一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组及其应用

1.本发明涉及萝卜肉色鉴定技术领域，特别是涉及一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.萝卜是十字花科重要的蔬菜作物，在进化和人工选择和驯化过程中，其可食用的膨大肉质根产生丰富的遗传变异，包括根形、大小、颜色和风味等。其中，心里美萝卜的肉质根肉色或皮色为红色、紫色，主要是由于花青苷的积累引起的。花青苷不仅是植物颜色的重要组成部分，有利于植物传粉和繁殖、参与应对逆境胁迫等功能，而且还具有抗氧化和减缓衰老的作用，有益人类身体健康。
3.随着人们生活水平的提高，对蔬菜的营养和品质提出更高的要求。加快培育高花青苷含量、色彩更加丰富的心里美萝卜新品种是目前重要的育种目标和研究热点。其中萝卜肉质根肉色的精准鉴定是选育高花青苷含量、丰富心里美品种类型的关键技术。传统的心里美萝卜肉质根肉色鉴定需要将萝卜部分切开或者打洞，造成种株成活率降低，致使育种材料不能正常繁殖种子。因此，亟需开发控制萝卜肉质根花青苷积累的相关分子标记，辅助快速鉴定肉质根花青苷类型和含量。
4.之前的研究表明，心里美萝卜与其他类型萝卜(青萝卜或者白萝卜)的杂交f1代表现为紫皮紫肉，f2代肉质根肉色的表型包括紫色、红色和白色，认为有两对基因分别控制紫色/红色性状，以及有色/白色性状，但其分离比例是混乱的，并不符合严格的孟德尔9:3:4分离【masukawa t,cheon k s,mizuta d,kadowaki m,nakatsuka a,kobayashi n(2019)development ofmutant rsf3
′
h allele-based marker for selection ofpurple and red root in radish(raphanussativus l.var.longipinnatus l.h.bailey).euphytica,215,119.】。其中萝卜肉质根的红色由天竺葵素类花青苷组成，紫色由矢车菊类花青苷组成，并且二氢黄酮醇3’羟化酶(f3’h,flavonoid 3’hydroxylase)，是决定紫色/红色性状的关键基因【masukawa t,cheonks,mizuta d,nakatsukaa,kobayashi n(2017)insertion ofa retrotransposon into a flavonoid 3’hydroxylase homolog confers the red root character in the radish(raphanus sativus l.var.longipinnatus l.h.bailey).the horticulture journal 87:89
–
96.】。但是控制萝卜肉质根有色/白色性状的基因并不清楚，且由于分离比例混乱导致以rsf3’h作为分子标记进行萝卜肉质根肉色鉴定的精准度较低，这严重影响了利用分子标记辅助选育萝卜肉质根肉色的效率和精准度。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组、试剂盒及其应用。本发明提供的引物组可以鉴定萝卜肉质根肉色性状，对萝卜肉质根肉色性状的鉴定具有高效、准确和限制少的优点，为萝卜肉质根肉色性状的鉴定和萝卜育种提供了
有效的工具。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；
8.所述第一引物对包括上游引物p1和下游引物p2；所述第二引物对包括上游引物p3和下游引物p4；所述第三引物对包括上游引物p5和下游引物p6；所述第四引物对包括上游引物p5和下游引物p7；
9.所述上游引物p1的核苷酸序列如seq id no.1所示；
10.所述下游引物p2的核苷酸序列如seq id no.2所示；
11.所述上游引物p3的核苷酸序列如seq id no.3所示；
12.所述下游引物p4的核苷酸序列如seq id no.4所示；
13.所述上游引物p5的核苷酸序列如seq id no.5所示；
14.所述下游引物p6的核苷酸序列如seq id no.6所示；
15.所述下游引物p7的核苷酸序列如seq id no.7所示。
16.优选的，所述引物组还包括第五引物对；所述第五引物对包括上游引物p8和下游引物p9；所述上游引物p8的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述下游引物p9的核苷酸序列如seq id no.9所示。
17.本发明还提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组。
18.本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在鉴定萝卜肉质根肉色性状中的应用。
19.本发明还提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的方法，包括以下步骤：
20.以待鉴定萝卜的基因组dna为模板，利用上述技术方案所述的引物组中的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对分别进行pcr扩增；
21.根据pcr扩增结果判断待鉴定萝卜的基因型，所述判断为根据第一引物对和第二引物对的扩增结果判断待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型，根据第三引物对和第四引物对的扩增结果判断待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型；
