全血转录组信息在制备试剂盒中的应用以及全血转录标志物的制作方法

1.本发明属于糖尿病风险预测技术领域，具体涉及一种全血转录组信息在制备试剂盒中的应用以及用于预测非肥胖2型糖尿病风险和血糖代谢异常的全血转录标志物。


背景技术：

2.2型糖尿病是一组由遗传因素与环境因素相互作用而导致的胰岛素分泌不足且伴有胰岛素抵抗的复杂性异质性流行性代谢性疾病。2021年国际糖尿病联盟(international diabetes federation,idf)第10版调查数据显示，全球范围内20-79岁成人2型糖尿病患病人数高达5.37亿(10.5％)，预计到2030年这一数字将达到6.43亿，到2045年将达到7.83亿。2型糖尿病的合并症及微血管大血管并发症急剧增加并恶化了代谢性疾病、心血管疾病、脑血管疾病、冠心病、恶性肿瘤、早期死亡等复杂性疾病的额外风险，亦对糖尿病人群及糖尿病家庭造成了相当大的经济支出与医疗卫生负担。因此，早期识别血糖代谢异常及2型糖尿病易感人群对预防及管理2型糖尿病心脑血管等并发症/合并症至关重要。既往2型糖尿病可靠的风险预测模型通常由人体测量数指标和传统的实验室检测指标构成。最近的研究将遗传因素和代谢分子纳入2型糖尿病风险预测模型，为疾病预测效果提供了证据。然而，作为一个重要的生物学和发病过程，基因转录表达谱在评估及预测2型糖尿病风险中的表现和作用尚未明确。
3.复杂性疾病主要通过多种组织器官的转录变异介导调控。例如，2型糖尿病以血浆葡萄糖水平升高为主要特点，涉及肝脏、胰腺、骨骼肌、内脏脂肪等多种组织器官的代谢及功能变化。事实上，组织器官转录水平的变化既参与了组织器官的功能失调、疾病的发生发展亦反映了组织器官的代谢及功能改变、疾病的状态与进程。转录本的变异在很大程度上介导了基因分型和复杂性状之间的因果关系。因此，了解个体的组织特异的基因表达(tissue-specific gene expression,tsge)有望提供重要的健康与疾病信息，可更好的理解复杂性疾病的病原学，明确疾病的精准亚型，评估药物的有效性，发现新的药物靶点，实现个体化的精准医疗。然而，大多数人体组织，例如胰腺、肝脏、肾脏、心脏、脑组织、肌肉组织等难以通过非侵入的方法获取，使得人体组织转录组学的研究受限。作为一种替代方法，血液转录组学可很好的预测组织特异性的表达。利用getx(genotype-tissue expression)数据库中的32个组织(胰腺、肾上腺、肝脏、脾脏、肺脏、甲状腺、乳腺、胃、脑组织、骨骼肌、内脏脂肪组织等)及血液样本的转录组学数据作为研究对象，发现血液转录组学可预测32个组织中平均约60％的组织特异的基因表达。而发明人关注的是骨骼肌、内脏脂肪组织、胰腺、肝脏等。发明人发现血液转录组学可预测骨骼肌高达81.7％的组织特异的基因表达，内脏脂肪组织高达71.5％的组织特异的基因表达，胰腺高达52.4％的组织特异的基因表达，肝脏高达33.3％的组织特异的基因表达。采用roc曲线下的面积(area under the receiver operating characteristic curve,auc)评估并比较血液转录组学推断的组织特异性表达与实际测得的组织特异性基因表达对复杂性疾病的预测价值，发现血液转录组学推断的组织特异性表达在预测2型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、高血压等复杂性疾病方面
pax4。
35.现有技术相比，本发明的有益效果在于：
36.(1)本发明采用高通量全血rna-seq技术开展转录组测序，采用惩罚性回归模型及10-折交叉验证的方法构建wb-trs，采用独立内部验证及独立外部队列验证的方式评估wb-trs性能，保证了研究结果和结论的统计效力和稳健性；且发现队列和外部独立验证队列的测序平台一致，亦保证了研究结果的可靠性。
37.(2)本发明的发现队列的2型糖尿病及健康对照其bmi维持在正常范围内长达10年，有助于揭秘非肥胖2型糖尿病潜在的病理生理学机制。
38.(3)本发明利用twmr的策略将基因表达数据和gwas数据有机结合，有助于发现基因转录本如何介导遗传变异与环境变异对疾病的影响进而识别关键的致病基因。
附图说明
39.图1为本发明实施例中研究对象纳入流程图；图中，t2d为2型糖尿病，bmi为体质量指数，rna-seq为转录组学测序。
40.图2为本发明实施例中采用的研究方案设计图；图中，bmi为体质量指数，cpm为转录组表达定量的度量衡单位，sb-trs为全血转录组风险评分，twmr为全转录组学孟德尔随机化研究，dpmh study为饮食模式及代谢健康研究。
41.图3为本发明实施例中训练集具有rna测序数据的人群中wb-trs构建时对非肥胖2型糖尿病lasso logistic回归及交叉验证的结果。
42.图4为本发明实施例中wb-trs分布的小提琴图及与非肥胖2型糖尿病最为负相关(fuom)/最为正相关(rpf1)基因转录本表达水平的小提琴图；图中，t2d为2型糖尿病。
43.图5为本发明实施例中总人群中按照年龄、性别分层分析全血转录组风险评分与非肥胖2型糖尿病的相关性图；图中，采用多元logistic回归计算比值及95％置信区间；模型校正年龄、性别、体质量指数、糖尿病家族史、腰围、收缩压、舒张压、吸烟习惯、饮酒习惯、体力活动水平、教育水平、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂及总胆固醇；图中，t2d为2型糖尿病。
44.图6为本发明实施例中总人群中wb-trs与血糖稳态指标的关联图；图中，箱式图为总人群不同代谢异常下wb-trs分布；采用单因素方差分析比较wb-trs组间差异p值；森林图为总人群中wb-trs与胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能失调的相关性；模型校正年龄、性别、体质量指数、糖尿病家族史、腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇及甘油三脂；本实施例中，胰岛素抵抗被定义为homa-ir≥2.5；胰岛β细胞功能失调被定义为homa-β《50％；图中，wb-trs为全血转录组风险评分。
45.图7为本发明实施例中采用限制性立方样条图评估wb-trs与血糖代谢特征的相关性图；图中，模型校正年龄、性别、体质量指数、糖尿病家族史、腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇及甘油三脂；图中，hdl-c为高密度脂蛋白胆固醇，ldl-c为低密度脂蛋白胆固醇，ogtt为口服葡萄糖耐量试验，hba1c为糖化血红蛋白，homa-ir为胰岛素抵抗指数，homa-β为胰岛β细胞功能。
46.图8为本发明实施例中预测非肥胖2型糖尿病的roc曲线；图中，传统模型包含年龄、性别、体质量指数及糖尿病家族史；图中，wb-trs为全血转录组风险评分，bmi为体质量指数，fbg为空腹血糖，tg为甘油三酯，auc为roc曲线下的面积。
47.图9为本发明实施例中mitch分析图；图中，比较wb-trs最低分位(或最高分位)与中间分位基因表达水平的差异；图中，a为采用层次聚类的方法比较量对比组基因表达富集分数的热图，红色的模块表示正的富集分数，蓝色的模块表示负的富集分数，b为重要的代谢途径和mtorc1信号通路；图中，botvmid＝wb-trs最低分位vs中间分位，tertile；topvmid＝wb-trs最高分位vs中间分位。
具体实施方式
48.尽管超重/肥胖是2型糖尿病发病的关键危险因素之一，但仍有一小部分体重处于正常范围内的人群，其2型糖尿病发病风险依然较高，表明排除肥胖因素外应着重强调代谢健康在2型糖尿病发病机制中的重要性。例如，bmi或腰围相同的情况下，东亚人群的2型糖尿病风险明显高于欧美人群，提示亟需警惕及探究正常偏重人群，尤其是东亚正常偏重人群的2型糖尿病发病风险及潜在的病理生理学机制。最新发表在lancet杂志的一项大型观察性研究收集全球57个中低收入国家68,616名成年人的调查数据发现，与bmi处于正常范围(23.0-25.0kg/m2)的人群相比，bmi处于正常偏高范围(23.0-25.0kg/m2)的男性人群2型糖尿病风险增加43％，女性2型糖尿病风险增加41％，而对亚洲人群来说，这个数字甚至更高，男性2型糖尿病风险增加90％，女性2型糖尿病风险增量53％。目前科学界对这种情况的理解是约1/3确诊2型糖尿病人群的bmi《25kg/m2。同时，发明人分析了一项纳入111,576名中国成年人的多中心大型观察性前瞻性队列研究即中国心脏代谢疾病及肿瘤队列研究(china cardiometabolic disease and cancer cohort study，4c)的调查数据发现，bmi《23kg/m2的人群中2型糖尿病患病率约为22.6％，略低于bmi》28kg/m2的人群中的2型糖尿病患病率(26.4％)。然而，目前bmi正常范围的2型糖尿病的预防和病因尚不清楚。
