一种从普洱茶中提取的细胞壁多糖及其提取方法和应用

1.本发明涉及一种从普洱茶中提取的细胞壁多糖及其提取方法和应用，涉及茶叶多糖技术领域。


背景技术：

2.多糖是一种广泛存在于动物、高等植物以及微生物中的天然高分子复合物，是构成生命的重要物质之一。自从20世纪50年代人们发现真菌多糖具有抗癌效果以来，科学界对多糖展开了深入的研究，包括分离提取、理化性质、生物学活性、分子结构等方面。研究表明，多糖不仅是构成细胞的重要物质，许多多糖还有良好的生物活性功能，包括免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、调节肠道菌群等。茶多糖(tea polysaccharides，tps)是植物多糖中的一大类，是茶叶中一种非常重要的大分子活性物质，在自然状态下，茶多糖主要以糖缀合物的形式存在，即各种不同的单糖聚合后，又与蛋白质、核酸、糖醛酸、无机元素等相结合形成大型的复合物质，茶多糖与广义的多糖一样也均被证实具有抗氧化、增强免疫、降血糖、抗癌抗菌等生物活性。
3.果胶主要存在于植物的初生细胞壁和细胞之间，是细胞壁的基质多糖，从结构角度看，果胶包括两种酸性多糖：聚半乳糖醛酸和聚鼠李半乳糖醛酸，每种多糖随植物来源、组织和发展阶段的不同，其侧链中残基的数目、种类、连接方式以及其他取代基存在的情况都有相当大的变化。
4.普洱茶作为茶叶中的一种，具有抗氧化、抗突变、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降胆固醇、防肥胖、降血糖和抗过敏的作用，经研究表明，普洱茶的细胞壁中含有多种具有免疫活性的酸性多糖，常规水提过程很难提取细胞壁中被纤维素束缚的果胶，因此这部分水提残渣通常被用做肥料或动物饲料，没有实现其价值，因此，如何提取普洱茶细胞壁间的酸性多糖受到了本领域的广泛关注。


技术实现要素：

5.本发明提供一种从普洱茶中提取细胞壁多糖的提取方法，用于提取普洱茶细胞壁间的酸性多糖。
6.本发明还提供上述从普洱茶中提取得到的细胞壁多糖及其在提高免疫活性方面的应用。
7.本发明第一方面提供一种从普洱茶中提取细胞壁多糖的方法，包括如下步骤：
8.步骤1、将普洱茶粉碎得到普洱茶干粉；
9.步骤2、将所述普洱茶干粉依次与水和醇溶液混合，以去除所述普洱茶干粉中的水溶性多糖和蛋白质，过滤并收集得到第一滤渣；
10.步骤3、将所述第一滤渣与淀粉酶混合，以去除所述第一滤渣中的淀粉，过滤并收集得到第二滤渣；
11.步骤4、在ph为6～7的条件下，将所述第二滤渣与乙二胺四乙酸溶液混合，混合过
程中辅以超声处理，以改变普洱茶细胞中细胞壁的交联结构，过滤收集得到第三滤渣和第一滤液；
12.步骤5、将所述第三滤渣与碱性溶液混合，混合过程中辅以超声处理，过滤收集得到第四滤渣和第二滤液；
13.步骤6、将所述第一滤液和第二滤液混合并进行透析，收集透过液并冷冻干燥后得到所述细胞壁多糖。
14.进一步地，步骤2具体包括如下步骤：
15.步骤2.1、在36-37℃下，将所述普洱茶干粉与蒸馏水混合1-1.5小时，过滤并收集得到水提滤渣；
16.步骤2.2、将所述水提滤渣与70％的乙醇溶液混合12-16小时，过滤并收集醇提滤渣；
17.步骤2.3、使用无水乙醇对所述醇提滤渣进行洗涤、干燥，得到第一滤渣。
18.进一步地，步骤3具体包括如下步骤：
19.将淀粉酶溶解在tris-马来酸缓冲液中，将步骤2得到的第一滤渣与溶解有所述淀粉酶的tris-马来酸缓冲液混合，在37-40℃下反应2～4h，反应结束后，过滤并收集得到第二滤渣。
20.进一步地，所述第二滤渣与所述乙二胺四乙酸溶液的质量比为1：(20-25)。
21.进一步地，所述第二滤渣与所述乙二胺四乙酸溶液的混合时间为10-14小时，混合期间每隔1小时置于超声水浴中超声30-40min。
22.进一步地，所述第三滤渣与所述碱性溶液的质量比为1：(30-35)。