22.判断rsmyb1基因的基因型为：当第一引物对得到扩增产物，第二引物对未得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；当第一引物对和第二引物对均得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；当第一引物对未得到扩增产物，第二引物对得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；
23.判断rsf3’h基因的基因型为：当第三引物对得到扩增产物，第四引物对未得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；当第三引物对和第四引物对均得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；当第三引物对未得到扩增产物，第四引物对得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；
24.根据所述待鉴定萝卜的基因型得到待鉴定萝卜的肉质根的肉色：当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白色；当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1，且rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h或f3’h/f3’h时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为紫色；当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为
myb1/myb1或myb1/myb1，且rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为红色。
25.优选的，当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1时，还包括鉴定rsmyb1基因启动子的甲基化程度：以重亚硫酸盐处理后的待鉴定萝卜的基因组dna为模板，利用权利要求2所述的引物组中第五引物对进行pcr扩增，得到扩增片段；
26.根据所述甲基化程度与基因型结果得到待鉴定萝卜肉质根的肉色：当扩增片段的甲基化程度＞50％时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白色。
27.优选的，利用第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对的pcr扩增的反应体系均为10μl，均包括模板2μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、dntps 0.8μl、taq酶0.2μl、10
×
pcr buffer 1μl和余量的ddh2o；利用第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对的pcr扩增的反应程序均包括：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
28.优选的，所述待鉴定萝卜的基因组dna的来源包括萝卜组织。
29.本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在萝卜育种中的应用。
30.优选的，包括：利用上述技术方案所述的方法鉴定待测萝卜肉质根肉色性状，选择紫色和/或红色作为亲本进行育种。
31.有益效果：
32.本发明提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括上游引物p1和下游引物p2；所述第二引物对包括上游引物p3和下游引物p4；所述第三引物对包括上游引物p5和下游引物p6；所述第四引物对包括上游引物p5和下游引物p7；所述第五引物对包括上游引物p8和下游引物p9；所述上游引物p1的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述下游引物p2的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述上游引物p3的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述下游引物p4的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述上游引物p5的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述下游引物p6的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述下游引物p7的核苷酸序列如seq id no.7所示。本发明根据rsmyb1和rsf3’h基因在父母本间的序列差异分别开发分子标记(第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对)，同时结合rsmyb1基因的启动子甲基化分析(利用第五引物对进行甲基化分析，记为rsmyb1
met
)，实现了对源于心里美萝卜与其他类型萝卜(青萝卜或者白萝卜)的杂交f2代肉质根肉色的精准鉴定。相比于单个基因rsmyb1或者rsf3’h作为分子标记进行萝卜肉质根肉色鉴定，rsmyb1-rsf3’h-rsmyb1
met
联合分析大大提高了在分离群体和自然群体中鉴定萝卜肉质根肉色的精准度。利用本发明提供的引物组可以鉴定萝卜肉质根肉色性状，且无需将萝卜部分切开或者打洞，避免种株成活率低和育种材料不能正常繁殖种子的问题，对萝卜肉质根肉色性状的鉴定具有高效、准确和限制少的优点，为萝卜肉质根肉色性状的鉴定和萝卜育种提供了有效的工具。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
