一种类黄酮芸香糖苷生物合成相关1,6鼠李糖基转移酶及其应用

92；frydman et al.,2013 the molecular and enzymatic basis of bitter/non-bitter flavor of citrus fruit:evolution of branch-forming rhamnosyltransferases under domestication.the plant journal,73(1),166-178；rodas et al.,2014 linkage mapping,molecular cloning and functional analysis of soybean gene fg2 encoding flavonol 3-o-glucoside(1
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6)rhamnosyltransferase.plant molecular biology,84(3),287-300；hsu et al.,2017 functional characterization of udp-rhamnose-dependent rhamnosyltransferase involved in anthocyanin modification,a key enzyme determining blue coloration in lobelia erinus.the plant journal,89(2),325-337.)，ppugt91ak6在进化树中不与它们聚类在一起，是一种新的1,6鼠李糖基转移酶，这对于鉴定更多物种中的1,6鼠李糖基转移酶及将其应用于基因组改造，改良植物中类黄酮组分，增加食物的保健功能具有重要意义。
6.本发明首次表征了桃ppugt91ak6基因在参与类黄酮芸香糖苷生物合成基因中的独特作用。从桃组织中成功克隆ppugt91ak6基因，即ppugt91ak6的cdna序列(参见seq id no.1所示序列)，通过pcr扩增此dna片段，然后将次片段连接至t-easy载体上(参见实施例1和实施列2)，验证成功后构建表达载体pet-32a(+)在原核细胞中首次表达了ppugt91ak6多肽或蛋白质，即糖基转移酶(参见seq id no.2所示序列和实施例2)。进一步，本发明所述的ppugt91ak6多肽或蛋白质是由所述的ppugt91ak6基因经原核细胞内的复制、转录和翻译过程而来。所述的复制指的是细胞以所述ppugt91ak6基因的核苷酸为模板产生多个相同的ppugt91ak6基因的过程。所述的转录是指细胞以所述多个相同的ppugt91ak6基因的核苷酸为模板，根据核苷酸互补配对原则，以核糖核苷酸为原料，合成对应的ppugt91ak6基因mrna的过程。所述的翻译是指，细胞进一步以所述的ppugt91ak6基因mrna为模板，以各种氨基酸为原料，合成出ppugt91ak6基因对应得多肽或蛋白质的过程。所述的ppugt91ak6在进化树上不与已报道的1,6鼠李糖基转移酶聚类在一起，并且也不与其他二糖ugts聚类在一起(参见附图1)。
7.本发明提供了一种1,6鼠李糖基转移酶，其特征在于，至少含有下列1)～4)特征之一：
8.1)所述1,6鼠李糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为seq:no.1所示；
9.2)所述1,6鼠李糖基转移酶的氨基酸序列为seq:no.2所示；
10.3)与seq id no.1所示的dna序列杂交的核苷酸序列；
11.4)与seq id no.1编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
12.优选的，本发明所述1,6鼠李糖基转移酶编码基因由桃中分离得到；进一步，所述1,6鼠李糖基转移酶编码基因由桃的叶、花、果中得到。只要是编码具有ppugt91ak6 1
→
6位点鼠李糖基化反应功能蛋白质的核苷酸序列，就应包含在本发明涉及的糖基转移酶基因中。
13.本发明还提供了一种基因表达载体，其特征在于：所述的载体含有编码如前所述1,6鼠李糖基转移酶的核苷酸序列或氨基酸序列；进一步，所述基因的核苷酸序列如seq:no.1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如seq:no.2所示。具体地，所述的基因表达载体含有如前所述的ppugt91ak6基因的核苷酸序列或含有如前所述的ppugt91ak6基因的氨基酸序列。本发明所述的基因可插入到现有的真核或原核表达载体中，适宜的载体包括细菌质
粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等。所述的载体是一种环状dna分子，能够在细胞内自主复制和转录表达，是基因工程中最常用的工具之一。
14.本发明还提供了一种转基因细胞系或宿主菌，其特征在于：所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的1,6鼠李糖基转移酶或基因表达载体。具体地，所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的具有ppugt91ak6核苷酸序列或ppugt91ak6氨基酸序列的基因表达载体。本发明所述的含有ppugt91ak6基因的载体可以用来转化到适当细胞系或宿主菌，所述的细胞系可以来自动物或植物细胞，例如昆虫细胞、哺乳动物细胞，所述的宿主菌可以是经过修饰的基因工程菌，例如酵母菌、大肠杆菌等。