49.2型糖尿病是一组临床表现、疾病进展、药物治疗反应、疾病预后甚至病理生理存在显著异质性的代谢性多基因复杂性疾病。现有的分型及诊疗方案既不能反映疾病的病理生理机制，亦无法预测远期并发症。最新致力于糖尿病精确分型的调查研究成功实现糖尿病新亚组的划分，强调并突出了非肥胖2型糖尿病的理念，为深入研究2型糖尿病异质性，早期识别高危人群，提高个体化医疗，实现精准医疗奠定了夯实的科学基础。糖尿病分型研究发现非肥胖2型糖尿病的主要特征是bmi水平较低、糖尿病发病年龄较早、胰岛素分泌严重缺乏和常合并严重的急慢性并发症。例如，2018年发表在lancet de杂志上的糖尿病分型研究，利用糖尿病发病年龄、bmi、糖化血红蛋白水平、胰岛β细胞功能(homa2-b)、胰岛素抵抗(homa2-ir)和谷氨酸脱羧酶自身抗体等6种指标的聚类成功将14755例源自scaina队列的新发糖尿病人群重新划分成临床特点、疾病进程及并发症风险不同的5种新亚型：严重胰岛素缺乏型糖尿病(severe insulin-deficient diabetes,sidd)、严重自身免疫性糖尿病(severe autoimmune diabetes,said)、严重胰岛素抵抗型糖尿病(severe insulin-resistant diabetes,sird)、轻度肥胖相关性糖尿病(mild obesity-related diabetes,mod)及轻度年龄相关性糖尿病(mild age-related diabetes,mard)；而严重胰岛素缺乏型糖尿病最为特殊，表现为bmi水平低：28.88
±
4.77kg/m2，糖尿病发病年龄早：56.74
±
11.14
trs对血糖代谢特征动态变化的预测价值。第三，本发明采用转录组孟德尔随机化及生物信息学分析策略探讨与疾病易感性和发病机制有关的潜在致病基因和生物学调节途径，以提高识别非肥胖2型糖尿病潜在因果基因的敏感性及准确性。
50.以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
51.实施例：
52.一、研究对象及方法：
53.1.1研究对象
54.本实施例发现队列的研究对象依托于瑞金医院内分泌科已建立的长期随访且具备完整注释信息的中国2型糖尿病、高血压等慢性病危险图谱调查研究。本实施例是一项针对中国人群的大型单中心前瞻性队列研究，旨在开展2型糖尿病/高血压相关行为(如生活方式、饮食习惯、体力活动、睡眠模式)、环境因素(如环境干扰物双酚类物质)、体液生物标志物(血清学指标、尿液指标等)等危险因素的关联及因果关系研究。本实施例发现队列所纳入的研究对象隶属于上海市淞南社区。所有研究对象在基线(2008-2009年)、第一次现场随访(2013年)及第二次现场随访(2018年)接受并完成了全面详尽的健康检查，如社会经济人口信息的采集、体格测量学指标的收集、生物化学指标的检测等。本实施例所涉及的研究内容及研究方法均已通过上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会的批准与认可。所有研究对象于项目实施开展前已充分阅读了解研究内容并签署书面知情同意书。
55.本实施例发现队列的研究对象是非肥胖2型糖尿病人群。根据2008-2009年、2013年及2018年的健康调查数据，首先排除了2008年之前诊断的2型糖尿病人群，纳入了既往10年(2008-2018年)间bmi持续保持在正常范围(bmi《25kg/m2)且在2018年收集了空腹血液转录组学测序样本的研究对象。最终，1183名研究对象完成了血液转录组学测序血样采集，1105名研究对象具有高质量测序数据纳入本实施例的分析。研究参与者的流程图如图1所示。
56.1.2研究方法
57.1.2.1信息采集
58.本实施例采用国际统一标准化的流行病学调查问卷以面对面交流的形式开展详尽的社会经济信息学指标、慢性病病史、伴随用药情况、生活方式等信息采集。目前吸烟被定义为研究对象在过去的6个月内至少每日吸食1根香烟，或者至少每周吸食7根以上香烟。目前饮酒被定义为研究对象在过去的6个月内至少每周饮用1次酒精饮品。从未吸烟及从未饮酒则被定义为研究对象既往从未拥有规律吸烟及饮酒的行为。本实施例采用标准的国际体力活动调查问卷(global physical activity questionnaire,gpaq)短量表收集研究对象体力活动的频率、强度及时长等重要信息，旨在衡量研究对象的体育活动水平。本实施例所涉及的体力活动，不仅考虑了工作时的体力活动情况，亦考虑了闲时的体力活动情况。本实施例参照研究对象每周所进行的低强度体力活动(如打太极、散步等)、中等强度体力活动及剧烈体力活动的时间和频率来计算研究对象的代谢当量(metabolic equivalent of task hours per week，met-h/wk)，并以此来评估研究对象的总体体力活动水平。
59.1.2.2人体测量学指标检查
60.本实施例采用标准化的流程及规范开展详尽的人体测量学指标的检查。采用欧姆龙牌的自动化超声波体重身高测量仪(型号：hnh-318，产地：日本)测量研究对象的体重及身高，记录的数值分别精确到0.1kg及0.1cm。采用标有国际度量衡单位的标准且柔软的卷尺紧贴研究对象的皮肤，水平绕脐一周，测量腰围，并于研究对象平静呼吸末读取并记录所测量的周长(数值要求精确到0.1cm)。采用欧姆龙牌自动化智能电子血压计(型号：omron model hem-752fuzzy，生产商：欧姆龙公司)测量研究对象坐位非优势手臂的静息血压3次，每次测量间隔至少1分钟，且测量前安静休息5-10分钟，取3次测量数据的平均值用于评估研究对象的血压水平。
61.1.2.3血生化测定
62.所有研究对象均需要隔夜禁食至少8-10小时，于次日清晨7:00-9:00抵达随访现场，休息5-10分钟后抽取空腹静脉血标本。空腹静脉血标本采集后，要求研究对象完成馒头餐试验或口服75g葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,ogtt)，等待2小时后再次抽取静脉血标。采用电阻抗及流式细胞学技术(beckman coulter lh750血液分析仪)及高效液相色谱法(bio-rad公司，美国)分别完成血细胞分析及糖化血红蛋白水平测定；采用beckman coulter au5800全自动生化分析仪(beckman公司，美国)检测血脂水平、肾功能及肝功能等代谢性指标的浓度；采用电化学免疫荧光(roche-diagnostics,瑞士)的方法检测空腹及ogtt或馒头/面包餐2小时的胰岛素水平；采用己糖激酶的方法检测空腹及ogtt或馒头/面包餐2小时的血糖水平。本实施例采用稳态模型评估研究对象的胰岛素抵抗水平(homa-ir,homeostasis model assessment of insulin resistance)，其计算公式为：homa-ir＝空腹血糖(mmol/l)
×
空腹胰岛素(mu/l)/22.5；采用稳态模型估算研究对象的胰岛β细胞功能(homa-β,homeostasis model assessment of beta cell function)，其计算公式为：homa-β＝(20
×
空腹胰岛素[uiu/ml]/(空腹血糖[mmol/l]-3.5)。
[0063]
1.2.4全血样本的采集及rna提取
[0064]
本实施例于第3次(2018年)随访时采用paxgene blood rna收集管(paxgene blood rnatubes)采集了所有研究对象的空腹外周全血标本，将其充分颠倒混匀后迅速置于含有冰袋的保温箱内贮存，并迅速转移到中心实验室的4℃冰箱内，使其充分裂解，隔天置于中心实验室
–
80℃的超低温冰箱贮存。本实施例采用paxgene blood mirna kit secondary bd hemogard closures(产品货号：763134，qiagen/bd，德国)提取全血rna标本，抽提时严格遵循试剂盒生产厂商所提供的标准操作流程规范手册进行，抽提得到的为样本的总rna。
[0065]
(1)rna抽提的注意事项
[0066]
(1.1)购置的paxgene blood mirna kit secondary bd hemogard closures常温环境下运输。无rna酶的dna酶试剂盒(内含无rna酶的dna酶[rnase-free dnase]、缓冲液rdd[buffer rdd]、无rna酶的水[rnase-free water]三种试剂)应置于2-8℃的温度下贮存，其余配件应于室温即15-25℃干燥环境下贮存。
[0067]
(1.2)确保paxgene blood mirna kit secondary bd hemogard closures完好无所，缓冲液无外漏。杜绝使用破损的试剂盒。
[0068]
(1.3)为了避免将样品转移到错误的管和塑料消耗品上，确保所有的处理管、微离心管和转子适配器都使用马克笔正确无误的标记。标记每个微离心管的盖子和主体，每个
处理管的主体和每个转子适配器的外壁。
[0069]
(1.4)rna抽提过程中，样品和缓冲液的溢出可能会降低rna的产量和纯度。
[0070]
(1.5)从
–
80℃超低温冰箱取出含有全血标本的paxgene blood rna收集管，将其置于室温下融化，而后在室温下孵育2小时，使得血细胞充分裂解。为增加rna抽提的产量，可将含有全血标本的paxgene blood rna收集管过夜孵育，但不建议水浴加热处理血凝块，温度高容易造成rna降解。
[0071]
(1.6)缓冲液bm2和bm3储存时可能有形成沉淀。如有必要，加热至37℃溶解。
[0072]
(1.7)paxgene blood mirna kit secondary bd hemogard closures中的缓冲bm3和bm4为浓缩液。第一次使用前，按说明书提示，加入适当体积的乙醇(96-100％，纯度等级p.a)，制备标准的工作溶液。
[0073]
(1.8)如果第一次使用无rna酶的dna酶试剂(rnase-free dnase set)，请准备dna酶i(dnase i)原液。在550ul无rna酶的水准中溶解固态dnase i(1500kunitz单位)。当打开dna酶i的小瓶时，注意不要丢失dna酶i。dna酶i对物理变性特别敏感。混合时只能轻轻倒置小瓶。