23.进一步地，所述第三滤渣与所述碱性溶液的混合时间为10-14小时，混合期间每隔1小时置于超声水浴中超声30分钟。
24.进一步地，步骤6具体包括如下步骤：
25.步骤6.1、将第一滤液和第二滤液使用透析膜进行透析44-48小时，透析膜的分子量为8000kda，收集透过液；
26.步骤6.2、在-20℃～-35℃下，将透过液冻结2～6h，随后将冷冻后的透过液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为-40℃
±
2℃，真空度为-30kpa～-60kpa，得到细胞壁多糖。
27.本发明第二方面提供上述任一所述的提取方法制备得到的细胞壁多糖。
28.本发明第三方面提供上述细胞壁多糖在制备具有免疫活性的食品、保健品、药物中的应用。
29.本发明提供的方法首先除去了水溶性多糖和蛋白质等大分子物质，提高了酸性多糖的纯度，避免了复杂的纯化过程；其次，以一定量的淀粉酶对非水溶性残渣进行进一步处理，以去除淀粉，有效避免了淀粉在多糖萃取中的干扰，保证了活性多糖的纯度；接着，采用乙二胺四乙酸联合碱溶液以提取酸性多糖，乙二胺四乙酸溶液可以螯合细胞壁结构中的金属离子，改变细胞壁交联结构，在不破坏多糖原有结构的同时，提取细胞壁中的活性多糖，碱溶液(koh)可以有效地破坏异木聚糖和纤维素微纤维之间的h键。
30.经测试发现，本发明提供的方法提取到的细胞壁多糖具有免疫调节作用，与传统方法提取的多糖相比活性更高；最后，本发明使用冷冻干燥的技术，将液体多糖浓缩成固体，增加了多糖的稳定性，便于储存和运输，以及添加到各种剂型中，使实际应用更加方便。
综上，本发明提供的方法对普洱茶细胞壁中的细胞壁多糖进行开发和利用，有助于提高产业附加价值，拓宽产品种类，具有较高的应用前景和潜在的价值。
附图说明
31.图1为实施例1和对比例1-4提取的茶多糖对raw264.7细胞释放的g-csf因子的影响；
32.图2为实施例1和对比例1-4提取的茶多糖对raw264.7细胞释放的il-1α因子的影响；
33.图3为实施例1和对比例1-4提取的茶多糖对raw264.7细胞释放的no的影响。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1
36.本实施例提供一种从普洱茶中提取细胞壁多糖的方法，包括如下步骤：
37.步骤1、普洱茶茶叶预处理：将普洱茶发酵前、中、后三个时期的普洱茶茶叶粉碎，过筛，制成普洱茶干粉，密封干燥保存；
38.步骤2.1、分别取上述三个时期的茶粉20g溶于100-200ml蒸馏水中，置于37℃的摇床上震荡摇晃1小时，双层纱布和双层滤纸过滤后弃滤液取滤渣；
39.步骤2.2、向上述三种样品的滤渣中分别加入100-200ml 70％乙醇，于37℃的摇床上震荡过夜，次日过滤取滤渣，用无水乙醇充分洗涤4-5次，过滤后取滤渣，放于通风橱中干燥至无醇味；
40.步骤3、取10g上述干燥后的样品，加入20mg淀粉酶，于20mm的tris-马来酸缓冲液中置于37℃下反应2-4小时使淀粉充分溶解，用蒸馏水将反应后的滤渣洗涤数次以确保淀粉完全除去，过滤后滤渣于室温下干燥，干燥后称重以计量除去淀粉后的重量变化；
41.步骤4、将上述除完淀粉干燥后所得的滤渣与ph在6-7的乙二胺四乙酸溶液以1：20的质量比混合，置于摇床上震荡10小时以保证溶液充分螯合改变细胞壁的交联结构，震荡期间每隔1小时置于超声水浴中超声30分钟，处理结束后，用双层纱布和双层滤纸过滤，滤渣于室温下干燥，滤液用分子量为8000kda的透析膜透析48小时；
42.步骤5、将上述所得干燥后的滤渣与1m koh溶液以1：30质量比混合，置于摇床上震荡10小时，以保证碱溶液(koh)可以有效地破坏异木聚糖和纤维素微纤维之间的h键，用于高效提取木葡聚糖和盐酸氨基葡萄糖，震荡期间每隔1小时置于超声水浴中超声30分钟，处理结束后，用双层纱布和双层滤纸过滤，滤渣于室温下干燥，滤液用分子量为8000kda的透析膜透析48小时；