15.本发明还提供了如前所述的1,6鼠李糖基转移酶、基因表达载体、转基因细胞系或宿主菌在类黄酮芸香糖苷制备中的应用；进一步，所述的应用包括生产基因工程产品、培育植物新品种、制备食品等。所述的基因工程产品包括利用基因工程技术获取的药品、食品、化妆品、保养保健品等。
16.本发明还提供了一种类黄酮芸香糖苷的制备方法，所述的制备方法选自以下的任意一种：1)向如前所述的糖基转移酶直接提供底物类黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖；2)通向细胞系或宿主菌中导入如前所述的含有1,6鼠李糖基转移酶核苷酸序列的基因表达载体，诱导转基因细胞系或宿主菌表达重组蛋白；向重组蛋白提供底物类黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖，从而合成类黄酮芸香糖苷；3)向细胞系或宿主菌中导入如前所述的含有1,6鼠李糖基转移酶核苷酸序列的基因表达载体，并向宿主菌提供原料类黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖，从而合成类黄酮芸香糖苷。
17.进一步的，本发明提供了一种槲皮素3-o-芸香糖苷的制备方法，所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有ppugt91ak6核苷酸序列的基因表达载体，获得ppugt91ak6体外重组蛋白并提供原料槲皮素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，从而合成槲皮素3-o-芸香糖苷。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，向ppugt91ak6体外重组蛋白提供原料槲皮素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，则生成了槲皮素3-o-芸香糖苷。
18.进一步的，本发明提供了一种山奈酚3-o-芸香糖苷的制备方法，所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有ppugt91ak6核苷酸序列的基因表达载体，获得ppugt91ak6体外重组蛋白并提供原料山奈酚3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，从而合成山奈酚3-o-芸香糖苷。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，向表达ppugt91ak6体外重组蛋白提供原料山奈酚3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，则生成了山奈酚3-o-芸香糖苷。
19.进一步的，本发明提供了一种异鼠李素3-o-芸香糖苷的制备方法，所述的方法是向宿主菌中导入所述的含有ppugt91ak6核苷酸序列的基因表达载体，获得ppugt91ak6体外重组蛋白并提供原料异鼠李素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，从而合成异鼠李素3-o-芸香糖苷。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，向表达ppugt91ak6体外重组蛋白提供原料异鼠李素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，则生成了异鼠李素3-o-芸香糖苷。
20.以大肠杆菌宿主菌为例，诱导其翻译表达ppugt91ak6蛋白，然后提供原料类黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖，从而合成类黄酮芸香糖苷。如图4和实施例3所示，以大肠杆菌宿主菌为例，提供原料槲皮素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，则生成了槲皮素3-o-芸香糖苷；提供原料山奈酚3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，则生成了山奈酚3-o-芸香糖苷；提供原料异鼠李素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖，则生成了异鼠李素3-o-芸香糖苷。
21.本发明对研究更多物种具有独特催化活力和特性的1,6鼠李糖基转移酶具有指导性意义，为开发工程微生物菌或基于基因工程技术的植物类黄酮芸香糖苷组分改良奠定基础。
附图说明
22.图1是桃ppugt91ak6蛋白与其他植物二糖ugt系统发育树分析；ip3ggt(ab192315),gmf3g2gt(lc017844),phugt79b31(bbe29003),ppugt91ak6(oni23205),caugt3(bah80312),cm12rhat(ay048882),fef3g6rhat(lc312144),leabrt2(lc131336),leabrt4(lc131337),ph3rt(x71059),cs16rhat(dq119035),mafgrt(kt324624),gmf3g6rt(ban91401).
