一种溶瘤病毒来源的RNA及其用途的制作方法

一种溶瘤病毒来源的rna及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种溶瘤病毒来源的rna及其用途。


背景技术：

2.尽管多种疗法在癌症治疗方面取得了很大进展，许多癌症仍然难以得到抑制。近年，病毒载体已被开发用于基因治疗抗击癌症，同时将病毒作为抗癌药物也引起了大量关注。溶瘤病毒可以特异性地在肿瘤细胞中复制，在动物肿瘤模型中效果良好，可以有效的抑制肿瘤生长。各种活病毒，利用病毒感染和病毒复制，在肿瘤中注射如腮腺炎病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒和水疱性口炎病毒以杀死癌细胞。基于这个概念，已有多个溶瘤病毒治疗癌症的药物上市，但是在临床试验中的更多病毒中成功的案例仍较少。主要原因是溶瘤病毒药物在人体内表现出了一定的毒副作用，并且因为制作工艺复杂，质量把控难度大，做成产品的成本和技术壁垒很高。


技术实现要素：

3.根据第一方面，在一实施例中，提供一种rna，所述rna的来源包括溶瘤病毒，或与溶瘤病毒的rna具有至少80％的同源性。
4.根据第二方面，在一实施例中，提供一种dna，所述dna包含编码第一方面任意一项所述rna的核苷酸序列。
5.根据第三方面，在一实施例中，提供负载有第一方面任意一项所述rna的递送制剂。
6.根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的rna，或第二方面任意一项所述的dna在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
7.在一实施例中，本发明提供的rna可有效抑制癌细胞增殖。
附图说明
8.图1为实施例1中6种rna对mfc细胞活力的抑制效果；
9.图2为实施例2中u5对mfc的细胞活力抑制效果图；
10.图3为实施例3中u5对mb49的细胞活力抑制效果图；
11.图4为实施例4中u5对4t1的细胞活力抑制效果；
12.图5为实施例5中u5对b16f10的细胞活力抑制效果；
13.图6为实施例6中u5对ct-26的细胞活力抑制效果；
14.图7为实施例7中u5对pc3的细胞活力抑制效果图；
15.图8为实施例8中u5对ges-1的细胞活力抑制效果图；
16.图9为实施例9中人源胃癌(ncl-n87)皮下移植瘤模型的肿瘤体积生长曲线图；
17.图10为实施例9中人源胃癌(ncl-n87)皮下移植瘤模型的肿瘤组织离体图；
18.图11为实施例10中小鼠renca肾癌细胞皮下移植瘤模型的肿瘤体积生长曲线图；
19.图12为实施例10中小鼠renca肾癌细胞皮下移植瘤模型的肿瘤瘤重结果图。
具体实施方式
20.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
21.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
22.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
23.在一实施例中，本发明针对仙台病毒(hvj，hemagglutinating virus of japan)的rna进行分析，发现具有一定结构特点的短rna片段也能在一定程度上够特异性地抑制肿瘤细胞活力，将有潜力开发成为新型抗肿瘤药物。本发明提供的是rna片段，不是病毒，而现有技术中都使用完整的活体病毒，可以通过化学合成方法制备，工艺流程成熟，周期短、成本低、质量可控性高。
24.根据第一方面，在一实施例中，提供一种rna，所述rna的来源包括溶瘤病毒，或与溶瘤病毒的rna具有同源性。
25.在一实施例中，该rna可以抑制癌细胞增殖。
26.在一实施例中，所述溶瘤病毒包括但不限于仙台病毒。
27.在一实施例中，可以更改rna中的u型序列和其他不影响自配对形成发卡结构的核苷酸。
28.在一实施例中，所述rna包含seq id no.1～6任意一项所示核苷酸序列或与其具有同源性的核苷酸序列。
29.在一实施例中，所述rna包含seq id no.1～6任意一项所示核苷酸序列所构成的组。
30.在一实施例中，所述rna包含seq id no.1所示核苷酸序列所构成的组。
31.现有技术中，溶瘤病毒的制备工艺复杂，而本发明提供的rna片段可以通过化学合成方法制备，工艺流程成熟，周期短、成本低、质量可控性高。活体病毒会带来较多不可控的副作用，而通过合成的rna片段，因为序列经过设计优化，可有效避免毒副作用。
32.在一实施例中，所述rna中，距离5’端的至少3个核苷酸中，至少一个核苷酸具有化学修饰。
33.在一实施例中，所述rna中，距离3’端的至少3个核苷酸中，至少一个核苷酸具有化学修饰。
34.在一实施例中，rna中，两端的核苷酸可以具有化学修饰或不具有化学修饰。
