一种注射用重组人凝血因子的制作方法

一种注射用重组人凝血因子
ⅸ
促凝特性的体外检测方法
技术领域
1.本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种注射用重组人凝血因子
ⅸ
促凝特性的体外检测方法。


背景技术：

2.b型血友病是一种遗传性x染色体相关疾病，病因主要在于缺乏功能性凝血因子ix而导致凝血功能受损，患者可能会自发出血或受伤后出血。随着时间的推移，关节和肌肉反复出血可导致严重的关节病。同时，由于凝血因子ix的半衰期相对较短，b型血友病患者需要频繁输注凝血因子ix(fix)以治疗出血或预防出血。
3.重组人凝血因子ix部分与人fix完全一致，在外源性凝血途径中，凝血因子ix(fix)被激活后，可以进一步与凝血因子fviiia结合形成tenase复合物，激活凝血因子x，随后加速凝血系统酶促反应级联中凝血酶和纤维蛋白的生成。
4.人血浆凝血因子ix促凝活性(fix∶c)的测定常用于凝血异常所致出血性疾病的诊断，在出凝血疾病的诊断中具有重要的意义。目前，临床上比较常用的检测凝血因子
ⅸ
促凝特性的方法往往依赖于缺fix血浆(fixdp)。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种基于发色底物法的注射用重组人凝血因子
ⅸ
促凝特性的体外检测方法。通过在体外模拟fixa(激活的fix产品)与fviiia结合形成tenase复合物激活fx的过程，并观察fxa的生成情况，来考察atiii对上述激活反应过程的抑制效应，进而评估不同浓度肝素以及不同atiii含量下注射用重组人凝血因子ix的促凝血机制及其促凝特性。本方法灵敏度高、准确性好、检测时间短，且能够适用于多种自动化分析仪器。
6.具体来说，本发明提供了一种注射用重组人凝血因子ix促凝特性的体外检测方法，所述检测方法包括以下步骤：向多孔板的孔中加入fixa溶液、抗凝血酶iii-肝素混合溶液，室温下混合反应；继续加入fviiia溶液、fx溶液，36-38℃下反应5-6min；然后，加入发色底物溶液；室温、405nm波长条件下测定混合液吸光值od405；利用吸光值求得atiii对fixa的抑制率，完成注射用重组人凝血因子ix促凝特性的体外检测；其中，所述抑制率％＝(od405v―od405s)/(od405v―od405b)
×
100％；od405s：样品处理组的od值，所述样品处理组按照上述检测步骤进行处理；od405v：溶剂对照组的od值，所述溶剂对照组相较于样品处理组未进行抗凝血酶iii-肝素混合溶液的配制与添加；od405b：空白组的od值，所述空白组相较于样品处理组未进行fviiia溶液、fixa溶液以及抗凝血酶iii-肝素混合溶液的配制与添加。
7.较佳地，所述fviiia溶液的配制工艺为：将1.5-2.5nm的fviii溶液和3.5-4.5nm的
α-凝血酶溶液在室温下孵育5-8min，然后加入7-9nm的水蛭素溶液、45-55μm的脑磷脂溶液，得到所述fviiia溶液。
8.较佳地，所述fixa溶液的配制工艺为：将45-55nm的fix溶液与20-30pm的fxia溶液在室温孵育12-14h，得到所述fixa溶液。
9.较佳地，所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液中，抗凝血酶iii的浓度为5-250nm，肝素的浓度为0.01-0.1u/ml；优选地，所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液中，当肝素浓度为0.1u/ml时，所述抗凝血酶iii的浓度为5nm、10nm、50nm或者250nm；当肝素浓度为0.01u/ml时，所述抗凝血酶iii的浓度为10nm、50nm或者250nm。
10.较佳地，所述fx溶液的浓度为90-110nm，优选为100nm。
11.较佳地，控制多孔板的每孔中：fixa溶液的加入量为8-12μl；抗凝血酶iii-肝素混合溶液的加入量为8-12μl；fviiia溶液的加入量为8-12μl；fx溶液的加入量为8-12μl；优选地，所述多孔板为384孔板。
12.较佳地，所述发色底物选择s2765，分子式为n-α-z-d-arg-gly-arg-pna
·
2hcl；控制所述发色底物在每孔中的浓度为190-210μm，优选为200μm。
13.较佳地，每2-3min测定1次吸光值，优选为每2min测定1次，测定时间2h。
14.有益效果本发明可作为体外检测注射用重组人凝血因子
ⅸ
促凝特性的方法，反应时间短，通过发色底物法检测fxa的生成，从而判断注射用重组人凝血因子ix的促凝效果，具有灵敏度高、操作简便等优势。
附图说明
15.图1为实施例1中在不同atiii与肝素浓度下测得的od405nm值随时间变化曲线图。
具体实施方式
