一种用于合成创新霉素衍生物的酶组合物及其应用

1.本发明属于创新霉素衍生物合成技术领域，具体涉及一种用于合成创新霉素衍生物的酶组合物及其应用。


背景技术：

2.创新霉素是上世纪七十年代由中国科学家在济南游动放线菌中发现的一个全新抗生素，具有特殊的吲哚骈二氢噻喃环母核结构，以及全新的硫原子引入机制。创新霉素作为色氨酸结构类似物，能够靶向抑制细菌的色氨酰trna合成酶，经实验验证对大肠杆菌和志贺氏菌有显著的抑制效果，但其对绵羊的色氨酰trna合成酶没有抑制作用，可以作为一种新型抗生素的候选分子。但由于创新霉素的抗菌谱较窄，影响了创新霉素在临床上的广泛使用。
3.目前主要通过化学合成法对创新霉素进行修饰获得创新霉素衍生物。但化学合成方法步骤繁琐，反应条件复杂难以控制，并且在化学合成中不可避免地需要用到一些环境污染试剂如巯基乙酸乙酯等。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种用于合成创新霉素衍生物的酶组合物及其应用，以及一种用色氨酸衍生物为底物，通过本发明的酶组合物来合成创新霉素衍生物的方法，为筛选具有良好抗菌活性的创新霉素衍生物提供了先导化合物资源。
5.本发明首先提供一种酶组合物，所述的酶组合物包含有cxm3、cxm4、cxm5、cxm6、cxm7、cxmm、fdx和fdr蛋白酶；
6.所述的cxm3蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:1，cxm4蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:2，cxm5蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:3，cxm6蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:4，cxm7蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:5，cxmm蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:6，fdr蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:7，fdx蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:8，但还可以使用与序列为seq id no:1-8蛋白的同源酶/同工酶来催化。
7.本发明所提供的酶组合物用于将色氨酸衍生物为底物，通过本发明的多酶组合体系来合成去甲创新霉素衍生物；
8.所述的色氨酸衍生物，为5-氟色氨酸(1)、5-氯色氨酸(2)、5-溴色氨酸(3)、5-甲基色氨酸(4)、6-氟色氨酸(5)、6-氯色氨酸(6)、6-溴色氨酸(7)、6-甲基色氨酸(8)和7-甲氧色氨酸(9)。
9.所述的去甲创新霉素衍生物，为5-氟去甲创新霉素(a)、5-氯去甲创新霉素(b)、5-溴去甲创新霉素(c)、5-甲基去甲创新霉素(d)、6-氟去甲创新霉素(e)、6-氯去甲创新霉素(f)、6-溴去甲创新霉素(g)、6-甲基去甲创新霉素(h)和7-甲氧去甲创新霉素(i)。
10.作为实施例的记载，是从色氨酸衍生物1-9制备去甲创新霉素衍生物a-i。
11.本发明的方法，是在反应缓冲液中添加色氨酸衍生物、上述的酶组合物、nadph、
atp、na2s2o3、mgcl2、丙酮酸钠、磷酸吡哆醛(plp)和dtt来进行创新霉素衍生物的合成；
12.所述的反应缓冲液，其一种组成如下：nah2po
4 50mm、nacl 300mm，ph8.0。
13.本发明解决了利用其他色氨酸衍生物合成去甲创新霉素衍生物的方法，与化学合成相比，酶法合成具有专一性强，反应条件温和易控制，操作简单，对环境友好等优点。
附图说明
14.图1：色氨酸衍生物的化学结构图，
15.图2：5-氟去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
16.图3：5-氯去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
17.图4：5-溴去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
18.图5：5-甲基去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
19.图6：6-氟去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
20.图7：6-氯去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
21.图8：6-溴去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
22.图9：6-甲基去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱，
23.图10：7-甲氧去甲创新霉素的结构和hplc-ms检测图谱。
具体实施方式
24.本发明首先提供一种酶组合物，所述的酶组合物包含有cxm3、cxm4、cxm5、cxm6、cxm7、cxmm、fdx和fdr蛋白酶；
25.其中cxm3的氨基酸序列为seq id no:1，cxm4的氨基酸序列为seq id no:2，cxm5的氨基酸序列为seq id no:3，cxm6的氨基酸序列为seq id no:4，cxm7的氨基酸序列为seq id no:5，cxmm的氨基酸序列为seq id no:6，fdr的氨基酸序列为seq id no:7，fdx的氨基酸序列为seq id no:8。
26.但还可使用与序列为seq id no:1-8的蛋白的同源酶/同工酶来进行催化。
27.本发明所提供的酶组合物能够以色氨酸衍生物为底物通过体外“一锅法”实现去甲创新霉素衍生物的合成。
28.其中色氨酸衍生物(结构见图1)主要为吲哚环c5、c6位卤素原子(f、cl、br)和甲基取代以及c7氧甲基取代。
29.所述的合成方法，是在反应缓冲液中添加色氨酸衍生物、上述的酶组合物、nadph、atp、na2s2o3、mgcl2、丙酮酸钠、磷酸吡哆醛(plp)和dtt来进行多种去甲创新霉素衍生物的合成；
30.所述的反应缓冲液是可以保证酶反应活性和所添加的其他物质溶解性的盐溶液。其中一种具体的组分是nah2po