34.图1为cmj01和r791亲本以及构建的f1和f2代部分后代的肉质根性状图；
35.图2为紫肉池和红肉池基因组qtl-seq分析结果；
36.图3为有颜色池(紫肉池+红肉池)和白肉池基因组qtl-seq分析结果；
37.图4为9个snp标记的关联分析结果；
38.图5为rsf3’h和rsmyb1的序列分析和分子标记开发结果；其中a为rsmyb1的序列分析和分子标记开发结果；b为rsf3’h的序列分析和分子标记开发结果；c为不同引物对扩增后的电泳图；a～c中的maker的条带从上到下分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp和100bp。
具体实施方式
39.本发明提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括上游引物p1和下游引物p2；所述第二引物对包括上游引物p3和下游引物p4；所述第三引物对包括上游引物p5和下游引物p6；所述第四引物对包括上游引物p5和下游引物p7；
40.所述上游引物p1的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为：5
’‑
tgatagcctgataccattgtgc-3’；
41.所述下游引物p2的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为：5
’‑
tgtaagtaacgacgcgaggt-3’；
42.所述上游引物p3的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体为：5
’‑
gacaagtccaactttggactcggtc-3’；
43.所述下游引物p4的核苷酸序列如seq id no.4所示，具体为：5
’‑
aaggcaggcttgaggaaaag-3’；
44.所述上游引物p5的核苷酸序列如seq id no.5所示，具体为：5
’‑
atgactaatctcttcctcacaatcc-3’；
45.所述下游引物p6的核苷酸序列如seq id no.6所示，具体为：5
’‑
ctgtcgaacatgtttaaaatcttc-3’；
46.所述下游引物p7的核苷酸序列如seq id no.7所示，具体为：5
’‑
acctcctctgatgatttcgaa-3’。
47.本发明根据f3’h基因是否存在5326bp的插入序列开发了分子标记，其中，第三引物对扩增的电泳条带约450bp，在紫肉或白肉材料中有扩增，在红肉材料中没有扩增，判定为显性基因型f3’h；第四引物对扩增的电泳条带约750bp，在红肉材料中有扩增，在紫肉或白肉材料中有扩增的情况，也有不扩增的情况，判定为隐性基因型f3’h。因此，红肉材料的基因型为f3’h/f3’h，紫肉的基因型为f3’h/f3’h或者f3’h/f3’h，白肉的基因型为f3’h/f3’h、f3’h/f3’h或者f3’h/f3’h。
48.本发明根据rsmyb1基因是否存在7372bp的插入序列开发了分子标记，其中，第一引物对扩增的电泳条带约2000bp，在肉质根紫肉或红肉材料中有扩增，在白肉材料中没有扩增，判定为显性基因型myb1；第二引物对扩增的电泳条带约1200bp，在白肉材料中有扩增，在紫肉或红肉材料中有扩增的情况，也有不扩增的情况，判定为隐性基因型myb1。因此，白肉材料的基因型为myb1/myb1，紫肉和红肉的基因型为myb1/myb1或者myb1/myb1。
49.本发明所述引物组优选还包括第五引物对；所述第五引物对包括上游引物p8和下游引物p9；所述上游引物p8的核苷酸序列如seq id no.8所示，具体为：5
’‑
yyaaaatgytgttttyttgtagtgt-3’；
50.所述下游引物p9的核苷酸序列如seq id no.9所示，具体为：5
’‑
raccaacrataaaatatttraarta-3’。
51.本发明seq id no.8和seq id no.9所示的序列中“y”和“r”为简并碱基，其中“y”为c/t，“r”为a/g。
52.本发明通过实验证明了：在极个别情况下，当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1时，由于rsmyb1启动子甲基化会导致极少量有色肉质根单株转变为白肉单株，为了提高利用分子标记鉴定萝卜肉质根肉色的精准度，本发明引入了另一个分子标记，即利用第五引物对对rsmyb1基因的启动子甲基化程度进行分析，计作rsmyb1
met
；当rsmyb1
met
＞50％时，判定为白肉材料。
53.本发明根据rsmyb1和rsf3’h基因在父母本间的序列差异分别开发分子标记，同时结合rsmyb1基因的启动子甲基化分析，实现了对源于心里美萝卜与其他类型萝卜(青萝卜或者白萝卜)的杂交f2代肉质根肉色的精准鉴定。相比于单个基因rsmyb1或者rsf3’h作为分子标记进行萝卜肉质根肉色鉴定，rsmyb1-rsf3’h-rsmyb1
met
联合分析大大提高了在分离群体和自然群体中鉴定萝卜肉质根肉色的精准度。
54.本发明还提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组。本发明所述试剂盒优选还包括pcr扩增所用的试剂；所述pcr扩增所用的试剂优选包括：10
×
pcrbuffer、dntps、taq酶和ddh2o。本发明对所述pcr扩增所用的试剂的来源和组成没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