16.以下通过实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
17.重组人凝血因子ix部分与人fix完全一致，在外源性凝血途径中，凝血因子ix(fix)被激活后，可以进一步与fviiia结合形成tenase复合物，激活凝血因子x，随后加速凝血系统酶促反应级联中凝血酶和纤维蛋白的生成。此外，在肝素存在的情况下，fixa的活性受到丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶iii(atiii)的负调控。
18.本发明提供了一种基于发色底物法的注射用重组人凝血因子
ⅸ
促凝特性的体外检测方法。通过在体外模拟fixa(激活的fix产品)与fviiia结合形成tenase复合物激活fx的过程，并观察fxa的生成情况，来考察atiii对上述激活反应过程的抑制效应，进而评估不同浓度肝素以及不同atiii含量下注射用重组人凝血因子ix的促凝血机制及其促凝特性。
19.以下，示例性说明本发明提供的注射用重组人凝血因子ix促凝特性的体外检测方法。所述检测方法可以包括以下步骤：(1)分别配制fviiia溶液(a溶液)、fixa溶液(b溶液)、fx溶液以及抗凝血酶iii-肝素混合溶液、发色底物溶液；
(2)向多孔板的孔中加入fixa溶液、抗凝血酶iii-肝素混合溶液，室温下混合反应25-35min，优选为30min；(3)继续加入fviiia溶液、fx溶液，36-38℃下反应5-6min，优选为37℃下反应5min；(4)然后，加入发色底物溶液；(5)室温、405nm波长条件下测定混合液吸光值(od405nm或者od405)，每2-3min测定1次，优选为每2min测定1次，测定时间2h；(6)利用上述测得的吸光值并结合制图软件(如graphpadprism6)求得atiii对fixa的抑制率，从而在体外评估注射用重组人凝血因子ix的促凝特性。通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率。其中，所述抑制率％＝(od405v―od405s)/(od405v―od405b)
×
100％；od405s：样品处理组的od值，所述样品处理组按照上述检测步骤进行处理；od405v：溶剂对照组的od值，所述溶剂对照组相较于样品处理组未进行抗凝血酶iii-肝素混合溶液的配制与添加；od405b：空白组的od值，所述空白组相较于样品处理组未进行fviiia溶液、fixa溶液以及抗凝血酶iii-肝素混合溶液的配制与添加。
20.重组人凝血因子ix部分与人fix完全一致，在外源性凝血途径中，凝血因子ix(fix)被激活后，可以进一步与凝血因子fviiia结合形成tenase复合物，激活凝血因子x，随后加速凝血系统酶促反应级联中凝血酶和纤维蛋白的生成。在肝素存在下，fixa与血浆中的at-iii形成1:1复合物，剩余的fixa激活fx，产生的fxa作用于底物，裂解出显色基团，显色程度与剩余fixa的量呈正相关，而与血浆中at-iii活性呈负相关。其中，(od405s―od405b)/(od405v―od405b)
×
100％表示样品处理组和溶剂对照组均去除背景值影响后，样品处理组相对于溶剂对照组的信号强度比值，100％―(od405s―od405b)/(od405v―od405b)
×
100％即表示atiii对fixa的抑制率，100％―(od405s―od405b)/(od405v―od405b)
×
100％＝(od405v―od405s)/(od405v―od405b)
×
100％，所以(od405v―od405s)/(od405v―od405b)
×
100％即表征atiii对fixa的抑制率。
21.在一些实施方式中，所述fviiia溶液(a溶液)的配制工艺可以为：将1.5-2.5nm的fviii溶液和3.5-4.5nm的α-凝血酶(α-thrombin)溶液在室温下孵育5-8min，然后加入7-9nm的水蛭素(hirudin)溶液、45-55μm的脑磷脂(cephalin)溶液，得到所述fviiia溶液。以上各浓度为各物质在fviiia溶液(a溶液)中的最终浓度。优选地，fviiia溶液的溶剂可以为：含50mmtris(ph7.4)、100mmnacl、5mmcacl2和0.2％bsa的水溶液。
22.在一些实施方式中，所述fixa溶液(b溶液)的配制工艺可以为：将45-55nm的fix溶液与20-30pm的fxia溶液在室温孵育12-14h，得到所述fixa溶液。以上各浓度为各物质在fixa溶液(b溶液)中的最终浓度。优选地，fixa溶液的溶剂可以为：含50mm tris(ph7.4)、100mmnacl、5mmcacl2和0.2％bsa的水溶液。