43.步骤6、上述步骤4～5中所得透析后所得到的浓缩液体放入速冻库中，在-20℃～-35℃，冻结2小时，将冻结后的浓缩液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为-40℃
±
2℃，真空度为-30kpa，得到干燥的絮状物质，即为具有生物免疫活性的细胞壁多糖。
44.对比例1
45.本对比例提供一种从普洱茶中提取多糖的方法，包括如下步骤：
46.步骤1、普洱茶茶叶预处理：将普洱茶发酵前、中、后三个时期的普洱茶茶叶粉碎，过筛，制成普洱茶干粉，密封干燥保存；
47.步骤2、分别取上述三个时期的茶粉20g溶于100-200ml蒸馏水中，置于37℃的摇床上震荡摇晃1小时，后放入95-100℃沸水浴中浸提2小时，后用双层纱布和双层滤纸过滤后收集滤液；
48.步骤3、将上述滤液透析48小时，并将透析后所得到的浓缩液体放入速冻库中，在零下20℃～35℃，冻结2小时，将冻结后的浓缩液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为零下40℃
±
2℃，真空度为-30kpa～-60kpa，得到普洱茶的热水提产物。
49.对比例2
50.本对比例提供一种从普洱茶中提取多糖的方法，包括如下步骤：
51.步骤1、普洱茶茶叶预处理：将普洱茶发酵前、中、后三个时期的普洱茶茶叶粉碎，过筛，制成普洱茶干粉，密封干燥保存；
52.步骤2、分别取上述三个时期的茶粉20g溶于100-200ml蒸馏水中，置于37℃的摇床上震荡摇晃1小时，后放入95-100℃沸水浴中浸提2小时，处理期间每隔1小时置于超声水浴中超声30分钟，处理结束后用双层纱布和双层滤纸过滤后收集滤液；
53.步骤3、将上述滤液透析48小时，并将透析后所得到的浓缩液体放入速冻库中，在零下20℃～35℃，冻结2小时，将冻结后的浓缩液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为零下40℃
±
2℃，真空度为-30kpa～-60kpa，得到普洱茶的热水超声提取产物。
54.对比例3
55.本对比例提供一种从普洱茶中提取多糖的方法，包括如下步骤：
56.步骤1、普洱茶茶叶预处理：将普洱茶发酵前、中、后三个时期的普洱茶茶叶粉碎，过筛，制成普洱茶干粉，密封干燥保存；
57.步骤2、分别取上述三个时期的茶粉20g溶于100-200ml蒸馏水中，置于37℃的摇床上震荡摇晃1小时，后放入超声水浴中超声浸提4小时，处理结束后用双层纱布和双层滤纸过滤后收集滤液；
58.步骤3、将上述滤液透析48小时，并将透析后所得到的浓缩液体放入速冻库中，在零下20℃～35℃，冻结2小时，将冻结后的浓缩液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为零下40℃
±
2℃，真空度为-30kpa～-60kpa，得到普洱茶的超声提取产物。
59.对比例4
60.步骤1、普洱茶茶叶预处理：将普洱茶发酵前、中、后三个时期的普洱茶茶叶粉碎，过筛，制成普洱茶干粉，密封干燥保存；
61.步骤2、分别取上述三个时期的茶粉20g溶于100-200ml蒸馏水中，置于37℃的摇床上震荡摇晃1小时，双层纱布和双层滤纸过滤后弃滤液取滤渣，放于通风橱中干燥；
62.步骤3、将上述所得干燥后的滤渣与1m koh溶液以1：30质量比混合，置于摇床上震荡10小时，处理结束后，用双层纱布和双层滤纸过滤，滤渣于室温下干燥，滤液用分子量为8000kda的透析膜透析48小时；
63.步骤4、将上述透析后所得到的浓缩液体放入速冻库中，在零下20℃～35℃，冻结2
小时，将冻结后的浓缩液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为零下40℃
±
2℃，真空度为-30kpa～-60kpa，得到普洱茶的碱溶液提取产物。
64.试验例1