55.本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在鉴定萝卜肉质根肉色性状中的应用。利用本发明提供的引物组可以鉴定萝卜肉质根肉色性状，且无需将萝卜部分切开或者打洞，避免种株成活率低和育种材料不能正常繁殖种子的问题，对萝卜肉质根肉色性状的鉴定具有高效、准确和限制少的优点，为萝卜肉质根肉色性状的鉴定和萝卜育种提供了有效的工具。
56.本发明还提供了一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的方法，包括以下步骤：
57.以待鉴定萝卜的基因组dna为模板，利用上述技术方案所述的引物组中的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对分别进行pcr扩增；
58.根据pcr扩增结果判断待鉴定萝卜的基因型，所述判断为根据第一引物对和第二引物对的扩增结果判断待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型，根据第三引物对和第四引物对的扩增结果判断待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型；
59.判断rsmyb1基因的基因型为：当第一引物对得到扩增产物，第二引物对未得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；当第一引物对和第二引物对均得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；当第一引物对未得到扩增产物，第二引物对得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；
60.判断rsf3’h基因的基因型为：当第三引物对得到扩增产物，第四引物对未得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；当第三引物对和第四引物对均得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；当第三引物对未得到扩增产
物，第四引物对得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；
61.根据所述待鉴定萝卜的基因型得到待鉴定萝卜的肉质根的肉色：当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白色；
62.当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1，且rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h或f3’h/f3’h时，则判断待鉴定萝卜的肉质根肉色为紫色；当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1，且rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h时，则判断待鉴定萝卜的肉质根肉色为红色。
63.在极个别情况下，当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1时，由于rsmyb1启动子甲基化会导致极少量有色肉质根单株转变为白肉单株，为了提高利用分子标记鉴定萝卜肉质根肉色的精准度，所述方法优选还包括：
64.当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1时，鉴定rsmyb1基因启动子的甲基化程度：以重亚硫酸盐处理后的待鉴定萝卜的基因组dna为模板，利用所述第五引物对进行pcr扩增，得到扩增片段，当扩增片段的甲基化程度＞50％时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白色。
65.在本发明中，所述待鉴定萝卜的基因组dna的来源优选包括萝卜组织；所述萝卜组织优选包括根、茎和叶中的一种或多种；更优选为萝卜的叶片。本发明选择根茎叶等萝卜组织提取基因组dna，无需等萝卜长出肉质根后，将萝卜部分切开或者打洞，可以避免种株成活率低和育种材料不能正常繁殖种子的问题，在植株阶段即可实现对萝卜肉质根肉色性状的鉴定。
66.在本发明中，所述rsmyb1基因启动子的甲基化程度的测定方法优选包括重亚硫酸盐测序法；所述重亚硫酸盐测序法优选包括以下步骤：
67.利用重亚硫酸钠(sodium bisulfite)处理待鉴定萝卜的基因组dna；
68.以处理后的基因组dna为模板，利用第五引物对进行pcr扩增，扩增的产物进行测序后，计算序列中胞嘧啶位点中甲基化胞嘧啶(c)所占比例，记为rsmyb1
met
。
69.在本发明中，利用第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对的pcr扩增的反应体系均优选为10μl，均优选包括模板2μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、dntps 0.8μl、taq酶0.2μl、10
×
pcrbuffer 1μl和余量的ddh2o。
70.在本发明中，利用第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对的pcr扩增的反应程序均优选包括：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
71.本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在萝卜育种中的应用。
72.在本发明中，所述应用优选包括：利用上述技术方案所述的方法鉴定待测萝卜肉质根肉色性状，选择紫色和/或红色作为亲本进行育种。
73.本发明提供的引物组可以快速准确的鉴定萝卜肉质根花青苷的类型，为选育紫色和/或红色的材料提供了有效的工具。