23.图2是ppugt91ak6氨基酸序列seq:no.2与其他植物中1,6鼠李糖基转移酶氨基酸序列比对结果。
24.图3是桃ppugt91ak6重组蛋白的sds-page分析图。
25.图4是重组蛋白ppugt91ak6对槲皮素3-o-葡萄糖苷、山奈酚3-o-葡萄糖苷和异鼠李素3-o-葡萄糖苷体外酶活性分析hplc图谱。
26.图5是重组蛋白ppugt91ak6体外酶活性lc-ms图谱。
27.图6是ppugt91ak6催化模式图；以udp-鼠李糖为糖基供体，槲皮素3-o-葡萄糖苷、山奈酚3-o-葡萄糖苷和异鼠李素3-o-葡萄糖苷为糖基受体，经ppugt91ak6催化生成槲皮素3-o-芸香糖苷、山奈酚3-o-芸香糖苷和异鼠李素3-o-芸香糖苷。
具体实施方式
28.下面对本发明的实施例和附图作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
29.实施例1：桃rna提取及ppugt91ak6基因克隆
30.一、实验方法
31.1、材料：以
‘
湖景蜜露’桃果实为材料，设置四个生物学重复，每个重复6个果实，取果皮组织，迅速用液氮冻透，放至-80℃冰箱中保存。
32.2、利用ctab法提取桃果肉的rna，按照primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser(takara)试剂说明书操作合成cdna。以反转录产物cdna为模板，用seq:no.3和seq:no.4所示引物进行pcr扩增，pcr反应体系为50μl，成分分别为：2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mix(10mm each)1μl，dna polymerse(1u/μl)1μl，上下游引物(10μm)各2μl，cdna 1μl，h2o 18μl。pcr程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。得到扩增产物。
33.3、将pcr扩增产物连接到t-easy载体，转化大肠杆菌dh5α，挑取单菌落进行菌落pcr验证，获得阳性菌落进行测序。
34.二、实验结果
35.1、测序结果返还之后经过比对分析得到与基因组数据库相匹配的ppugt91ak6基
因序列seq:no.1，含有1422个核苷酸，编码473个氨基酸的蛋白质，如seq:no.2所示。将seq:no.2与已报道其他植物二糖ugt进行系统发育树分析，得到图1所示结果。
36.2、利用ppugt91ak6氨基酸序列与已报道的1,6鼠李糖基转移酶比对，结果如图2所示。他们共同含有ugt保守序列pspg-box。
37.实施例2：ppugt91ak6基因的原核表达
38.一、实验方法
39.1、设计带有表达载体pet-32a(+)载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如seq:no.5和seq:no.6所示。
40.2、以测序正确t-easy载体为模板，用seq:no.5和seq:no.6所示引物进行pcr扩增，pcr反应体系为50μl，成分分别为：2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mix(10mm each)1μl，dna polymerse(1u/μl)1μl，上下游引物(10μm)各2μl，cdna 1μl，h2o 18μl。pcr程序为：95℃预变性3min，35个循环的95℃15s，58℃15s和72℃1min 40s，72℃5min，4℃hold。
41.3、将pcr扩增产物连接到用限制性内切酶bamhi和xhoi双酶切过的线性pet-32a(+)载体，获得pet-32a(+)-ppugt91ak6重组质粒。
42.4、将pet-32a(+)-ppugt91ak6重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)plyss表达宿主菌中，经菌落pcr验证，挑取阳性菌落接种到500ml lb(amp
+
)液体培养基，37℃培养，直至od
600
为0.6～1.0，获得转基因工程菌。
43.5、在上述转基因的工程菌中加入iptg至终浓度为1mm，16℃诱导24h，收集菌体，500ml收集到1管中，加入20ml 1
×
pbs缓冲液，充分重悬浮菌体，-80℃放置12h以上。将菌体置于30℃水浴锅解冻后，用超声破碎仪破碎5min。在4℃温度下，10000rpm离心30min，收集上清液。用clontech histalon重力纯化试剂盒进一步纯化，获得目的蛋白。
44.二、实验结果
45.利用sds-page方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图3所示。图中可看出，加上重组标签后在71.29kda左右有明显的重组蛋白条带，重组蛋白条带大小与预测的一致。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。
46.实施例3：ppugt91ak6重组蛋白的酶学活性检测分析
47.一、实验方法
48.1、对于黄酮醇底物的酶活性检测，是在总体积100μl，0.1m ph 7.5的tris-hcl缓冲液中进行，缓冲液包含10μl 10mg/ml udp-鼠李糖作为糖基供体，10μl 1mg/ml黄酮醇3-o-葡萄糖苷作为糖基受体，5μg纯化后的重组蛋白和0.1％的dtt。
49.2、酶反应体系在37℃反应10min后加入等量甲醇停止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。
50.3、酶反应产物经hplc进行检测鉴定，所述hplc检测条件如下：waters 2695-2996 dad检测器，ods c18柱(4.6
×
250mm)色谱柱。以含0.1％甲酸水溶液(溶液a)和含0.1％甲酸的100％乙腈(溶液b)为流动相，洗脱梯度为：0-7min，10％-50％b；7-10min，50％b；10-15min，50％-100％b；15-15.1min，100％-10％b；15.1-20min，10％b。检测波长为370nm，柱温为25℃，流速为1ml/min，进样体积为10μl。