4 50mm、nacl 100-300mm，glycerol0-10％，ph 7.0-8.0。但还可以使用其它能发挥酶组合物功效的缓冲液。
31.所述酶组合物及其它辅因子成分的浓度为1-10μm cxm3、1-10μm cxm4、1-10μm cxm5、1-10μm cxm6、1-10μm cxm7、1-10μm cxmm、5-50μm fdr、10-100μm fdx、1-10mm nadph、0.5-2mm atp、0.5-2mm na2s2o3、1-5mm mgcl2、1-3mm丙酮酸钠、1-20μm磷酸吡哆醛(plp)和1-5mm dtt。
32.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
33.实施例1：“一锅法”合成5-氟去甲创新霉素
34.(1)蛋白的诱导表达
35.将高效表达cxm3、cxm4、cxm5、cxm6、cxmm、fdx和fdr蛋白的大肠杆菌菌株划线接种至lb(含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)平板，高效表达cxm7蛋白的大肠杆菌接种至含50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃培养24h。挑取单克隆于含50μg/ml卡那霉素或含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的50ml lb培养基，37℃、220rpm摇床培养过夜。按1％接种量接种至含相应抗性的500ml tb或lb培养基中，37℃、200rpm培养至od600介于0.8～1，加入终浓度200μm的iptg、500μm的5-氨基乙酰丙酸(5-ala)和500μm的维生素b1(vb1)，随后，在16℃、150rpm条件下培养18-20h诱导蛋白表达。
36.(2)蛋白的纯化
37.离心收集菌体，用lysis buffer(50mm nah2po4，300mm nacl，10mm咪唑，10％甘油，ph 8.0)涡旋振荡重悬菌体，超声破碎细胞后10000rpm，4℃离心60min，上清液与ni-nta4℃孵育60min。然后，使用wash buffer(50mm nah2po4，300mm nacl，20mm咪唑，10％甘油，ph 8.0)对杂蛋白进行洗脱；用elution buffer(50mm nah2po4，300mm nacl，250mm咪唑，10％甘油，ph 8.0)对目标蛋白进行洗脱，根据目标蛋白大小选择合适的超滤管浓缩蛋白溶液；最后使用pd-10脱盐柱去除咪唑，缓冲溶液使用desalting buffer(50mm nah2po4，300mm nacl，10％甘油，ph 8.0)。
38.(3)“一锅法”反应合成5-氟去甲创新霉素
39.以1mm 5-氟色氨酸(1)为底物，加入10μm cxm3、10μm cxm4、10μmcxm5、10μm cxm6、10μm cxm7、10μm cxmm、50μm fdr、100μm fdx、10mm nadph、2mm atp、2mm na2s2o3、5mm mgcl2、3mm丙酮酸钠、20μm磷酸吡哆醛(plp)和5mm dtt，反应缓冲液为nah2po
4 50mm、nacl300mm，ph 8.0，总体积100μl，30℃反应6h后，向反应液中加入2倍体积甲醇终止反应。
40.反应产物经hplc-ms检测，结果显示化合物1经多酶催化后相应产生了与预期分子量相符的5-氟去甲创新霉素即吸收峰a准分子离子峰m/z238.0341[m+h]
+
(图2)，与氟代去甲创新霉素衍生物分子量238.0338[m+h]相符。
[0041]
实施例2：“一锅法”合成5-氯去甲创新霉素
[0042]
以1mm 5-氯色氨酸(2)为底物，加入10μm cxm3、10μm cxm4、10μmcxm5、10μm cxm6、10μm cxm7、10μm cxmm、50μm fdr、100μm fdx、10mm nadph、2mm atp、2mm na2s2o3、5mm mgcl2、3mm丙酮酸钠、20μm磷酸吡哆醛(plp)和5mm dtt，反应缓冲液为50mm nah2po4、300mm nacl，ph 8.0，总体积100μl，30℃反应6h后，向反应液中加入2倍体积甲醇终止反应。反应产物经hplc-ms检测，显示化合物2经多酶催化后相应产生了与预期分子量相符的5-氯去甲创新霉素即吸收峰b准分子离子峰m/z254.0047[m+h]
+
(图3)，与氯代去甲创新霉素衍生物分子量254.0043[m+h]
+
一致。
[0043]
实施例3：“一锅法”合成5-溴去甲创新霉素
[0044]
以1mm 5-溴色氨酸(3)为底物，加入10μm cxm3、10μm cxm4、10μmcxm5、10μm cxm6、10μm cxm7、10μm cxmm、50μm fdr、100μm fdx、10mm nadph、2mm atp、2mm na2s2o3、5mm mgcl2、3mm丙酮酸钠、20μm磷酸吡哆醛(plp)和5mm dtt，反应缓冲液为50mm nah2po4、300mm nacl，ph 8.0，总体积100μl，30℃反应6h后，向反应液中加入2倍体积甲醇终止反应。反应产
nacl，ph 8.0，总体积100μl，30℃反应6h后，向反应液中加入2倍体积甲醇终止反应。反应产物经hplc-ms检测，显示化合物8经多酶催化后相应产生了与预期分子量相符的6-甲基去甲创新霉素即吸收峰h准分子离子峰m/z 234.0592[m+h]
+
(图9)，与甲基代去甲创新霉素衍生物分子量234.0589[m+h]
+
一致。
[0055]
实施例9：“一锅法”合成7-甲氧去甲创新霉素
[0056]
以1mm 7-甲氧色氨酸(9)为底物，加入10μm cxm3、10μm cxm4、10μmcxm5、10μm cxm6、10μm cxm7、10μm cxmm、50μm fdr、100μm fdx、10mm nadph、2mm atp、2mm na2s2o3、5mm mgcl2、3mm丙酮酸钠、20μm磷酸吡哆醛(plp)和5mm dtt，反应缓冲液为50mm nah2po4、300mm nacl，ph 8.0，总体积100μl，30℃反应6h后，向反应液中加入2倍体积甲醇终止反应。反应产物经hplc-ms检测，显示化合物9经多酶催化后相应产生了与预期分子量相符的6-甲基去甲创新霉素即吸收峰i准分子离子峰m/z 250.0537[m+h]
+
(图10)，与甲基代去甲创新霉素衍生物分子量250.0538[m+h]
+
一致。