74.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
75.实施例1
76.萝卜肉质根肉色性状的特异分子标记开发
77.1、萝卜肉质根肉色性状的遗传规律
78.萝卜京脆2号(cmj01)，表现为绿皮红肉，购自京研益农(北京)种业科技有限公司；萝卜“791”(r791)，表现为绿皮白肉，购自郑州郑研种苗科技有限公司。
79.为了明确萝卜肉质根性状的遗传规律，本发明利用cmj01和r791构建f2群体，在不考虑花青苷积累多少的情况下，225个f2群体单株的肉质根肉色表型可分为：紫肉(pp，115株)、红肉(rr，35株)、白肉(gw，75株)(图1)，分离比例基本符合9：3：4(χ2＝8.531，0.01《p＝0.014《0.05)。肉质根肉色有颜色(150株)与白肉(75株)的分离比例不符合3：1(χ2＝8.333，p＝0.004《0.01)。而肉质根肉色为紫色(115株)与红色(35株)的分离比例符合3：1(χ2＝0.222，p＝0.637》0.05)。这些结果表明，肉质根肉色主要受两个基因控制，有颜色根肉相对于白肉为显性，紫肉性状相对于红肉为显性，并且肉质根肉色受其他因素调控，导致在f2群体中白肉单株偏多。
80.2、利用qtl-seq进行萝卜肉质根肉色初定位
81.在上述f2群体中分别选择紫肉、红肉和白肉单株各30个单株，通过混合等量dna构建极端性状池(紫肉池、红肉池和白肉池)。利用illumina测序平台进行双末端(150bp)测序，分别获得56.18gb、37.12gb和49.27gb的读长(reads)，根据参考基因组“xyb36-2”，平均测序深度分别为89.34
×
、63.92
×
和81.98
×
，基因组覆盖率分别为86.71％、83.5％和86.49％。
82.首先，利用紫肉池和红肉池基因组重测序数据进行qtl-seq分析，共鉴定出32607个snp，通过计算δsnp-index值将控制萝卜肉质根紫肉性状的主效qtl定位在第7号染色体20.19～21.65mb(p《0.001)区间内，命名为基因rsp(图2)。
83.然后，利用有颜色池(紫肉池+红肉池)和白肉池基因组重测序数据进行qtl-seq分析，通过计算δsnp-index值，将控制萝卜肉质根有颜色(花青苷积累)性状的主效qtl定位在第7号染色体14.00～14.34mb、15.74～16.03mb和16.05～16.4mb(p《0.001)区间内，命名为基因rsr(图3)。
84.3、控制萝卜肉质根肉色基因的精细定位和候选基因预测
85.为了对萝卜肉质根紫肉基因rsp进行精细定位，本发明在定位区间内开发了9个snp标记，具体信息见表1，筛选了来自f2群体(源自cmj01和r791的杂交后代，播种了480株，从中选择362株有颜色)的362个红肉和紫色单株，利用rsp位点侧翼标记鉴定了10个重组单株。
86.表1 9个snp标记的引物信息
[0087][0088][0089]
通过进一步的关联分析将rsp位点定位在snp标记r07_21059062和r07_21181854之间的122.8kb区间内(图4)。根据“xyb36-2”参考基因组注释，该区间内存在17个基因。基因功能注释显示，基因rs392880编码二氢黄酮醇3’羟化酶(f3’h,flavonoid 3’hydroxylase)，该基因是花青苷合成通路中重要的结构基因，能将天竺葵素前体(红色)催化合成矢车菊素前体(紫色)。因此本发明将rsf3’h作为控制萝卜肉质根紫肉性状的关键候选基因。
[0090]
为了获得控制萝卜肉质根有颜色(花青苷积累)性状的关键候基因，本发明对rsr初定位区间第7号染色体14.00～14.34mb、15.74～16.03mb和16.05～16.4mb区域进行基因注释和基因功能分析。这些区间内有140个候选基因，其中rsa10031919被注释为拟南芥
atmyb114，其编码r2r3-myb转录因子家族，能够调控花青素生物合成结构基因的表达。因此本发明将其作为控制萝卜肉质根有颜色性状(花青苷积累)的关键候选基因，命名为rsmyb1。
[0091]
4、控制萝卜肉质根肉色基因rsf3’h和rsmyb1的序列分析和分子标记开发
[0092]
本发明对rsf3’h基因的序列进行分析发现，在亲本材料r791中rsf3'h的全长为3015bp，包含一个1536bp的开放阅读框，编码具有511个氨基酸的蛋白质。与r791相比，亲本材料cmj01的rsf3'h基因在第一个外显子中包含5326bp的插入序列，第3外显子和第4外显子中有7个snp。因此本发明根据5326bp插入序列的存在与否开发了分子标记(图5中的b)。引物对p5/p6(引物p5的核苷酸序列如seq id no.5所示，引物p6的核苷酸序列如seq id no.6所示)扩增的电泳条带约450bp，在紫肉或白肉材料中有扩增，在红肉材料中没有扩增，判定为显性基因型f3’h；引物对p5/p7(引物p5的核苷酸序列如seq id no.5所示，引物p7的核苷酸序列如seq id no.7所示)扩增的电泳条带约750bp，在红肉材料中有扩增，在紫肉或白肉材料中有或者没有扩增，判定为隐性基因型f3’h。因此红肉材料的基因型为f3’h/f3’h，紫肉的基因型为f3’h/f3’h或者f3’h/f3’h，白肉的基因型为f3’h/f3’h、f3’h/f3’h或者f3’h/f3’h(图5中的c)。
[0093]