65.从普洱茶中提取得到的细胞壁多糖所含的组分和含量进行测试，测试结果见表1：
66.表1实施例1和对比例1-4制备得到的茶多糖的组成和含量
[0067][0068]
表1中，rha表示鼠李糖，ara表示阿拉伯糖，glcn表示盐酸氨基葡萄糖，gal表示半乳糖，glc表示葡萄糖，xyl表示木糖，man表示甘露糖，gala表示半乳糖醛酸，mana表示甘露糖醛酸。根据表1所示的结果可知，以实施例1的方法提取的细胞壁多糖中含有大量具有免疫活性的酸性多糖，与常规热水提取的水溶性茶多糖相比有明显的提高。
[0069]
试验例2
[0070]
对实施例1得到的细胞壁多糖进行免疫活性分析实验，包括以下步骤：
[0071]
步骤1、向dmem高糖培养基中加入10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)，作为培养raw264.7小鼠单核巨噬细胞的培养基；
[0072]
步骤2、以步骤1中的培养基培养raw264.7细胞并在细胞密度充足后收集细胞以1*105细胞每孔的密度将细胞定植于96孔板中贴壁12小时；
[0073]
步骤3、将实施例1和对比例1提取到的茶多糖，分别以20μg/ml或100μg/ml的浓度加入到培养基中进行培养。cona(伴刀豆球蛋白,2μg/ml)作为阴性对照，脂多糖(1μg/ml)作为阳性对照，培养24小时后，收集培养液上清用于粒细胞集落刺激因子(g-csf)、白细胞介素-1(il-1)、一氧化氮(no)释放的测定。
[0074]
粒细胞集落刺激因子(g-csf)是第一个被fda批准的髓细胞生长因子。主要作用是化疗后支持治疗，减轻化疗导致粒细胞缺乏的程度和持续时间，降低粒细胞缺乏发热的发
生率，早有体内和体外实验都已证实，粒细胞集落刺激因子(g-csf)可以活化粒细胞功能，激活中性粒细胞呼吸爆发，增强其趋化性，提高其吞噬功能。
[0075]
白细胞介素-1(il-1)是趋化因子家族的一种细胞因子，il-1家族配体包括il-1α、il-1β和il-ra。白细胞介素-1主要发挥免疫调节作用，它的作用包括
①
与抗原协同作用，可使cd4+t细胞活化，il-2r表达；
②
促进b细胞生长和分化，可使脾细胞的溶血空斑数(pfc)增加100
③
促进单核－巨噬细胞等apc的抗原递呈能力；
④
与il-2或干扰素协同可以增强nk细胞活性；
⑤
吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放。
[0076]
一氧化氮(no)是自分泌和旁分泌的信号通路分子，可以扩散进入生物膜，no参与免疫防御系统，神经传递，血管生成等过程。no的下游靶标包括鸟苷酸环化酶和nf-κb，前者可以提高cgmp水平，后者在inos基因表达q aaaa作为重要的转录因子。体内no水平和信号失调常发生于某些疾病状态。糖尿病病人具有低于全球的no水平，动脉粥样硬化常常会导致no信号通路受损，因此no的含量对no信号通路的研究极具意义。
[0077]
测试结果如图1-3所示，可以看出，采用乙二胺四乙酸联合碱溶液辅以超声处理所提取到的细胞壁多糖在对raw264.7小鼠单核巨噬细胞免疫调节中所表现的能力最大，且采用乙二胺四乙酸联合碱溶液辅以超声提取所得到的细胞壁多糖与常规热水提取法相比较能获得更多的酸性多糖，这些酸性多糖具有调节免疫功能的能力，可适度激活巨噬细胞。我们的测试结果表示，采用乙二胺四乙酸联合碱溶液辅以超声提取得到的细胞壁多糖明显促进了il-1α的分泌和g-csf的产生，在先天免疫反应中提供免疫调节功能，并随后保护宿主免受致病性传染原的侵害。