23.在一些实施方式中，所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液可以采用buffer缓冲溶液稀释后获得；作为一个示例，所述buffer缓冲溶液的组成可以包括50mmtris(ph7.4)，100mm nacl，10mmcacl2，0.2％bsa。
24.所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液中，抗凝血酶iii的浓度可以为5-250nm，肝素的浓度可以为0.01-0.1u/ml。优选地，所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液中，当肝素浓度为0.1u/ml时，所述抗凝血酶iii的浓度为5nm、10nm、50nm或者250nm；当肝素浓度为0.01u/ml
时，所述抗凝血酶iii的浓度为10nm、50nm或者250nm。
25.在一些实施方式中，所述fx溶液的浓度可以为90-110nm，优选为100nm。
26.在一些实施方式中，可以控制多孔板的每孔中：fixa溶液的加入量为8-12μl；抗凝血酶iii-肝素混合溶液的加入量为8-12μl；fviiia溶液的加入量为8-12μl；fx溶液的加入量为8-12μl。优选地，所述多孔板可以为384孔板。
27.在一些实施方式中，所述发色底物可以选择s2765(分子式为n-α-z-d-arg-gly-arg-pna
·
2hcl)；每孔加入量可以为19-21μl，优选为20μl；控制所述发色底物在每孔中的浓度为190-210μm，优选为200μm。
28.本发明作为体外检测注射用重组人凝血因子
ⅸ
促凝特性的方法，反应时间短，通过发色底物法检测fxa的生成，从而判断注射用重组人凝血因子ix的促凝效果，具有灵敏度高、操作简便等优势。
29.下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
30.实施例1
31.通过研究不同浓度的atiii和肝素对fxa生成的抑制作用来进行体外检测注射用重组人凝血因子ix促凝特性。(1)配制fviiia溶液(a溶液)。将2nm的fviii(来源：glpbio)溶液和4nm的α-凝血酶(来源：abcam)溶液在室温下孵育5min，然后加入8nm的水蛭素(来源：glpbio)溶液、50μm的脑磷脂(来源：aladdin)，得到所述fviiia溶液。配制fixa溶液(b溶液)。将50nm的fix(来源：pfizer)溶液与25pm的fxia(来源：hti)溶液在室温孵育13h，得到所述fixa溶液。配制抗凝血酶iii-肝素混合溶液。采用buffer缓冲溶液稀释后获得系列抗凝血酶iii(来源：sinobiological)-肝素(来源：中国食品药品检定研究院)混合溶液；其中，所述系列抗凝血酶iii-肝素混合溶液的浓度为：250nmatiii+0.1u/ml肝素，50nmatiii+0.1u/ml肝素，10nmatiii+0.1u/ml肝素，溶剂对照组+0.1u/ml肝素(用以与溶剂对照组对比，无需计算抑制率)，溶剂对照组，空白组；250nmatiii+0.01u/ml肝素，50nmatiii+0.01u/ml肝素，10nmatiii+0.01u/ml肝素，溶剂对照组+0.01u/ml肝素(用以与溶剂对照组对比，无需计算抑制率)。fx(来源：abcam)溶液的浓度为100nm。(2)向384孔板中的孔中加入fixa溶液10μl、抗凝血酶iii-肝素混合溶液10μl，室温下混合反应30min；(3)继续加入fviiia溶液10μl、fx溶液10μl，37℃下反应5min；(4)然后，加入发色底物s2765(来源：chromogenix)溶液20μl；控制所述发色底物在每孔中的浓度为200μm；(5)室温、405nm波长条件下测定吸光值，每2min测定1次，测定时间2h；(6)利用上述测得的吸光值并结合graphpadprism6求得atiii对fixa的抑制率，从
而完成体外评估注射用重组人凝血因子ix的促凝特性。
32.下表1为在不同atiii与肝素浓度下，测得的od405以及atiii对fixa的抑制率。从表1中可以看出，在有肝素参与的情况下，250nm和50nm的atiii与0.1u/ml肝素或0.01u/ml肝素共同抑制fixa的效果相当；但是，在10nmatiii时，0.1u/ml肝素比0.01u/ml肝素表现出相对更好的抑制fixa的效果。所以，选择0.1u/ml肝素与atiii共同参与可以取得对fixa更好的抑制作用。表1不同atiii与肝素浓度下测得的od405以及atiii对fixa的抑制率
33.图1为实施例1中在不同atiii与肝素浓度下测得的od405nm值随时间变化曲线图。从图中可以看出，随着反应时间的延长，各组od值的变化趋势，其中溶剂对照组，溶剂对照组+0.1u/ml肝素和溶剂对照组+0.01u/ml肝素的曲线变化趋势相似，说明只有肝素存在的情况下，对fixa几乎没有抑制效果，且在反应的2h内，曲线变化趋势呈线性，说明反应时间是合理的。
