一种检测尖孢镰刀菌的引物及其检测方法

1.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种检测尖孢镰刀菌的引物及其检测方法。


背景技术：

2.黄连(coptis chinensis franch)有鸡爪连、川黄连等，是多年生草本植物。黄连主要以根、茎供药用，由于其具有抗菌、抗氧化、降糖、抗肿瘤等药用活性，在医疗及保健行业得到广泛应用。然而，近年来，黄连根腐病病害非常严重，严重威胁着黄连产业的发展。
3.根腐病是黄连的主要病害之一，对根部有着严重危害。根腐病发病时，植株的根须会变成黑色，并且会出现根须干腐的症状，时间长久之后会干燥脱落，以至于植株死亡。另外，根腐病是一种危害较大的真菌致病菌，常见的致病菌有尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌；并且，目前并没有治疗根腐病的特效药，而且根腐病发病初期症状并不明显，发病之后难以治愈，这一问题一直是防治真菌病害的一大难题。因此早发现早防治才能将根腐病的危害降到最低。
4.传统的检测方法主要是目测法和柯氏法则对根腐病进行判断。目测法主要是通过观察不同的病原菌孢子形态来确定病原菌的种类，观察病害的病斑特征及作物的发病症状也可以确定致病菌的种类。柯氏法则主要是观察病原菌的分离及接回试验结果来对病害进行诊断。
5.但是传统的检测方法已经难以辨别已经感染的植株，或者病斑形态和发病症状十分相似病害的植株；即，传统的的检测方法难以区分黄连的根腐病的致病菌是由尖孢镰刀菌还是腐皮镰刀菌引起。并且传统方法灵敏度低，能检测出来的时候，根腐病已经非常严重了，再采用防治措施已经没有效果了。
6.基于此，亟需一种具有快捷、简单、灵敏度高的用于黄连根腐病镰刀菌属病原真菌
‑‑
尖孢镰刀菌的检测的方法。