[0078]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种从普洱茶中提取细胞壁多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将普洱茶粉碎得到普洱茶干粉；步骤2、将所述普洱茶干粉依次与水和醇溶液混合，以去除所述普洱茶干粉中的水溶性多糖和蛋白质，过滤并收集得到第一滤渣；步骤3、将所述第一滤渣与淀粉酶混合，以去除所述第一滤渣中的淀粉，过滤并收集得到第二滤渣；步骤4、在ph为6～7的条件下，将所述第二滤渣与乙二胺四乙酸溶液混合，混合过程中辅以超声处理，以改变普洱茶细胞中细胞壁的交联结构，过滤收集得到第三滤渣和第一滤液；步骤5、将所述第三滤渣与碱性溶液混合，混合过程中辅以超声处理，过滤收集得到第四滤渣和第二滤液；步骤6、将所述第一滤液和第二滤液混合并进行透析，收集透过液并冷冻干燥后得到所述细胞壁多糖。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2具体包括如下步骤：步骤2.1、在36-37℃下，将所述普洱茶干粉与蒸馏水混合1-1.5小时，过滤并收集得到水提滤渣；步骤2.2、将所述水提滤渣与70％的乙醇溶液混合12-16小时，过滤并收集醇提滤渣；步骤2.3、使用无水乙醇对所述醇提滤渣进行洗涤、干燥，得到第一滤渣。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3具体包括如下步骤：将淀粉酶溶解在tris-马来酸缓冲液中，将步骤2得到的第一滤渣与溶解有所述淀粉酶的tris-马来酸缓冲液混合，在37-40℃下反应2～4h，反应结束后，过滤并收集得到第二滤渣。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二滤渣与所述乙二胺四乙酸溶液的质量比为1：(20-25)。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二滤渣与所述乙二胺四乙酸溶液的混合时间为10-14小时，混合期间每隔1小时置于超声水浴中超声30-40min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三滤渣与所述碱性溶液的质量比为1：(30-35)。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三滤渣与所述碱性溶液的混合时间为10-14小时，混合期间每隔1小时置于超声水浴中超声30-40分钟。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6具体包括如下步骤：步骤6.1、将第一滤液和第二滤液使用透析膜进行透析44-48小时，透析膜的分子量为8000kda，收集透过液；步骤6.2、在-20℃～-35℃下，将透过液冻结2～6h，随后将冷冻后的透过液放入真空冷冻干燥仓中，冷阱温度为-40℃
±
2℃，真空度为-30kpa～-60kpa，得到细胞壁多糖。9.权利要求1～8任一项所述的提取方法制备得到的细胞壁多糖。10.权利要求9所述的细胞壁多糖在制备具有免疫活性的食品、保健品、药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种从普洱茶中提取的细胞壁多糖及其提取方法和应用。本发明第一方面提供一种从普洱茶中提取细胞壁多糖的方法，首先除去水溶性多糖和蛋白质等大分子物质；其次，以一定量的淀粉酶对非水溶性残渣进行进一步处理，以去除淀粉；接着，采用乙二胺四乙酸联合碱溶液以提取酸性多糖，且经测试发现该方法提取到的细胞壁多糖具有免疫调节作用，与传统方法提取的多糖相比活性更高。因此，通过本发明提供的方法对普洱茶中的细胞壁多糖进行开发和利用，有助于提高产业附加价值，拓宽产品种类，具有较高的应用前景和潜在的价值。具有较高的应用前景和潜在的价值。具有较高的应用前景和潜在的价值。


技术研发人员：李晶 伍晓斌 刘益翡 高龄
受保护的技术使用者：上海师范大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/15