在30l发酵罐培养结束的l-谷氨酸含量基本稳定在180~190g/l，而l-谷氨酰胺的含量维持在0.6g/l以下，菌株cglzh1008的遗传稳定性良好。
47.对比实验：使用本发明中的谷氨酸棒杆菌cglzh1008和原菌株cicc10109变种，结合本发明中的相关工艺分别进行30l罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如下表：表2 突变菌株和出发菌发酵生产谷氨酸的性能比较
48.从表2中可以看出，本发明中的菌株cglzh1008相比出发菌在发酵结束l-谷氨酸含
量得到了较大提升，而l-谷氨酰胺的含量显著降低，使用该菌株cglzh1008进行谷氨酸发酵生产，更利于得到晶形较好纯度较高的谷氨酸晶体，具有较好的工业化应用潜力。
49.对该菌株进行传代保藏，命名为谷氨酸棒杆菌cglzh1008，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），其分类命名为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum），保藏日期为2022年08月01日，菌种保藏编号为cgmcc no.25471，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
50.中国科学院微生物研究所对谷氨酸棒杆菌cglzh1008的细胞形态、生理生化特征、16s rrna基因序列（其基因序列如seq no.1所示）等项目进行了检测鉴定，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》以及international journal of systematic and evolutionary microbiology有关研究论文，菌株编号cglzh1008的鉴定结果为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）。
51.本发明中的谷氨酸棒杆菌cglzh1008，具有较好的菌种稳定性，采用该菌种发酵生产l-谷氨酸，发酵结束l-谷氨酸的含量有了显著提高，同时谷氨酸发酵液中的l-谷氨酰胺杂质大幅降低，彻底克服了谷氨酸结晶过程中出现颗粒幼小，转晶前就出现大量β晶形，结晶形状散乱，晶形不均匀界面模糊等问题。该菌种培养条件粗放，工艺操作简单，具有较好的工业化应用前景。
52.以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

技术特征：
1.一种谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cglzh1008，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为cgmcc no. 25471。2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，采用谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cglzh1008生产l-谷氨酸。3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，生产方法包括：s1、菌种斜面活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）cglzh1008甘油管恢复至室温，在无菌超净台上划线至斜面培养基上进行活化培养，培养温度32℃；s2、菌种扩大培养：将活化后的菌种接种于液体种子培养基中扩大培养，培养温度32~35℃；s3、发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养；s4、提取纯化：对发酵液进行提取纯化工艺得到l-谷氨酸产品。4.根据权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，每升斜面培养基包含葡萄糖5~10g、酵母粉5~10g、蛋白胨10~20g、磷酸二氢钾1~5g、琼脂粉15~30g。5.根据权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，每升液体种子培养基包含葡萄糖5~50g、酵母粉5~20g/l、硫酸铵5~10 g、磷酸二氢钾2~5g、硫酸镁0.05~1g、氯化钾0.05~1g、消泡剂0.1~5g。6.根据权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，每升发酵培养基包含葡萄糖5~60g、多肽粉5~20g/l、玉米浆干粉1~30g、硫酸铵1~10 g、磷酸1~10g、硫酸镁0.05~5g、氯化钾0.1~10g、消泡剂0.1~5g。7.根据权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，发酵培养条件为：温度32~35℃、ph值6.5~7.5、溶氧10~30%、罐压0.02~0.10mpa、发酵过程中残糖含量控制在0.5~2%；发酵培养至中期提高发酵温度至36~40℃。8.根据权利要求3-7任一项所述的谷氨酸棒杆菌的应用，其特征在于，提取纯化的具体步骤为：将l-谷氨酸发酵液进行蒸发浓缩，然后进行连续等电结晶，然后进行离心分离，分离得到麸酸晶体，将麸酸晶体进行转晶，真空抽滤得到l-谷氨酸晶体。

技术总结
本发明公开了一株谷氨酸棒杆菌及其在生产L-谷氨酸中的应用，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）cglzh1008，菌种保藏编号为CGMCC No.25471。本发明中的谷氨酸棒杆菌cglzh1008，具有较好的菌种稳定性，采用该菌种发酵生产L-谷氨酸，产酸有了显著提高，同时谷氨酸发酵液中的L-谷氨酰胺杂质大幅降低，彻底克服了谷氨酸结晶过程中出现颗粒幼小，转晶前就出现大量β晶形，结晶形状散乱，晶形不均匀界面模糊等问题。晶形不均匀界面模糊等问题。


技术研发人员：张天惕 周旭波 唐海静 倪军 马淑芳 高建国
受保护的技术使用者：欧尚元智能装备有限公司 欧铭庄生物科技（天津）有限公司
技术研发日：2023.08.08
技术公布日：2023/10/7