技术实现要素：

7.为了解决现有检测方法已经难以分辨出已经感染的植株，或者病斑形态和发病症状十分相似病害的植株的问题，本发明的目的之一是提供一种检测尖孢镰刀菌的引物。
8.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
9.一种检测尖孢镰刀菌的引物，包括如seq id no.1所示的正向引物和seq id no.2所示的反向引物。
10.本发明的目的之二是提供一种基于检测尖孢镰刀菌的引物检测尖孢镰刀菌的方法，具体包括以下步骤：
11.步骤1、提取待检测样品基因组dna；
12.步骤2、采用权利要求1引物对基因组dna进行pcr扩增；
13.步骤3、对扩增产物进行凝胶电泳检测。
14.进一步地，步骤2中的pcr反应体系包括mix酶10ul、正向引物0.5ul、反向引物0.5ul、dna模板1ul和纯水8ul。
15.进一步地，步骤2中pcr扩增反应程序包括：95℃预变性5min，95℃变性15sec，57℃复性15sec、72℃延伸40sec，30个循环，最后72℃延伸10min。
16.进一步地，若在500bp处有扩增条带，说明待测样品为尖孢镰刀菌。
17.本发明目的之三提供一种用于检测尖孢镰刀菌的试剂盒，该试剂盒包括检测尖孢镰刀菌的引物，还包括pcr反应体系。
18.本发明具有以下有益效果：
19.本发明中设计的引物具有非常好的特异性，其在与尖孢镰刀菌具有极高的相似性、同源性、同为黄连根腐病的致病病原菌以及属于镰刀菌属腐皮镰刀菌的干扰下，能有效的检测出尖孢镰刀菌，在一定程度上为预防尖孢镰刀菌引起的根腐病的感染提供了技术支持。
附图说明
20.图1为pcr为琼脂糖凝胶电泳图，其中，m:dl-2000dna marker，1尖孢镰刀菌引物+尖孢镰刀菌dna1，2:尖孢镰刀菌引物+尖孢镰刀菌dna2，3:尖孢镰刀菌引物+腐皮镰刀菌dna1，4:尖孢镰刀菌引物+腐皮镰刀菌dna2，5:阴性对照；
21.图2为尖孢镰刀菌与腐皮镰刀菌的亲缘关系图。
具体实施方式
22.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
23.实施例1
24.1、引物的设计与合成
25.本技术中通过以下方法进行引物的设计与合成，具体为：
26.首先，通过tblastn功能，将“诱饵蛋白”(ca7alpha-hsdh)与尖孢镰刀菌种群(fusarium oxysporum species complex)数据库中的序列按不同的阅读框进行比对。筛选尖孢镰刀菌基因组，然后确定尖孢镰刀菌基因组的中相应序列的位置，进行序列分析和引物设计；其中，尖孢镰刀菌基因组的信息详见表1所示，tblastn比对分析结果详见表2所示。
27.表1.尖孢镰刀菌的基本信息
[0028][0029]
[0030]
尖孢镰刀菌全基因组序列为gca_015345895.1，全序列共包含54813233bp，gc含量为47.5％，基因组组装水平为重叠群(contigs)，重叠群的数量为53个，组件序列的数量53个。
[0031]
表2.tblastn比对的基本信息
[0032][0033]
经“诱饵蛋白”ca7alpha-hsdh与尖孢镰刀菌基因组核酸序列比对分析，确定基因组为fusarium oxysporum strain etdfoc-6scaffold 139.1，尖孢镰刀菌基因组的相应序列的位置为1526to 2260，序列号为weuz01001241.1，以此段蛋白序列翻译的核酸序列进行引物设计。
[0034]
然后通过blastn功能，将上述所检索出的尖孢镰刀菌序列与尖孢镰刀菌基因组序列比对，找到同源序列并进行引物设计。
[0035]
具体地，本发明中以fusarium oxysporum strain etdfoc-6scaffold 139.1部分核酸序列作为模板进行引物设计，该核酸序列如下所示：
[0036]
tcaacctcacaaataaagttgccctcataatcggtctcggccaaacaggcaccgagggctggggaatcggtgcagcatgcgccgtgaccttggcacgacagggagccatcatctttggcggaaacagaaccctcgcttcaacaacaaagacaaaagagaccattgaagcagagggtggaacatgcgatatcatcgctacagatgctacagactcagcttctgtgaaggcacttgttgatgcttgtatgaagaagcatgggcgtattgatatccttttgacaagcgttggacaatcccagcccggagatcctgcgtctatgagtgaggaagtttgggactcgcaaatggacatcaacctcaagagcgtgtatctcgcatgccatcacgtcctccccataatggaatctcaaaaaagcggttctgtgatctgcatctccagcatcgcaggactccgctacatcggcaaaccccaagtagcctacaacaccgccaaagcagca(seq id no.3)。
[0037]
根据上述序列设计的引物的具体名称以及序列表详见表3，其中，经检查正向引物与反向引物3’端最后五个碱基中并不富含gc，且正向引物3’端无三个连续的g或c，反向引物3’端无三个连续的g或c。正向引物与反向引物的退火温度相近，在5℃左右。正向引物gc含量稍微偏低，反向引物gc含量在正常值40％～60％之间。
[0038]
表3.引物序列及相关参数
[0039][0040]
2、黄连根腐病尖孢镰刀菌pcr反应体系的建立以及引物特异性的验证
[0041]
步骤1、提取待检测样品基因组dna，包括以下步骤：
[0042]
步骤s1、取样
[0043]
在超净工作台上取培养基中长势较好的腐皮镰刀菌与尖孢镰刀菌50～100mg置于1.5ml离心管，各取两份。其中，尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌标准菌株bmz12185，腐皮镰刀菌为腐皮镰刀菌标准菌株bmz146342，并且其均购自宁波明舟生物科技有限公司。