[0074]
(1.9)抽提过程中，大的血凝块，尽量震荡成碎片，若实在无法震碎，建议舍弃血凝块(血凝块裂解不充分，也可能影响后续抽提的rna质量及得率)。
[0075]
(1.10)抽提过程中，加入异丙醇后的样本转至淡红色paxgene rna旋转柱时，如果1.5ml的微离心管中存在絮状物，建议吸出丢弃(絮状物容易堵塞淡红色paxgene rna旋转柱的膜)。如果絮状物量比较大，建议室温短时低速离心(离心力《200x g)。
[0076]
(1.11)抽提环境：rna抽提室的通风橱内完成rna抽提过程。除非特别说明，本实施例中所有的步骤，包括离心步骤，均应在室温(15-25℃)环境下进行。
[0077]
(2)全血rna抽提时所需试剂及材料
[0078]
(2.1)标签、马克笔、试验记录本及试验手册等；
[0079]
(2.2)10ul、100ul、200ul及1000ul的枪头等；
[0080]
(2.3)异丙醇；
[0081]
(2.4)96-100％乙醇；
[0082]
(2.5)paxgene rna旋转柱(淡红色及淡紫色2种)；
[0083]
(2.6)1.5ml微离心管；
[0084]
(2.7)2ml处理管；
[0085]
(2.8)缓冲液bm1、缓冲液bm2、缓冲液bm3、缓冲液bm4、缓冲液br5；
[0086]
(2.9)无rna酶的水(nuclease-free water)；
[0087]
(2.10)蛋白酶k；
[0088]
(2.11)无rna酶的dna酶试剂盒(内含无rna酶的dna酶i原液、缓冲液rdd及无rna酶的水三种试剂)；
[0089]
(2.12)hemogard管帽。
[0090]
(3)全血rna抽提步骤
[0091]
(3.1)将含有全血标本的paxgene blood rna收集管置于离心机内采用3000
–
5000x g的离心力室温离心10分钟。注意，含有全血标本的paxgene blood rna收集管离心前已在室温下孵育至少2小时。
[0092]
(3.2)缓慢倒出或采用移液枪移除paxgene blood rna收集管的整个上清液，只保留颗粒状的固体沉淀物。而后向固体颗粒物中加入4ml无rna酶的水，并使用全新的hemogard封闭帽重新盖上paxgene blood rna收集管。注意：移除上清液时，不要干扰固体颗粒物，并使用干净的实验纸巾擦干paxgene blood rna收集管的边缘。
[0093]
(3.3)旋涡paxgene blood rna收集管直至固体颗粒物完全溶解，并使用摆动转子在3000-5000x g的离心力下室温离心10分钟。采用移液枪移除paxgene blood rna收集管的整个上清液，并丢弃。注意：涡旋后离心前上清液中残留的小碎屑不会影响rna抽提的过程。
[0094]
(3.4)将350ul的缓冲液bm1加入到paxgene blood rna收集管，涡旋，直至固体颗粒物完全溶解。
[0095]
(3.5)将paxgene blood rna收集管中的样品移到1.5ml的微离心管中。加入300ul的缓冲液bm2和40ul的蛋白酶k，旋涡搅拌5秒，在55℃的摇床培养箱中以400-1400转/分的速度孵育10分钟。孵育后，将摇床培养箱的温度设置为65℃，以备第20步的使用。注意：在加入样品之前，不要将缓冲液bm2和蛋白酶k混合在一起，应单独按顺序加入到样本中。
[0096]
(3.6)将样品移到淡紫色的paxgene shredder旋转中，放置在2ml的处理管中，全速室温离心3分钟(注意离心力不要超过20000x g)。
[0097]
(3.7)小心地将整个上清液从paxgene shredder旋转柱转移到一个新的1.5ml微离心管中。注意不要干扰处理管中的颗粒。
[0098]
(3.8)向1.5ml微离心管中加入700ul的异丙醇(100％，纯度级p.a)，充分旋涡混合。
[0099]
(3.9)利用移液管吸取700ul样品放入淡红色的paxgene rna旋转柱中，置于2ml的处理管中。轻轻地盖上管帽，在8000-20000x g的离心力下室温离心1分钟。将旋转柱放入新的2ml处理管中，丢弃旧的处理管等。
[0100]
(3.10)使用移液枪将剩下的样品移至新的淡红色paxgene rna旋转柱中。轻轻地盖上管帽，并在8000-20000x g的离心力下室温离心1分钟。将旋转柱放入新的2ml处理管中，丢弃含有流动液的旧处理管。
[0101]
(3.11)采用移液枪将350ul的缓冲液bm3加入淡红色的paxgene rna旋转柱中。轻轻地盖上管帽，在8000
–
20000x g的离心力下室温离心15秒。将旋转柱放入新的2ml处理管中，并丢弃含有流动液的旧处理管。注意：缓冲液bm3是作为浓缩物提供的。确保在使用前向bm3缓冲器中添加适量96-100％乙醇。
[0102]
(3.12)将10μl dna酶i原液加入70μl缓冲液rdd中，置于1.5ml微离心管中。轻弹微离心管，轻轻搅拌，并短暂室温下离心，尽量避免dna酶i的损失。注意：dna酶i对物理变性特别敏感。混合dna酶i原液及缓冲液rdd时只能通过轻弹微离心管的方式进行，不可漩涡。
[0103]
(3.13)采用移液管将dna酶i孵育混合液(80μl)小心转移至paxgene rna旋转柱膜上，置于20-30℃培养基上孵育15分钟。注意：确保dna酶i孵育混合物直接置于paxgene rna旋转柱膜上。如果部分混合物被贴附在旋转柱的壁或o形环上，则可能造成dna无法完全消化分解。
[0104]
(3.14)采用移液枪将350ul缓冲液bm3加入paxgene rna旋转柱中。轻轻地盖上管帽，在8000-20000x g的离心力下室温离心15秒。将旋转柱放入新的2ml处理管中，丢弃含有
流动液的旧处理管。
[0105]
(3.15)采用移液枪将50ul缓冲液bm4加入paxgene rna旋转柱中。轻轻地盖上管帽，以8000-20000x g的离心力下室温离心15秒。丢弃液体。将旋转柱放置在新的2ml处理管中，并丢弃旧的处理管。注意：缓冲液bm4是作为浓缩物提供的。确保在使用前向bm4缓冲器中添加适量96-100％乙醇。
[0106]
(3.16)采用移液枪将500ul缓冲液bm4加入paxgene rna自旋柱中。轻轻地盖上管帽，在8000-20000x g的离心力下室温离心2分钟。注意：离心后，小心地将paxgene rna自旋柱从处理管中取出，使其不接触流通管。
[0107]
(3.17)丢弃含有流动液的处理管，将paxgene rna旋转柱放置在新的2ml处理管中，采用8000-20000x g的离心力室温离心1分钟。干燥旋转柱的膜至关重要，因为残留的乙醇可能会干扰下游的反应。
[0108]
(3.18)丢弃含有流动液的处理管。将paxgene rna旋转柱置于新的1.5ml微离心管中，将40μl缓冲液br5小心转移到旋转柱膜上。轻轻地盖上管帽，在8000
–
20000x g的离心力下室温离心1分钟，以洗脱rna。注意：务必要将缓冲液br5直接添加到旋转柱膜上，以润湿整个旋转柱膜，确保最大的洗脱效率。
[0109]
(3.19)重复上述洗脱步骤(即第18步，使用40μl缓冲液br5和相同体积的微离心管)。
[0110]
(3.20)洗脱物在不摇晃的65℃的摇床-培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，立即放在冰上冷藏。65℃环境下的孵育可使rna变性，便于下游应用。但，注意不要超过孵育时间或温度。
[0111]
(3.21)如果rna洗脱液不会立即使用，请保存在-20℃低温冰箱或-70℃的超低温冰箱。由于rna在冷冻和解冻后仍然变性，因此不需要在65℃环境下重复孵育。
[0112]
(4)全血rna质检
[0113]
本实施例采用agilent bioanalyzer 2100(agilent technologies，加利福尼亚州，美国)检测抽提的总rna完整性；采用3.0fluorometer(life technologies，加利福尼亚州，美国)和nanodrop one spectrophotometer(thermo fisher scientific inc，美国)检测抽提的总rna的浓度及纯度。rna质检报告内容包括rna浓度(ng/μl)、rna(ul)、rna总量(ug)、a260/280比值、a260/a230比值、rna完整性(rna with integrity number,rin)、28s/18s比值、电泳质量结论等。本实施例全血标本的rna电泳质控标准为rin值》6.5且28s/18s≥0.7；无真核或原核生物污染、无dna或蛋白质污染，无过多的5s rrna。
[0114]
1.2.5rna测序
[0115]
本实施例共采集到1183份全血rna，剔除rin值《6.5的rna样本后余1105份。本实施例将1ug rna置于illumina novaseq 6000平台(illumina，美国)，采用150bp双端模式实施rna-seq。每个样本平均产出13.4gb数据量，且82.3％样本的数据量≥15gb。数据质量控制q30》90％。样本比对到已知参考基因组(human grch38.102)的平均比对率为94.5％。
[0116]
(1)全血rna文库构建
[0117]