34.实施例2
35.本实施例检测方法参照实施例1，主要进一步检测在0.1u/ml肝素条件下，分别测试250nm，50nm，5nmatiii对fixa的抑制效果。在肝素存在的情况下，将atiii与fixa共同孵育，然后加入fviiia，形成tenase复合物，激活fx为fxa，与加入的特异性发色底物s2765相互作用，酶标仪检测405nm处吸光值，测试重复三次。实验结果见下表2-4：表2atiii对fixa活性影响实验(测试一)表3atiii对fixa活性影响实验(测试二)
表4atiii对fixa活性影响实验(测试三)
36.从表2-4中可以看出，atiii对活化的fix的活性有抑制作用，且呈浓度依赖性。当atiii浓度为250nm时，活化的fix活性几乎完全被抑制。因此可以推测，在机体内，atiii生理浓度为2.3μm条件下，活化的fix可以被机体负反馈抑制。
37.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种注射用重组人凝血因子ix促凝特性的体外检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：向多孔板的孔中加入fixa溶液、抗凝血酶iii-肝素混合溶液，室温下混合反应；继续加入fviiia溶液、fx溶液，36-38℃下反应5-6min；然后，加入发色底物溶液；室温、405nm波长条件下测定混合液吸光值od405；利用吸光值求得atiii对fixa的抑制率，完成注射用重组人凝血因子ix促凝特性的体外检测；其中，所述抑制率％＝(od405
v
―od405
s
)/(od405
v
―od405
b
)
×
100％；od405
s
：样品处理组的od值，所述样品处理组按照上述检测步骤进行处理；od405
v
：溶剂对照组的od值，所述溶剂对照组相较于样品处理组未进行抗凝血酶iii-肝素混合溶液的配制与添加；od405
b
：空白组的od值，所述空白组相较于样品处理组未进行fviiia溶液、fixa溶液以及抗凝血酶iii-肝素混合溶液的配制与添加。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述fviiia溶液的配制工艺为：将1.5-2.5nm的fviii溶液和3.5-4.5nm的α-凝血酶溶液在室温下孵育5-8min，然后加入7-9nm的水蛭素溶液、45-55μm的脑磷脂溶液，得到所述fviiia溶液。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述fixa溶液的配制工艺为：将45-55nm的fix溶液与20-30pm的fxia溶液在室温孵育12-14h，得到所述fixa溶液。4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液中，抗凝血酶iii的浓度为5-250nm，肝素的浓度为0.01-0.1u/ml；优选地，所述抗凝血酶iii-肝素混合溶液中，当肝素浓度为0.1u/ml时，所述抗凝血酶iii的浓度为5nm、10nm、50nm或者250nm；当肝素浓度为0.01u/ml时，所述抗凝血酶iii的浓度为10nm、50nm或者250nm。5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述fx溶液的浓度为90-110nm，优选为100nm。6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，控制多孔板的每孔中：fixa溶液的加入量为8-12μl；抗凝血酶iii-肝素混合溶液的加入量为8-12μl；fviiia溶液的加入量为8-12μl；fx溶液的加入量为8-12μl；优选地，所述多孔板为384孔板。7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述发色底物选择s2765，分子式为n-α-z-d-arg-gly-arg-pna
·
2hcl；控制所述发色底物在每孔中的浓度为190-210μm，优选为200μm。8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，每2-3min测定1次吸光值，优选为每2min测定1次，测定时间2h。

技术总结
本发明涉及一种注射用重组人凝血因子


技术研发人员：王淑荣 董海辉 毛卓 陈春麟 白静
受保护的技术使用者：美迪西普胜医药科技（上海）有限公司
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/7