技术特征：
1.一种酶组合物，其特征在于，所述的酶组合物包含有cxm3、cxm4、cxm5、cxm6、cxm7、cxmm、fdx和fdr蛋白酶。2.如权利要求1所述的酶组合物，其特征在于，所述的cxm3蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:1，cxm4蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:2，cxm5蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:3，cxm6蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:4，cxm7蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:5，cxmm蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:6，fdr蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:7，fdx蛋白酶的氨基酸序列为seq id no:8。3.权利要求1或2所述的酶组合物在以色氨酸衍生物为底物来合成去甲创新霉素衍生物中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的色氨酸衍生物为5-氟色氨酸、5-氯色氨酸、5-溴色氨酸、5-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、6-氯色氨酸、6-溴色氨酸、6-甲基色氨酸或7-甲氧色氨酸。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的去甲创新霉素衍生物为5-氟去甲创新霉素、5-氯去甲创新霉素、5-溴去甲创新霉素、5-甲基去甲创新霉素、6-氟去甲创新霉素、6-氯去甲创新霉素、6-溴去甲创新霉素、6-甲基去甲创新霉素或7-甲氧去甲创新霉素。6.一种从色氨酸衍生物制备去甲创新霉素衍生物的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1或2所述的酶组合物来进行催化。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的色氨酸衍生物为5-氟色氨酸、5-氯色氨酸、5-溴色氨酸、5-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、6-氯色氨酸、6-溴色氨酸、6-甲基色氨酸或7-甲氧色氨酸。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的去甲创新霉素衍生物为5-氟去甲创新霉素、5-氯去甲创新霉素、5-溴去甲创新霉素、5-甲基去甲创新霉素、6-氟去甲创新霉素、6-氯去甲创新霉素、6-溴去甲创新霉素、6-甲基去甲创新霉素或7-甲氧去甲创新霉素。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法是在反应缓冲液中添加色氨酸衍生物、酶组合物、nadph、atp、na2s2o3、mgcl2、丙酮酸钠、磷酸吡哆醛和dtt来进行创新霉素衍生物的合成。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的反应缓冲液的组成如下：nah2po
4 50mm、nacl 300mm，ph 8.0。

技术总结
本发明提供一种用于合成创新霉素衍生物的酶组合物及其应用，所述的酶组合物，所述的酶组合物包含有Cxm3、Cxm4、Cxm5、Cxm6、Cxm7、CxmM、Fdx和FdR蛋白酶。本发明所提供的酶组合物用于将色氨酸衍生物为底物，通过本发明的多酶组合体系来合成去甲创新霉素衍生物。本发明解决了利用其他色氨酸衍生物合成去甲创新霉素衍生物的方法，与化学合成相比，酶法合成具有专一性强，反应条件温和易控制，操作简单，对环境友好等优点。环境友好等优点。环境友好等优点。


技术研发人员：张伟 桑茉莉 马文程 张镜明
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/10/7