(1.1)rna样本与探针杂交：使用无rna酶的水将1ug总rna稀释至11ul，放置于冰上备用；将1ul rrna探针(h/m/r)、3ul探针缓冲液及11ul总rna放置于无rna酶的离心管中，配置成15ul的反应液，并将其充分混匀离心后放置于pcr仪中，执行探针杂交反应(如表1所
示)。
[0118]
(1.2)rna酶h(rnase h)消化：将15ul rna样本与探针杂交的产物、4ul rna酶h缓冲液及rna酶h放置于无rna酶的离心管中，配置成20ul的反应液，并将其充分混匀离心后放置于pcr仪中，执行探针杂交反应(如表1所示)。
[0119]
(1.3)dna酶i(dnase i消化)：将20ul rna酶h消化产物、29ul dna酶i缓冲液及dna酶i放置于无rna酶的离心管中，配置成50ul的反应液，并将其充分混匀离心后放置于pcr仪中，执行探针杂交反应(如表1所示)。
[0120]
表1探针杂交反应的温度
[0121][0122]
(1.4)纯化rna及rna片段化：
①
室温下平衡磁珠至少30分钟；
②
每个样本准备新鲜配置的80％乙醇溶液至少400μl；
③
每50μl的样本管中滴加涡旋后的磁珠110μl(2.2x)，采用移液器吸打10次；
④
冰上孵育样本15分钟后将其放置于磁力架上，溶液澄清后弃除上清；
⑤
样本管保持在磁力架上，滴加新鲜配置的80％乙醇溶液200μl，静置30秒后移除乙醇溶液；
⑥
重复步骤
⑤
一次；
⑦
室温环境下开盖干燥磁珠5至10分钟；
⑧
每个样本孔中滴加rna-seq片段化后的混合液9.8μl，采用移液器吸打6次；
⑨
室温孵育样本2分钟后，将其放置于磁力架上，待溶液澄清后吸取上清16μl到新的样本管中并放置于冰上，丢弃磁珠。
⑩
将样品管放置于pcr仪中，打开热盖，执行rna片段化反应(如表2所示)，片段化结束后立即执行双链cdna合成。
[0123]
(1.5)双链cdna合成：从-20℃冰箱取出actinomycin d(5mg/ml)，室温解冻后轻轻弹触并短暂离心使其滑至管底。使用新鲜无rna酶的水将其稀释至0.5mg/ml。从-20℃冰箱取出1st strand缓冲液，室温解冻后上下颠倒混匀，放置于pcr管中配制25ul第一链cdna合成反应液(16ul fragmented ribosomal-depleted rna、1ul actinomycin d[0.5mg/ml]、6ul 1st strand buffer及2ul 1st strand enzyme mix)。采用移液器吸打第一链cdna合成反应液10次，离心后放置于pcr仪中开始第一链cdna合成反应(如表2所示)。反应结束后即刻进入第二链cdna合成反应。从-20℃冰箱取出2nd strand marking缓冲液，室温解冻后上下颠倒混匀，放置于pcr管中配制50ul第二链cdna合成反应液(25ul 1st strand cdna、20ul 2nd strand marking缓冲液及5ul 2nd strand/end repair enzyme mix)。采用移液器吸打第二链cdna合成反应液10次，离心后放置于rcr仪中执行第二链cdna合成反应(如表2所示)。
[0124]
表2rna片段化反应及双链cdna合成反应的温度
[0125][0126]
(1.6)纯化cdna：
①
室温下平衡磁珠至少30min；
②
每个样本准备新鲜配置的80％乙醇溶液至少400μl；
③
每50μl的样本管中加入涡旋后的磁珠90μl(1.8x)，采用移液器吸打10次；
④
室温孵育样本10分钟后将其放置于磁力架上，溶液澄清后弃除上清；
⑤
样本管保持在磁力架上，加入新鲜配置的80％乙醇溶液200μl，静置30秒后移除乙醇溶液；
⑥
重复步骤
⑤
一次；
⑦
室温下开盖干燥磁珠约5至10分钟；
⑧
每个样本孔中加入20μl无rna酶的水，采用移液器吸打混匀；
⑨
室温孵育样本2分钟后将其放置于磁力架上，溶液澄清后吸取上清17.5μl到新的样本管中并放置于冰上，丢弃磁珠。
[0127]
(1.7)末端da-tailing反应：将10ul da-tailing buffer mix、2.5ul da-tailing enzyme mix及17.5ul cdna放置于pcr管中混匀配置成末端da-tailing反应液(30ul)；混匀后将反应管放置于rcr仪内执行末端da-tailing反应(如表3所示)。
[0128]
(1.8)接头连接：将30ul da-tailing产物、2.5ul ligation mix及2.5ul rnaadapter放置于pcr管中配置成35ul连接反应液；混匀后将反应管放置于rcr仪内执行接头连接反应(如表3所示)；结束后立即终止接头连接反应。
[0129]
表3末端da-tailing反应及接头连接反应的温度
[0130][0131]
(1.9)纯化连接产物和分选片段大小：
①
提前30分钟将vahts dna clean beads从2-8℃冰箱内取出，室温解冻后旋涡振荡使vahts dna clean beads彻底混匀后吸取40μl(1x)滴入至连接产物中，采用移液器吸打10次，室温下孵育10分钟，使cdna与磁珠结合；
②
将样品放置于磁力架上，待溶液澄清后移除上清78μl；
③
保持样品放置于磁力架上，滴入新鲜配制的80％乙醇200μl以漂洗磁珠，室温下孵育30秒后移除上清，并重复
②
步骤1次；
④
保持样品放置于磁力架上，室温环境下开盖干燥磁珠5分钟，而后将样品从磁力架上取出，滴入无rna酶的水102.5μl，采用移液器吸打使其充分混匀，室温下静置2分钟后再次将样本管放置于磁力架上，待溶液澄清后，打开管盖，吸取上清100μl至一个全新的无rna酶的pcr管中，旋涡振荡使vahts dna clean beads充分混匀后吸取60μl(0.6x)滴入到纯化过的连接产物中，采用移液器吸打10次；
⑤
室温环境下孵育10分钟，dna与磁珠结合，将样品放置于磁力架上，待溶液澄清后，保持样品放置于磁力架上，吸取上清155μl至一个全新的无rna酶的pcr管中，并加vahts dna clean beads约10μl(0.1x)，采用移液器吸打10次，室温下孵育10
分钟，使dna与磁珠结合，而后将样品放置于磁力架上，待溶液澄清后移除上清；
⑥
保持样品放置于磁力架上，加入新鲜配制的80％乙醇200μl漂洗磁珠，室温下孵育30秒后移除上清，重复步骤
⑥
—次；
⑦
保持样品放置于磁力架上，室温环境下干燥磁珠分钟；
⑧
将样品从磁力架上取出，加入无rna酶的水1.5ul，采用移液器吸打使其充分混匀，室温下静置2分钟后放置于磁力架上，待溶液澄清后吸取上清19μl至一个全新的无rna酶的pcr管中执行pcr反应。
[0132]
(1.10)文库扩増：将19ul纯化过的接头连接产物、5ul pcr primer mix、25ul amplification mix 1及1ul heat-labile udg置于pcr管，配制50ul pcr反应液。使用移液器吸打反应液10次，盖上管盖，低速离心，放置于pcr仪中执行扩増反应(如表4所示)。
[0133]
表4文库扩增的温度
[0134][0135]
(1.11)纯化pcr产物：
①
室温下平衡磁珠至少30分钟；
②
每个样本准备新鲜配置的80％乙醇溶液至少400μl；
③
每50μl的样本管中加入涡旋后的磁珠50μl，涡旋5秒后离心；
④
室温下孵育样本10分钟，放置于磁力架上，待溶液澄清后弃除上清；
⑤
样本管保持放置于磁力架上，加入新鲜配置的80％乙醇溶液200μl，静置30秒，移除乙醇溶液，并重复步骤
⑤
一次；
⑥
室温下开盖干燥磁珠约5至10分钟；
⑦
每个样本孔中滴入无rna酶的水27μl，涡旋5秒后离心；
⑧
室温孵育样本2分钟后放置于磁力架上，待溶液澄清后吸取上清25μl到新的样本管中并放置于冰上，丢弃磁珠。
[0136]
(1.12)评估文库质量：取1μl文库，使用3.0fluorometer检测构建浓度；使用agilent生物分析仪2100检测文库大小。合格的文库大小应处于300bp-600bp范围内，且无adapter-dimer。实验文库构建符合标准后，方可以进行后续上机测序。
[0137]
(2)全血rna测序：
[0138]
(2.1)簇(cluster)生成：基于cbot user guide指导手册内的规范化的操作流程，使用illumina novaseq 6000测序仪配套的cbot实施簇生成及第一向测序引物的杂交。
[0139]
(2.2)测序上机：基于illumina novaseq 6000user guide指导手册内的说明书，事先准备好测序所需的试剂，继而将携有簇的flow cell上机。选择150bp双末端(paired-end)程序，开展双端测序。illumina提供的data collection软件控制测序过程，并对测序结果数据实施实时分析。
[0140]
(2.3)测序数据：
①
原始测序数据：通常以fastq文件格式存储。高通量测序原始图像格式的数据经casava碱基识别转化为原始测序序列，即raw reads。每段序列被称为一个read，即读长。本实施例采用150bp模式下的双端测序。
②
测序结果质量评估：采用fastqc软件对每一个单独的fastq文件实施质量评估。测序质量通常采用q(quality)值予以评估。q＝-10*log10(p)，p表示碱基读取错误的概率。一条reads某位置读取错误的概率为0.001
logistics回归算法是一种压缩估计，其可通过构造惩罚函数，调整控制参数λ而使伸缩系数(shrinks coefficients)趋向于零并实现重要特征(对结局影响最为显著)的自动筛选。采用10-折交叉验证的方式调优模型，以最大限度地提高roc曲线下的面积。采用roc曲线下面积最大的回归模型计算测试集的wb-trs。