[0044]
步骤s2、破碎细胞壁
[0045]
加入2ulβ-巯基还原剂和200ul buffer digestion，对称放入全自动样品组织研
磨仪内进行破壁。
[0046]
步骤s3、提取
[0047]
将腐皮镰刀菌与尖孢镰刀菌按照ezup柱式真菌基因组dna提取试剂盒说明书进行dna提取。得到尖孢镰刀菌dna1和dna2，腐皮镰刀菌dna1和dna2；并将得到的dna于-20℃的条件下保存。
[0048]
步骤2、pcr反应体系的建立
[0049]
以步骤1中提取的dna为模板，利用如seq id no.1所示的正向引物和seq id no.2所示的反向引物进行pcr扩增得pcr扩增样品；其中pcr反应体系如表4所示，pcr扩增反应程序如表5所示。
[0050]
表4.pcr扩增体系
[0051][0052]
表5.pcr扩增程序的参数
[0053][0054]
步骤3、将步骤2获得的pcr扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳，并于紫外灯下观察并保存测试结果。具体的，取20μl pcr扩增样品与4μl 6
×
loding buffer充分混合后点入胶体中；测试时，设置电泳仪电源：电压160v、电流200ma、电泳时间20min。将电泳后的胶板放入凝胶成像仪中，紫外灯(uv)照射下观察，保存结果。
[0055]
其中，胶体的制备包括以下步骤：
[0056]
步骤c1、称取tris 24.2g，na2edtah2o 3.72g。将称取的两份药品放入烧杯中加入适量蒸馏水，搅拌，使其溶解。待溶解完后滴入5.71ml冰醋酸，继续搅拌，之后转入1l容量瓶中，加蒸馏水定容至1l，制成5
×
tae溶液。再取200ml 5
×
tae缓冲液加入另一个容量瓶中，加蒸馏水定容至1l，得到1
×
tae溶液。
[0057]
步骤c2、将称取的0.5g琼脂糖加入锥形瓶中，加入50ml 1
×
tae缓冲液，摇匀，放入微波炉中加热1min，完全溶解后取出，待温度降至60℃左右，加入5ul goldview，摇匀后，倒
入插好电泳梳的模具中，等待其完全凝固，拔出电泳梳，制得胶体。
[0058]
3、引物特异性验证结果
[0059]
首先，根据图2可以看出，尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌同属于镰刀菌属，又同为黄连根腐病的致病病原菌，具有极高的相似性和同源性。
[0060]
而从图1中可以看出，尖孢镰刀菌dna1(泳道1)和尖孢镰刀菌dna2(泳道2)扩增出500bp左右的目的片段，而腐皮镰刀菌dna1(泳道3)和腐皮镰刀菌dna2(泳道4)无扩增片段，同时阴性对照(泳道5)无明显扩增现象。
[0061]
由此可见，本发明中设计的引物能有效的鉴定尖孢镰刀菌，即本发明中设计的引物的特异性非常好。
[0062]
4、pcr灵敏度检测
[0063]
用dna质量浓度测定仪测定尖孢镰刀菌dna质量浓度；具体为：用ddh2o将得到的dna浓度依次稀释为10ng/μl、1ng/μl以及100pg/μl、10pg/μl、5pg/μl、1pg/μl和100fg/μl，分别取1μl作为检测方法的反应模板。
[0064]
采用pcr技术，质量浓度为10ng/μl～100fg/μl，检测其反应灵敏度的下限，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳得到结果。在优化的反应条件下，用如seq id no.1所示的正向引物和seq id no.2所示的反向引物进行pcr扩增，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，结果表明，该pcr方法检测灵敏度为5pg/μl。即，本发明中的检测方法具有灵敏度高的特点。
[0065]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测尖孢镰刀菌的引物，其特征在于，包括如seq id no.1所示的正向引物和seq id no.2所示的反向引物。2.采用权利要求1所述引物检测尖孢镰刀菌的方法，包括以下步骤：步骤1、提取待检测样品基因组dna；步骤2、采用权利要求1所述引物对基因组dna进行pcr扩增；步骤3、对扩增产物进行凝胶电泳检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的pcr反应体系包括mix酶10ul、正向引物0.5ul、反向引物0.5ul、dna模板1ul和纯水8ul。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤2中pcr扩增反应程序包括：95℃预变性5min，95℃变性15sec，57℃复性15sec、72℃延伸40sec，30个循环，最后72℃延伸10min。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，若在500bp处有扩增条带，说明待测样品为尖孢镰刀菌。6.一种用于检测尖孢镰刀菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

技术总结
本发明公开了一种检测尖孢镰刀菌的引物及其检测方法，该引物包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物。本发明中设计的引物具有非常好的特异性，其在与尖孢镰刀菌具有极高的相似性、同源性、同为黄连根腐病的致病病原菌以及属于镰刀菌属腐皮镰刀菌的干扰下，能有效的检测出尖孢镰刀菌，在一定程度上为预防尖孢镰刀菌引起的根腐病的感染提供了检测技术，有助于及时采取防治措施。施。施。


技术研发人员：谭君 胡媛媛 娄德帅
受保护的技术使用者：重庆第二师范学院
技术研发日：2023.08.22
技术公布日：2023/10/11