本发明对rsmyb1基因的序列进行分析发现，在亲本材料r791和cmj01中基因序列没有差异均为1276bp，包含3个外显子，编码248个氨基酸。但在cmj01的rsmyb1基因启动子区(-154bp)存在一个7372bp的cacta转座子的插入。因此本发明根据7372bp插入序列的存在与否开发了分子标记(图5中的a)。引物对p1/p2(引物p1的核苷酸序列如seq id no.1所示，引物p2的核苷酸序列如seq id no.2所示)扩增的电泳条带约2000bp，在肉质根紫肉或红肉材料中有扩增，在白肉材料中没有扩增，判定为显性基因型myb1；引物对p3/p4(引物p3的核苷酸序列如seq id no.3所示，引物p4的核苷酸序列如seq id no.4所示)扩增的电泳条带约1200bp，在白肉材料中有扩增，在紫肉或红肉材料中有或者没有扩增，判定为隐性基因型myb1。因此白肉材料的基因型为myb1/myb1，紫肉和红肉的基因型为myb1/myb1或者myb1/myb1(图5中的c)。
[0094]
接着本发明利用rsmyb1和rsf3’h基因的分子标记检测f2群体中225个单株，发现标记的基因型和单株表型的符合度达到99.11％，其中2个白肉单株的基因型为myb1/myb1(表2中编号为f
2-132、f
2-150的单株)。考虑到基因启动子甲基化能够调控基因表达，本发明利用bs-seq的方法对这2个白肉单株和其他8个包含显性myb1的单株的rsmyb1基因启动子甲基化程度进行分析，所使用的方法是重亚硫酸盐测序法，具体为：利用重亚硫酸钠(sodium bisulfite)处理500ng待测材料基因组dna；利用引物对p8/p9(引物p8的核苷酸序列如seq id no.8所示，引物p9的核苷酸序列如seq id no.9所示)对处理后的dna进行pcr扩增，扩增的产物经过纯化后，连接到pmd18-t载体上，并转化大肠杆菌dh5α菌株，挑10个阳性克隆进行pcr产物测序，最后根据测序结果计算序列中胞嘧啶位点中甲基化胞嘧啶(c)所占比例；p8/p9引物对扩增序列中所有胞嘧啶所占比例的平均值作为rsmyb1基因启动子的甲基化程度，记为rsmyb1
met
。
[0095]
结果显示，编号为f
2-132和f
2-150的这2个白肉单株的rsmyb1基因启动子胞嘧啶甲基化程度分别为56.67％和62.22％，而其他的8个包含显性myb1的单株(紫肉和红肉单株)的rsmyb1基因启动子甲基化程度为11.67％到23.89％，说明在编号为132和150的这2个白
肉单株中rsmyb1基因启动子甲基化抑制了该基因的表达，导致肉质根肉色为白色。
[0096]
因此本发明判定在cmj01(绿皮红肉)和r791(绿皮白肉)杂交后代中，由于rsmyb1启动子甲基化会导致极少量有色肉质根单株转变为白肉单株。为了提高利用分子标记鉴定萝卜肉质根肉色的精准度，本发明引入了另一个分子标记，也就是rsmyb1基因启动子甲基化程度分析，即rsmyb1
met
。具体判断标准为：极个别情况下，当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1时，当rsmyb1
met
大于50％时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白肉。
[0097]
所述p1/p2、p3/p4、p5/p6、p5/p7和p8/p9扩增的体系均为：浓度为50ng/μl的基因组dna或重亚硫酸钠处理后的基因组dna2μl、1μl 10
×
pcr buffer、0.8μl dntps、浓度为10μm的上游引物0.2μl、浓度为10μm的下游引物0.2μl、浓度为5u/μl的taq酶0.2μl和5.6μl ddh2o；
[0098]
所述p1/p2、p3/p4、p5/p6、p5/p7和p8/p9扩增的程序均为：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸l0min；4℃保存。
[0099]
利用rsmyb1和rsf3’h基因的分子标记，结合rsmyb1基因启动子甲基化程度分析，检测f2群体中225个已知表型萝卜的基因型和rsmyb1
met
，结果见表2。
[0100]
表2 f2群体中225个已知表型萝卜的鉴定结果
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106][0107]
由表2可知，本发明提供的rsmyb1-rsf3’h-rsmyb1
met
分子标记组合可以精准地鉴定萝卜肉质根肉色性状。
[0108]
综上所述，本发明提供的引物组(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对)和鉴定方法可以精准地鉴定萝卜肉质根肉色性状，为萝卜肉质根肉色性状的鉴定和萝卜育种提供了有效的工具。
[0109]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括上游引物p1和下游引物p2；所述第二引物对包括上游引物p3和下游引物p4；所述第三引物对包括上游引物p5和下游引物p6；所述第四引物对包括上游引物p5和下游引物p7；所述上游引物p1的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述下游引物p2的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述上游引物p3的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述下游引物p4的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述上游引物p5的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述下游引物p6的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述下游引物p7的核苷酸序列如seq id no.7所示。