[0147]
1.4.2糖尿病全血转录组风险评分(t2d wb-trs)与非肥胖2型糖尿病及血糖代谢特征的关联
[0148]
采用多元logistic回归分析评估wb-trs与非肥胖2型糖尿病及血糖代谢稳态指标(胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能失调)的相关性。模型1：校正年龄、性别、bmi及糖尿病家族史；模型2：进一步校正腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇。采用比值比(odds ratio,or)及95％的置信区间(confidence interval,ci)表示wb-trs与非肥胖2型糖尿病及血糖代谢稳态指标的相关性。采用多元线性回归模型评估wb-trs与血糖代谢特征的相关性。模型1：校正年龄、性别、bmi及糖尿病家族史；模型2：进一步校正腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、甘油三脂及低密度脂蛋白胆固醇。采用回归系数β值及标准误(standard error,se)表示wb-trs与血糖代谢特征的相关性。采用限制性立方样条图(restricted cubic spline,rcs)评估wb-trs与血糖代谢特征潜在的非线性关系。模型校正年龄、性别、bmi、糖尿病家族史、腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动、收缩压、舒张压、甘油三脂及低密度脂蛋白胆固醇。采用roc曲线(receiver operator characteristic curves)评估与比较6种不同的模型对非肥胖2型糖尿病的预测能力。6种模型分别是：
①
传统模型(年龄、性别、bmi及糖尿病家族史)；
②
wb-trs模型；
③
空腹血糖+甘油三脂模型；
④
空腹血糖+甘油三脂+传统模型；
⑤
wb-trs+传统模型；
⑥
wb-trs+空腹血糖+甘油三脂+传统模型。
[0149]
1.4.3外部队列独立人群的验证
[0150]
为验证wb-trs对血糖代谢特征动态变化的预测价值，本实施例使用dpmh研究中3次重复测量的血液转录组数据及血糖代谢特征数据进行了深度分析。dpmh研究是一项平行化随机对照临床饮食干预试验，首次利用临床干预试验的手段比较不同地区起源的富含植物性膳食模式即“地中海膳食”和“传统江南膳食”在血糖代谢稳态调控及减重方面的效能。dpmh研究招募的253名超重或肥胖(bmi≥24.0kg/m2)、年龄介于25-60岁之间且空腹血糖略微偏高(≥5.6mmol/l)的研究对象被随机划分到3种能量限制相同(能量限制水平约为25％)但膳食模式不同的亚组，分别是传统江南膳食组(n＝85)，地中海膳食组(n＝84)，红肉和高精米摄入的对照膳食组(n＝84)。研究对象分别于基线、干预3个月(第2次随访)和干预6个月(第3次随访)时接受了4个时间点(0小时、0.5小时、1小时及2小时)的口服葡萄糖耐量试验、连续血糖监测(continuous glucose monitoring,cgm)、生化指标检测、人体测量学指标的检查等。dpmh研究同时收集了研究对象基线、干预3个月及干预6个月的空腹外周全血储存于paxgene blood rna收集管以供抽提外周血rna，开展血液转录组测序，且dpmh研究采用与发现队列相同的测序方案实施血液转录组测序。本实施例采用线性回归模型评估基线wb-trs对干预3个月和干预6个月时血糖代谢特征动态变化的影响；采用广义估计方程(generalized estimating equation model,gee)评估三次重复测量的wb-trs和血糖代谢特征之间的相关性。
[0151]
1.4.4生物学通路及基因富集分析(mitch和reactome pathway分析)
[0152]
为了获得wb-trs背后的生物学机制，本实施例展开mitch和reactome pathway等生物学通路及机制分析。本实施例将发现队列的1105名研究对象按照wb-trs三分位划分到三个不同的疾病风险亚组，分别比较wb-trs最低分位及最高分位与中间分位的基因表达水平，继而采用mitch和reactome通路分析开展基因富集分析，旨在发现关键基因或代谢通路。mitch分析是采用等级多因素方差分析(rank-manova)的方法寻找多重比较下具有协同或拮抗效应的基因集，输入文件是wb-trs最高三分位vs.中间分位及最低三分位vs.中间分位所有基因转录本(n＝54458)表达水平的变化值(log2 fold change)，输入基因集是分子特征数据库(molecular signatures database,msigdb)中的50个基因集h.all.v7.5.1.symbols.gmt。本实施例计算了富集分数(enrichment score,es)，其范围介于-1至1之间。reactome通路分析则以筛选出的144个基因转录本作为输入文件，寻找基因集的功能(https://reactome.org/pathwaybrowser/#tool＝at)。
[0153]
1.4.5全转录组学孟德尔随机化分析(twmr)
[0154]
本实施例在发现队列中采用twmr的策略初步探究wb-trs所纳入的144个基因转录本对2型糖尿病的因果效应；并利用东亚人群(asian genetic epidemiology network,agen)及欧洲人群(diabetes genetics replication and meta-analysis,diagram)的概括性的2型糖尿病gwass数据和qtlgen consortium的表达数量性状位点(expression quantitative trait loci,eqtls)数据验证基因转录本与2型糖尿病的因果关联。twmr研究中，本实施例将144个基因转录本作为暴露因素；2型糖尿病的gwas概括性数据作为结局；具有显著性(发现队列：p《1
×
10-3
；agen/diagram:p《5
×
10-8
)、效应等位基因频率》0.01且连锁不平衡性r2《0.01的eqtls作为工具变量(若结局和暴露因素间不存在共同的eqtls时，则使用连锁不平衡性r2》0.8的eqtls作为替代)。采用逆方差加权的方法、cochran’s q统计量及mr-egger intercept分别完成因果推断、异质性检验及多效性检验。
[0155]
本实施例采用专业的统计学分析软件sas(版本9.4，sas institute，cary，nc，usa)和r语言(版本3.5.1；r core team)完成数据的处理与分析。双侧p值《0.05被认为差异存在统计学意义。
[0156]
二、结果分析
[0157]
2.1研究人群临床特征
[0158]
本实施例发现队列纳入分析的1105名研究对象，平均年龄为64.5岁(标准差为7.0)，女性737名(占总人群的66.7％)，非肥胖2型糖尿病305例(占总人群的27.6％)，非肥胖新发2型糖尿病139例(占总人群的12.6％)，病程长于5年的非肥胖2型糖尿病158例(占总人群的14.3％)。训练集和测试集的临床特征无组间差异，表示人群随机抽样过程中引入的选择偏移较小(如表5所示)。
[0159]
表5研究人群的临床基本特征
[0160][0161]
表5中，连续性正态分布的变量应用均数
±
标准差的形式给予展示，连续性偏态分布的数据应用中位数(四分位间距)的形式给予展示，而分类变量则采用人数(构成比)的形式给予展示。采用单因素方差分析比较连续性变量的组间差异，采用卡方检验比较分类变量的组间差异，分别计算差异p值。缩写词：hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇；ldl-c，低密度脂蛋白胆固醇；ogtt，口服葡萄糖耐量试验；hba1c，糖化血红蛋白；homa-ir，胰岛素抵抗指数；homa-β，胰岛β细胞功能。
[0162]
2.2糖尿病全血转录组风险评分(t2d wb-trs)的特征分布
[0163]
本实施例于训练集中采用lasso logistic回归模型及10-折交叉验证的方式调整控制参数λ(0.006)以最大限度地提高roc曲线下的面积(图3)，最终筛选出144个对非肥胖2型糖尿病具有重要贡献的基因转录本。表6展示了wb-trs中144个基因转录本的权重，按照与糖尿病最为负相关到最为正相关排序。我们采用加权的方法计算wb-trs，wb-trs＝基因
转录本1的表达水平*基因转录本1的权重+基因转录本2的表达水平*基因转录本2的权重+
……
+基因转录本144的表达水平*基因转录本144的权重。wb-trs与年龄成正相关性(0.98,se 0.15,p《0.0001)；男性人群的wb-trs平均水平(-1.7,sd 1.5)略高于女性人群的wb-trs平均水平(-2.1,sd 1.3)；非肥胖2型糖尿病人群的wb-trs平均水平明显高于非肥胖健康对照人群wb-trs的平均水平(-0.6vs-2.6,p《0.0001)。图4展示了wb-trs分布的小提琴图以及与非肥胖2型糖尿病最为负相关(fuom)/最为正相关(rpf1)基因表达水平的小提琴图。
[0164]
表6wb-trs中144个基因转录本的权重
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169][0170]