51.二、实验结果
52.结果如图4所示，ppugt91ak6重组蛋白以udp-鼠李糖作为糖基供体，可催化槲皮素
3-o-葡萄糖苷、山奈酚3-o-葡萄糖苷和异鼠李素3-o-葡萄糖苷糖基化，生成与标准品一致的槲皮素3-o-芸香糖苷、山奈酚3-o-芸香糖苷和异鼠李素3-o-芸香糖苷，催化流程如图6所示，说明ppugt91ak6重组蛋白具有催化类黄酮葡萄糖苷生成类黄酮芸香糖苷的功能。

技术特征：
1.一种1,6鼠李糖基转移酶，其特征在于，至少含有下列1)～4)特征之一：1)所述1,6鼠李糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为seq:no.1所示；2)所述1,6鼠李糖基转移酶的氨基酸序列为seq:no.2所示。3)与seq id no.1所示的dna序列杂交的核苷酸序列；4)与seq id no.1编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的1,6鼠李糖基转移酶，其特征在于，所述1,6鼠李糖基转移酶编码基因由桃中分离得到；进一步，所述1,6鼠李糖基转移酶编码基因由桃的叶、花、果中得到。3.一种基因表达载体，其特征在于：所述的载体含有编码权利要求1或2所述1,6鼠李糖基转移酶的核苷酸序列或氨基酸序列；进一步，所述基因的核苷酸序列如seq:no.1所示，该基因编码蛋白的氨基酸序列如seq:no.2所示。4.一种转基因细胞系或宿主菌，其特征在于：所述的转基因细胞系或宿主菌含有权利要求1或2所述的1,6鼠李糖基转移酶或权利要求3所述的基因表达载体。5.权利要求1或2所述的1,6鼠李糖基转移酶、权利要求3所述的基因表达载体、权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌在制备类黄酮芸香糖苷中的用途；进一步，所述的用途选自制备基因工程产品、培育植物新品种、制备食品。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的类黄酮芸香糖苷选自槲皮素3-o-芸香糖苷、山奈酚3-o-芸香糖苷、异鼠李素3-o-芸香糖苷的任意一种或多种。7.一种类黄酮芸香糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：1)向权利要求1或2所述的1,6鼠李糖基转移酶直接提供底物类黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖。2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体；向转基因细胞系或宿主菌提供类黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖。3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白；向重组蛋白提供底物黄酮葡萄糖苷和udp-鼠李糖。8.一种槲皮素3-o-芸香糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：1)向权利要求1或2所述的1,6鼠李糖基转移酶直接提供底物槲皮素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体；向转基因细胞系或宿主菌提供槲皮素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白；向重组蛋白提供底物槲皮素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。9.一种山奈酚3-o-芸香糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：1)向权利要求1或2所述的1,6鼠李糖基转移酶直接提供底物山奈酚3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体；向转基因细胞系
或宿主菌提供山奈酚3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白；向重组蛋白提供底物山奈酚3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。10.一种异鼠李素3-o-芸香糖苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法选自以下的任意一种：1)向权利要求1或2所述的1,6鼠李糖基转移酶直接提供底物异鼠李素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。2)向转基因细胞系或宿主菌中导入权利要求3所述的基因表达载体；向转基因细胞系或宿主菌提供异鼠李素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。3)通过权利要求3所述的基因表达载体或权利要求4所述的转基因细胞系或宿主菌获得重组蛋白；向重组蛋白提供底物异鼠李素3-o-葡萄糖苷和udp-鼠李糖。

技术总结
本发明提供了一种1,6鼠李糖基转移酶、表达载体和以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌。本发明首次克隆并验证了桃类黄酮芸香糖苷生物合成相关的PpUGT91AK6基因的功能，实现了PpUGT91AK6基因的异源活性表达，重组蛋白可以利用黄酮葡萄糖苷和UDP-鼠李糖，高效转化成类黄酮芸香糖苷。本发明还提供了PpUGT91AK6基因及其编码蛋白、含有该PpUGT91AK6核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌在类黄酮芸香糖苷生物合成中的用途。本发明进一步提供了表达载体及含有表达载体的转基因细胞系或宿主菌在类黄酮芸香糖苷生物合成和代谢工程中的用途。的用途。


技术研发人员：李鲜 郭妍 曹运琳 任传宏 解林峰 张波 陈昆松
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.04.01
技术公布日：2023/10/11