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括第五引物对；所述第五引物对包括上游引物p8和下游引物p9；所述上游引物p8的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述下游引物p9的核苷酸序列如seq id no.9所示。3.一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。4.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在鉴定萝卜肉质根肉色性状中的应用。5.一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待鉴定萝卜的基因组dna为模板，利用权利要求1或2所述的引物组中的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对分别进行pcr扩增；根据pcr扩增结果判断待鉴定萝卜的基因型，所述判断为根据第一引物对和第二引物对的扩增结果判断待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型，根据第三引物对和第四引物对的扩增结果判断待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型；判断rsmyb1基因的基因型为：当第一引物对得到扩增产物，第二引物对未得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；当第一引物对和第二引物对均得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；当第一引物对未得到扩增产物，第二引物对得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1；判断rsf3’h基因的基因型为：当第三引物对得到扩增产物，第四引物对未得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；当第三引物对和第四引物对均得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；当第三引物对未得到扩增产物，第四引物对得到扩增产物，则待鉴定萝卜rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h；根据所述待鉴定萝卜的基因型得到待鉴定萝卜的肉质根的肉色：当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白色；当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1，且rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h或f3’h/f3’h时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为紫色；当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1，且rsf3’h基因的基因型为f3’h/f3’h时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为红色。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当待鉴定萝卜的rsmyb1基因的基因型为myb1/myb1或myb1/myb1时，还包括鉴定rsmyb1基因启动子的甲基化程度：以重亚硫酸盐处理后的待鉴定萝卜的基因组dna为模板，利用权利要求2所述的引物组中第五引物对进行pcr扩增，得到扩增片段；根据所述甲基化程度与基因型结果得到待鉴定萝卜肉质根的肉色：当扩增片段的甲基化程度＞50％时，则待鉴定萝卜的肉质根肉色为白色。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，利用第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对的pcr扩增的反应体系均为10μl，均包括模板2μl、上游引物0.2μl、下游引物0.2μl、dntps 0.8μl、taq酶0.2μl、10
×
pcr buffer 1μl和余量的ddh2o；利用第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对的pcr扩增的反应程序均包括：94℃预变性4min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述待鉴定萝卜的基因组dna的来源包括萝卜组织。9.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在萝卜育种中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：利用权利要求5～8任一项所述的方法鉴定待测萝卜肉质根肉色性状，选择紫色和/或红色作为亲本进行育种。

技术总结
本发明涉及萝卜肉色鉴定技术领域，特别是涉及一种鉴定萝卜肉质根肉色性状的引物组、试剂盒及其应用。本发明根据RsMYB1和RsF3’H基因在父母本间的序列差异分别开发分子标记，同时结合RsMYB1基因的启动子甲基化分析，实现了对源于心里美萝卜与其他类型萝卜的杂交F2代肉质根肉色的精准鉴定。相比于单个基因RsMYB1或者RsF3’H作为分子标记进行萝卜肉质根肉色鉴定，RsMYB1-RsF3’H-RsMYB1


技术研发人员：张丽 王庆彪 王艳萍 吴翔宇
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2023.08.25
技术公布日：2023/10/15