表6中，数据展示了wb-trs中144个基因转录本的权重。权重按照与非肥胖2型糖尿病最为负相关到最为正相关排序。模型的截距是0.6748772。训练集中，以非肥胖2型糖尿病作为结局，采用lasso回归模型及10-折交叉验证的方式计算基因转录本的权重。缩略词：wb-trs，全血转录组风险评分。
[0171]
2.3糖尿病全血转录组风险评分(t2d wb-trs)与非肥胖2型糖尿病的相关性
[0172]
表7展示了测试集中wb-trs与非肥胖2型糖尿病的相关性。将wb-trs作为连续性变量分析wb-trs与非肥胖2型糖尿病的相关性，本实施例发现校正年龄、性别、bmi及糖尿病家族史等混杂因素后，wb-trs每增加1个单位，非肥胖2型糖尿病的风险增加了2.49倍，or值及95％ci为2.49(1.84-3.36)，p《0.0001；进一步校正生活方式(吸烟状态、饮酒状态、体力活动水平)、教育水平、腰围、收缩压、舒张压及脂质表达谱(甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、低度脂蛋白胆固醇、总胆固醇)等潜在混杂因素后，wb-trs与非肥胖2型糖尿病的相关性并未发生显著的改变，or值及95％ci为2.57(1.86-3.56)，p《0.0001。本实施例同时也评估了wb-trs与新发非肥胖2型糖尿病及病程长于5年的非肥胖2型糖尿病的相关性，发现充分校正混杂因素后wb-trs每增加1个单位，新发非肥胖2型糖尿病及病程长于5年的非肥胖2型糖尿病的风险分别增加了3.40倍和2.33倍，or值及95％ci分别为3.40(2.00-5.81)和2.33(1.56-3.48)，均p《0.0001。将wb-trs作为分类变量分析wb-trs三分位与非肥胖2型糖尿病的相关性，本实施例发现校正年龄、性别、bmi及糖尿病家族史等混杂因素后，wb-trs最高分位非肥胖2型糖尿病的风险相对于wb-trs最低分位增加了8.36倍，or值及95％ci为8.36(3.56-19.7)，p《0.0001；进一步校正生活方式(吸烟状态、饮酒状态、体力活动水平)、教育水平、腰围、收缩压、舒张压及脂质表达谱(甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、低度脂蛋白胆固醇、总胆固醇)等潜在混杂因素后，wb-trs最高分位与非肥胖2型糖尿病的相关性并未发生显著的改变，or值及95％ci为8.68(3.51-21.5)，p《0.0001。本实施例同时也评估了wb-trs三分位与新发非肥胖2型糖尿病及病程长于5年的非肥胖2型糖尿病的相关性，发现充分
校正混杂因素后wb-trs最高分位新发非肥胖2型糖尿病及病程长于5年的非肥胖2型糖尿病的风险相对于wb-trs最低分位增加了20.6倍和6.12倍，or值及95％ci分别为20.6(3.94-108)和6.12(2.00-18.7)，均p≤0.002。
[0173]
表7训练集中wb-trs与非肥胖2型糖尿病的相关性
[0174][0175]
表7中，数据以比值比和95％置信区间的形式展示。采用多因素logistic模型计算比值比和95％置信区间。模型1：校正年龄、性别、体质量指数及糖尿病家族史；模型2：进一步校正腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇。
[0176]
图5展示了总人群中按照年龄、性别分层分析wb-trs与非肥胖2型糖尿病的相关性。本实施例发现充分校正混杂因素后wb-trs与非肥胖2型糖尿病、新发非肥胖2型糖尿病及病程长于5年的非肥胖2型糖尿病的相关性在年龄《65岁及女性人群中更显著，且性别与wb-trs交互作用于非肥胖2型糖尿病(p＝0.051)。
[0177]
表8展示了总人群中按照wb-trs三分位分组比较不同亚组的临床特征。本实施例发现随着wb-trs水平的增高，年龄、腰围、收缩压、甘油三酯、空腹血糖、餐后2小时血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白及homa-ir水平呈现逐步增加的趋势；胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能失调及非肥胖2型糖尿病的比例逐步呈现增加的趋势；而女性人群的比重、高密度脂蛋白胆固醇及homa-β水平呈现逐步下降的趋势。
[0178]
表8总人群中按照wb-trs三份位分组比较不同人群的临床特征
[0179][0180]
表8中，连续性正态分布的变量应用均数
±
标准差的形式给予展示，连续性偏态分布的数据应用中位数(四分位间距)的形式给予展示，而分类变量则采用人数(构成比)的形式给予展示。采用单因素方差分析比较连续性变量的组间趋势，采用卡方检验比较分类变量的组间趋势，分别计算差异p值。缩写词：hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇；ldl-c，低密度脂蛋白胆固醇；ogtt，口服葡萄糖耐量试验；hba1c，糖化血红蛋白；homa-ir，胰岛素抵抗指数；homa-β，胰岛β细胞功能。
[0181]
2.4糖尿病全血转录组风险评分(t2d wb-trs)与血糖代谢特征的相关性
[0182]
表9展示了总人群、训练集及测试集中wb-trs与血糖代谢特征的相关性。充分校正年龄、性别、bmi、腰围、糖尿病家族史、生活方式、教育水平、血压水平及血脂水平等潜在的混杂因素后wb-trs与空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白及homa-ir呈现显著的正相关性；而与homa-β呈现显著的负相关性。总人群中，将homa-ir及homa-β转换为分类变量，进一步分析其与wb-trs的相关性，发现wb-trs最高分位相较于wb-trs最低分位其胰岛素抵抗及胰岛细胞功能失调的风险分别增加了2.62倍及3.52倍，or值及95％ci分别为2.62(1.51-4.55)及3.52(2.32-5.36)，均p《0.0001(图6)。
[0183]
本实施例采用限制性立方样条图评估了wb-trs与血糖代谢特征的潜在非线性关系(图7)。发现充分校正年龄、性别、bmi、腰围、糖尿病家族史、生活方式、教育水平、血压水平及血脂水平等潜在的混杂因素后wb-trs与空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白呈现j型相关性，p for non-linear≤0.0004。
[0184]
表9wb-trs每增加1个单位与血糖代谢特征的相关性分析
[0185][0186][0187]
表9中，数据以回归系数(β)及标准误(se)的形式予以展示。采用线性回归模型评估wb-trs与心血管代谢特征的相关性，暴露是wb-trs，结局是心血管代谢特征。模型1：校正年龄、性别、体质量指数及糖尿病家族史。模型2：进一步腰围、吸烟状态、饮酒状态、体力活
动水平、教育水平、收缩压、舒张压、甘油三脂及低密度脂蛋白胆固醇。缩略词：hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇；ldl-c，低密度脂蛋白胆固醇；ogtt，口服葡萄糖耐量试验；hba1c，糖化血红蛋白；tyg index，tyg指数；homa-ir，胰岛素抵抗指数；homa-β，胰岛β细胞功能。
[0188]
2.5糖尿病全血转录组风险评分(t2d wb-trs)与血糖代谢特征相关性的外部验证
[0189]
本实施例利用具有3次重复测量全血转录组数据及血糖代谢特征数据的外部队列dpmh研究验证wb-trs与血糖代谢特征的相关性。利用gee模型评估wb-trs与血糖代谢特征的相关性(表10)。发现在饮食干预6个月的临床试验中，充分校正年龄、性别、bmi、腰围、生活方式、教育水平、血压水平及血脂水平等潜在的混杂因素后wb-trs每增加1个单位，空腹血糖及餐后2小时血糖分别增加0.11mmol/l(se为0.05)和0.15mmol/l(se为0.02)。采用线性回归模型评估了基线wb-trs与血糖代谢特征动态变化的相关性(表11)。发现在饮食干预6个月的临床试验中，充分校正年龄、性别、bmi、腰围、生活方式、教育水平、血压水平及血脂水平等潜在的混杂因素后，基线wb-trs与饮食干预6个月后日间平均血糖变化、夜间平均血糖变化、24小时血糖变化、日间血糖曲线下的面积变化、24小时血糖曲线下的面积变化、日间血糖估算的糖化血红蛋白变化、夜间血糖估算糖化血红蛋白变化及24小时血糖估算的糖化血红蛋白变化密切相关。基线wb-trs每增加1个单位，日间平均血糖、夜间平均血糖、24小时血糖、日间血糖曲线下的面积、24小时血糖曲线下的面积、日间血糖估算的糖化血红蛋白、夜间血糖估算糖化血红蛋白及24小时血糖估算的糖化血红蛋白分别变化1.55mmol/l(se为0.60)、1.09mmol/l(se为0.48)、1.42mmol/l(se为0.55)、1.56mmol*h/l(se为0.60)、1.41mmol*h/l(se为0.55)、0.06(0.02)、0.04(0.02)及0.05(0.02)。
[0190]
表10外部队列中采用gee模型评估3次重复测量全血转录组评分(wb-trs)与3次重复测量血糖代谢特征的相关性
[0191][0192][0193]
表10中，数据采用变化值(β)和标准误(se)的形式予以展示。外部队列中，采用广
义线性评估方程(gee模型)评估wb-trs每变化1个单位与心血管代谢特征的相关性。广义评估方程中，暴露是3次重复测量的wb-trs，结局是3次重复测量的心血管代谢特征。模型1：校正年龄、性别及bmi；模型2：校正年龄、性别、bmi、腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇。所有的协变量(除教育水平外)随时间变化而改变。估算的hba1c＝(平均血糖水平+46.7)/28.7.缩略词：ogtt，口服葡萄糖耐量试验；auc，roc曲线下的面积；hba1c，糖化血红蛋白；wb-tr，全血转录组风险评分。
[0194]
表11 6个月饮食干预实验中基线wb-trs对血糖代谢特征变化的影响
[0195][0196][0197]
表11中，数据采用变化值(β)和标准误(se)的形式予以展示。外部队列中，采用广义评估方程(gee模型)评估基线wb-trs与血糖代谢特征动态变化的相关性。模型校正基线年龄、性别、体质量指数、腰围、吸烟状态、饮酒状态、教育水平、体力活动水平、收缩压、舒张压、甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇。心血管代谢特征的变化＝随访时心血代谢特征水平-基线时心血管代谢特征水平。估算的hba1c＝(平均血糖水平+46.7)/28.7。缩略词：ogtt，口服葡萄糖耐量试验；auc，roc曲线下的面积；hba1c，糖化血红蛋白；wb-trs，全血转录组风险评分。
[0198]
2.6糖尿病全血转录组风险评分(t2d wb-trs)对非肥胖2型糖尿病的预测价值
[0199]
图8展示了总人群及测试集中wb-trs对非肥胖2型糖尿病的预测价值。发现wb-trs能够很好的预测非肥胖2型糖尿病；wb-trs加入到含有空腹血糖、甘油三酯及传统危险因素(年龄、性别、bmi及糖尿病家族史)的模型中，wb-trs依然能够很好的预测非肥胖2型糖尿病。
[0200]
总人群中，单独的wb-trs模型预测非肥胖2型糖尿病的roc曲线下的面积为0.89(0.87-0.91)远远高于传统危险因素模型0.65(0.61-0.68)、仅含有空腹血糖和甘油三脂的
模型0.82(0.79-0.95)以及含有空腹血糖、甘油三脂及传统危险因素的模型0.84(0.81-0.87)；将wb-trs加入到传统危险因素模型中其预测非肥胖2型糖尿病的能力亦显著提高，roc曲线下的面积为0.89(0.87-0.91)；将wb-trs加入到含有空腹血糖、甘油三酯及传统危险因素的模型中其对非肥胖2型糖尿病的预测价值明显优于传统危险因素模型、单独的wb-trs模型、含有空腹血糖及甘油三酯的模型、含有空腹血糖、甘油三酯和传统危险因素的模型以及含有wb-trs及传统危险因素的模型，其roc曲线下的面积为0.93(0.91-0.95)(表12)。
[0201]
表12预测非肥胖2型糖尿病的roc曲线
[0202][0203][0204]
表12中，传统模型包含年龄、性别、体质量指数及糖尿病家族史。缩略词：wb-trs，全血转录组风险评分；bmi，体质量指数；fbg，空腹血糖；tg，甘油三酯；auc，roc曲线下的面积。
[0205]
2.7生物学通路及基因富集分析(mitch和reactome pathway分析)
[0206]
总人群中，将基因表达水平》1cpm且在99％以上的非肥胖2型糖尿病或非肥胖健康对照人群中表达的基因作为输入文件，采用mitch分析比较了wb-trs最低分位vs中间分位及最高分位vs中间分位的基因表达水平差异(图9)。观察到wb-trs最高分位展现出myc target v2信号通路的下调；而wb-trs最低分位展现出氧化磷酸化、mtorc1信号、胆固醇代
谢、过氧化物酶体及脂肪酸代谢等信号通路的上调(图9a)。将显著的代谢信号通路及mtorc1信号通路展示在图9b。观察到编码小分析gtp酶的基因(rab1a)富集在mtorc1信号通路，脂肪酸氧化相关基因(cpta1)富集在氧化磷酸化信号通路，胆固醇流出相关基因(abca1)富集在胆固醇代谢信号通路。
[0207]
总人群中，将wb-trs所纳入的144个基因转录本作为输入文件开展reactome pathway信号通路分析(表13)，发现wb-trs参与nr1h2(lxrβ)和nr1h3(lxrα)调控基因表达以限制胆固醇摄取的信号通路、ppar alpha调节的脂质代谢信号通路等，且胆固醇摄取抑制相关基因(mylip)富集在lxrβ和lxrα调控基因表达以限制胆固醇摄取的信号通路。
[0208]
2.8全转录组学孟德尔随机化研究(twmr)
[0209]
本实施例利用发现队列的非肥胖2型糖尿病gwas和cis_eqtl数据开展twmr研究旨在深入评估wb-trs所纳入的144个基因转录本与非肥胖2型糖尿病风险的因果关联(表14)。因发现队列中存在88个基因转录本不具备显著的eqtl数据而从twmr研究中剔除。发现在剩余的56个基因转录本中有14个基因转录本(ac004233.2、mier1、fuom、cpt1a、aldh6a1、riok3、rnf41、msrb2、pelp1、fkbp4、znf639、rin1、rab1a和itga1)与2型糖尿病风险存在因果关联(p《0.05)。继而采用eqtlgen consortium的eqtl数据和diagram/agen的2型糖尿病gwas数据验证发现队列中wb-trs所纳入的144个基因转录本与2型糖尿病风险的因果关系(表15)。因agne/diagram中存在19个基因转录本不具备稳健的工具变量而从twmr研究中剔除。发现在剩余的125个基因转录本中有6个基因转录本(gcc1-pax4、akr1a1、aamp、rab1a、itga1和znf639)与agen中的2型糖尿病风险存在显著的因果关联且有1个基因转录本(rab1a)成功在diagram中验证(p《0.0004＝0.05/125，注意125是twmr研究中对应的基因转录本的数目)。值得注意的是，基因转录本rab1a使得发现队列中非肥胖2型糖尿病风险增加12％(or:1.12,95％ci:1.004-1.24,p＝0.04)，agen中的2型糖尿病风险增加38％(or:1.38,95％ ci:1.18-1.62,p＝8.02e-05)和diagram中的2型糖尿病风险增加47％(or:1.47,95％ ci:1.21-1.77,p＝5.43e-05)。基因转录本gcc1-pax4使agen中的2型糖尿病风险降低17％(or:0.83,95％ ci:0.80-0.88,p＝5.23e-15)；但与发现队列和diagram中的2型糖尿病风险不存在因果关联。
[0210]
表13wb-trs中top30 reactome通路及相关基因
[0211][0212][0213]
表14全转录组孟德尔随机化研究展示了总人群中wb-trs所纳入的基因转录本与非肥胖2型糖尿病的因果效应
[0214]
[0215][0216]
表14中，数据采用比值比及95％置信区间的形式予以表示。采用全转录组孟德尔随机化研究评估全血转录组风险评分所纳入的基因转录本与2型糖尿病的因果效应。
[0217]
表15全转录组孟德尔随机化研究展示了外部验证队列中wb-trs所纳入的基因转录本与2型糖尿病的因果效应
[0218]
[0219]
[0220]
[0221][0222]
表15中，数据采用比值比及95％置信区间的形式予以表示。采用全转录组孟德尔随机化研究评估全血转录组风险评分所纳入的基因转录本与2型糖尿病的因果效应。
[0223]
本发明基于长期随访的纵向社区队列于长达十年bmi维持在正常范围内的中老年人群中开发了一个非肥胖2型糖尿病的wb-trs。观察性队列中，wb-trs与非肥胖2型糖尿病风险呈现显著的正相关性且能够反映空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白等血糖代谢特征的动态变化。6个月饮食干预临床试验中，基线wb-trs与年轻超重/肥胖人群连续血糖监测中的血糖代谢变化密切相关。wb-trs在预测非肥胖2型糖尿病方面的表现较佳，可作为空腹血糖、甘油三酯和其他临床预测指标的补充指标。mitch分析则表明wb-trs可能通过氧
化磷酸化通路、mtorc1信号通路和胆固醇代谢通路等参与非肥胖2型糖尿病风险。twmr研究则提示rab1a基因、gcc1基因等与2型糖尿病风险存在因果关联。本发明的研究结果提示特定的靶基因可能通过特定的生物学过程而参与非肥胖2型糖尿病及血糖代谢障碍的病因学。
[0224]
本发明首次通过外周血转录标志物评估wb-trs对非肥胖2型糖尿病风险和血糖代谢特征动态变化的影响。本发明的研究结论与既往研究保持高度一致，表明转录变异是参与调节基因型与复杂表型之间关联的可靠中介因素。最近，一些研究亦提出了trs或多基因trs的概念，其使用累积的基因表达信息提供额外的生物学解释性，在预测克罗恩病、慢性阻塞性肺疾病和肺功能方面优于传统风险因素和多基因风险评分。本发明的研究结果为血液转录组信息可用于非肥胖2型糖尿病风险和血糖代谢特征动态变化的预测方面提供了证据。
[0225]
本发明的研究中wb-trs可以很好地预测超重/肥胖受试者在6个月25％卡路里限制饮食干预后血糖代谢标志物的动态变化。本发明的饮食干预试验dpmh研究中，25％的卡路里限制产生了明显的体重减轻和血糖稳态改善。热量限制可改善心血管代谢风险，包括致动脉粥样硬化性血脂异常(甘油三酯和空腹血糖升高，高密度脂蛋白胆固醇降低，糖尿病，高血压和腰围增粗)。综合评估长期减少能量摄入影响的研究(comprehensive assessment of long-term effects of reducing intake of energy,calerietm)是一项为期24个月、多中心、随机对照的卡路里限制试验，其先前的研究结果显示，体重正常或偏重的中青年人群中，两年12％的热量限制可显著改善传统心血管代谢危险因素，即使这些危险因素处于正常范围内。最近研究表明，在非肥胖的健康成年人中，12％的卡路里限制有助于减少炎症和支链氨基酸并将脂蛋白从致动脉粥样硬化过程转移到胆固醇运输过程。本发明的wb-trs中所纳入的基因转录本和代谢通路在卡路里限制饮食干预应答的心血管代谢获益方面发挥了关键作用，这可能有助于探索能量限制有益作用的潜在机制。
[0226]
本发明的研究结果表明某些潜在的基因或代谢通路可能参与了非肥胖2型糖尿病的病因过程，提示血液转录组学信息能够反映疾病风险，并充分填补外周血基因表达如何影响非肥胖2型糖尿病的知识缺口。本发明发现mtorc1直接参与调节胰岛β细胞功能的成熟和分泌能力的维护。值得注意的是，基因twmr研究，富集在mtorc1信号通路上编码小分子gtp酶的基因转录本rab1a与中国人群、东亚人群及欧洲人群的2型糖尿病均存在显著的因果相关性；且2型糖尿病易感基因(gcc1-pax4)与东亚人群的2型糖尿病亦存在显著因果关系；pax4在日本青少年成熟型糖尿病病例中被发现，与gcc1相距仅30kb，鉴于其参与胰岛β细胞发育，pax4被认为为是2型糖尿病的杰出候选基因。人群中非肥胖2型糖尿病的分子发病机制与亚裔印度人非肥胖年轻糖尿病具有较低的遗传因素决定的β细胞功能是一致的。还发现氧化磷酸化及胆固醇代谢通路可能与非肥胖2型糖尿病发病密切相关。富集到氧化磷酸化代谢通路的脂肪酸氧化相关基因cpta1可能通过介导线粒体过载导致肌肉中的胰岛素抵抗；肝脏中的脂质积累和胰腺β细胞的脂毒性而参与血糖代谢调节。富集到胆固醇代谢通路的胆固醇外流相关基因abca1表达下调则会抑制胆固醇向高密度脂蛋白胆固醇的运输及抑制胆固醇向胆汁和粪便排泄，进而增加机体内脂质表达谱的含量和恶化心血管代谢特征。
[0227]
本发明开发了一种全血转录组风险评分(wb-trs)，其与非肥胖2型糖尿病风险呈
现显著的正相关性，并可预测血糖代谢特征的动态变化。生物信息学分析提示wb-trs可能涉及重要的生物功能途径如氧化磷酸化代谢通路、mtorc1信号通路和胆固醇代谢通路等而参与非肥胖2型糖尿病的病理生理学机制。twmr研究提示基因转录本rab1a和gcc-pax4可能是2型糖尿病的潜在致病基因。本发明的血液转录组学变化可反映血糖代谢特征的动态变化且与血糖代谢障碍高度相关，有助于洞察非肥胖2型糖尿病发病机制中潜在的致病基因和生物学机制。
[0228]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.全血转录组信息在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于对疾病风险和代谢异常进行预测，所述全血转录组信息包括全血转录组风险评分(wb-trs)，所述疾病为2型糖尿病(t2d)，所述全血转录组风险评分方法包括：将既往10年bmi保持在正常范围内且具有血液转录组测序数据的2型糖尿病及对照人群按照75％及25％的比例随机分配到训练集和测试集；利用统计学分析软件r语言中的edege包筛选出基因表达水平>1cpm且在99％以上的非肥胖2型糖尿病人群或非肥胖监控对照人群表达的转录本；筛选出基因表达水平在非肥胖2型糖尿病人群和非肥胖健康对照人群中存在显著差异(p<0.01)且属于蛋白编码基因或incrna的转录本，作为输入文件实施特征转录本筛选及wb-trs构建；在训练集中采用lasso logistic回归模型及10-折交叉验证的方式构建非肥胖2型糖尿病wb-trs(t2d wb-trs)，最终筛选出144个对非肥胖2型糖尿病具有重要贡献的基因转录本；在训练集、测试集及外部独立验证队列dpmh研究(dietary pattern and metabolic healthstudy)中评估及验证wb-trs的效能；采用mitch分析及reactome pathway分析开展基因的功能富集分析，以发现非肥胖2型糖尿病的关键致病基因及关键代谢通路；采用两样本全转录组学孟德尔随机化研究(twmr)的策略统筹基因组-转录组数据，评估wb-trs所纳入的144个基因转录本与2型糖尿病风险的因果关联。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在训练集中采用lasso logistic回归模型及10-折交叉验证的方式调整控制参数λ(0.006)以最大限度地提高roc曲线下的面积，最终筛选出144个对非肥胖2型糖尿病具有重要贡献的基因转录本，并计算这144个基因转录本的权重，将筛选出的144个基因采用加权的方法计算wb-trs，wb-trs＝基因转录本1的表达水平*基因转录本1的权重+基因转录本2的表达水平*基因转录本2的权重+
……
+基因转录本144的表达水平*基因转录本144的权重。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将wb-trs中144个基因转录本的权重按照与糖尿病最为负相关到最为正相关进行排序，得到wb-trs与非肥胖2型糖尿病最为负相关的基因为fuom，最为正相关的基因为rpf1。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在训练集、测试集及外部独立验证队列dpmh研究(dietary pattern and metabolic health study)中评估及验证wb-trs的效能，包括：(1)t2d wb-trs与非肥胖2型糖尿病的相关性；(2)t2d wb-trs与血糖代谢特征的相关性；(3)t2d wb-trs与血糖代谢特征相关性的外部验证；(4)t2d wb-trs与非肥胖2型糖尿病的预测价值。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，总人群中，将基因表达水平>1cpm且在99％以上的非肥胖2型糖尿病或非肥胖健康对照人群中表达的基因作为输入文件，采用mitch分析比较了wb-trs最低分位vs中间分位及最高分位vs中间分位的基因表达水平差异，获得：(1)wb-trs最高分位展现出myc target v2信号通路的下调，而wb-trs最低分位展现出
氧化磷酸化、mtorc1信号、胆固醇代谢、过氧化物酶体及脂肪酸代谢等信号通路的上调；(2)编码小分子gtp酶的基因转录本rab1a富集在mtorc1信号通路，脂肪酸氧化相关基因转录本cpta1富集在氧化磷酸化信号通路，胆固醇流出相关基因转录本abca1富集在胆固醇代谢信号通路；(3)总人群中，将wb-trs所纳入的144个基因转录本作为输入文件开展reactome pathway信号通路分析，发现wb-trs参与nr1h2(lxrβ)和nr1h3(lxrα)调控基因表达以限制胆固醇摄取的信号通路、ppar alpha调节的脂质代谢信号通路，且胆固醇摄取抑制相关基因mylip富集在lxrβ和lxrα调控基因表达以限制胆固醇摄取的信号通路。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用训练集和测试集的非肥胖2型糖尿病gwas和cis_eqtl数据进行全转录组学孟德尔随机化研究(twmr)，以评估wb-trs所纳入的144个基因转录本与非肥胖2型糖尿病风险的因果关联，获得：(1)发现队列中存在88个基因转录本中有88个基因转录本不具备显著的eqtl数据而从twmr研究中剔除；(2)在剩余的56个基因转录本中有14个基因转录本(ac004233.2、mier1、fuom、cpt1a、aldh6a1、riok3、rnf41、msrb2、pelp1、fkbp4、znf639、rin1、rab1a和itga1)与2型糖尿病风险存在因果关联(p<0.05)；采用eqtlgen consortium的eqtl数据和diagram/agen的2型糖尿病gwas数据验证发现队列中wb-trs所纳入的144个基因转录本与2型糖尿病风险的因果关系，获得：(1)因diagram/agen中存在19个基因转录本不具备稳健的工具变量而从twmr研究中剔除；(2)在剩余的125个基因转录本中有6个基因转录本(gcc1-pax4、aamp、rab1a、itga1和znf639)与agen中的2型糖尿病风险存在显著的因果关联，且有1个基因转录本rab1a成功在diagram中验证(p<0.0004)；(3)基因转录本rab1a使得发现队列中非肥胖2型糖尿病风险增加12％，agen中的2型糖尿病风险增加38％和diagram中的2型糖尿病风险增加47％；(4)基因转录本gcc1-pax4使agen中的2型糖尿病风险降低17％，但与发现队列和diagram中的2型糖尿病风险不存在因果关联。7.一种用于预测非肥胖2型糖尿病风险和血糖代谢异常的全血转录标志物，其特征在于，所述全血转录标志物为通过twmr研究获得的基因转录本rab1a和gcc-pax4。

技术总结
本发明属于糖尿病风险预测技术领域，具体涉及一种全血转录组信息在制备试剂盒中的应用以及用于预测非肥胖2型糖尿病风险和血糖代谢异常的全血转录标志物，所述全血转录标志物为通过TWMR研究获得的基因转录本RAB1A和GCC-PAX4。PAX4。PAX4。


技术研发人员：徐敏 毕宇芳 王计秋 赵志云 侯亚楠 徐瑜 陆洁莉 王卫庆 宁光
受保护的技术使用者：上海市内分泌代谢病研究所
技术研发日：2023.07.20
技术公布日：2023/10/11