35.在一实施例中，rna的两端修饰有助于提高rna稳定性，增长半衰期。
36.在一实施例中，所述化学修饰包括但不限于2
’‑
o-核糖修饰。
37.在一实施例中，所述2
’‑
o-核糖修饰包括但不限于2
’‑
o-核糖甲基修饰、2
’‑
o-核糖氟代修饰、2
’‑
o-moe核糖修饰中的至少一种。
38.在一实施例中，具有化学修饰的核苷酸中，各个核苷酸上的化学修饰可以相同或不同。
39.在一实施例中，所述rna的3’末端的核苷酸为5
’‑
甲基胞苷。
40.在一实施例中，所述rna为单链。
41.在一实施例中，所述rna为双链。
42.在一实施例中，所述rna包含发夹。
43.根据第二方面，在一实施例中，提供一种dna，所述dna包含编码第一方面任意一项所述rna的核苷酸序列。
44.根据第三方面，在一实施例中，提供负载有第一方面任意一项所述rna的递送制剂。
45.在一实施例中，所述递送制剂包括但不限于阳离子聚合物、脂质纳米颗粒(lipid nanopa rticle，lnp)。
46.在一实施例中，所述阳离子聚合物包括但不限于pei(聚乙烯亚胺，polyethylenimine)。
47.根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的rna，或第二方面任意一项所述的dna在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
48.在一实施例中，所述疾病包括但不限于癌症。
49.在一实施例中，所述癌症包括但不限于胃癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、肾癌等等中的至少一种。具体癌种不受限制，此处仅为示例性列举。
50.在一实施例中，所述药物对正常细胞无损伤或几乎无损伤。
51.在一实施例中，所述正常细胞包括但不限于胃粘膜细胞。胃粘膜细胞仅为正常细胞的代表，本发明提供的rna制得的药物几乎对所有的正常细胞均无损伤。
52.在一实施例中，通过对仙台病毒(hvj)的基因组rna进行分析，设计出可抑制肿瘤细胞活力的rna片段序列，并在5’和3’段进行甲基化修饰以增强rna片段稳定性，通过转染技术递送到肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞生长。
53.在一实施例中，本发明目的在于提供一种溶瘤病毒来源rna片段及其抗肿瘤应用，其可特异性抑制肿瘤细胞活性。
54.在一实施例中，提供一种溶瘤病毒来源rna片段，其中所述rna是单链的。
55.在一实施例中，本发明所述的溶瘤病毒来源rna片段，可形成双链体。
56.在一实施例中，本发明所述的溶瘤病毒来源rna片段，其中所述双链体包含发夹。
57.在一实施例中，本发明所述的溶瘤病毒来源rna片段，其中，rna碱基数为30nt。
58.在一实施例中，本发明所述的溶瘤病毒来源rna片段，其中，所述序列核苷酸任选地进行2
’‑
o-核糖修饰，所述2
’‑
o-核糖修饰选自2
’‑
o-核糖甲基修饰、2
’‑
o-核糖氟代修饰、2
’‑
o-moe核糖修饰等。
59.在一优选的实施例中，本发明所述的溶瘤病毒来源rna，片段为5
’‑
mg-s-mu-s-mg-s-cccauucggggggggccgaaucag-s-mc-s-ma-s-r5mec-3’(seq id no.1)，s代表硫代修饰，m代表2
’‑
o-甲基化，5mec代表5
’‑
甲基胞苷。
60.在一实施例中，本发明还提供所述溶瘤病毒来源rna片段在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
61.在一实施例中，本发明还提供所述溶瘤病毒来源rna片段在制备抗肿瘤药物中的用途。
62.在一实施例中，本发明所述溶瘤病毒来源rna片段，可以采用载体进行装载。
63.在一实施例中，所述载体包括但不限于阳离子聚合物、脂质纳米颗粒(lnp)中的至少一种。
64.在一实施例中，所述阳离子聚合物包括但不限于pei(聚乙烯亚胺，polyethylenimine)。
65.在一实施例中，本发明提供的溶瘤病毒来源rna片段，可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，特异性抑制肿瘤细胞活性。
66.在一实施例中，所述肿瘤细胞包括但不限于胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌等等中的至少一种。
67.在一实施例中，本发明所述溶瘤病毒来源rna片段，可以避免损伤正常细胞，例如人胃粘膜细胞等。
68.在一实施例中，该抗肿瘤药物可以通过方便的方式给药，包括但不限于通过静脉内、瘤内等给药途径。
69.在一实施例中，本发明采用的是参照溶瘤病毒设计的短rna序列，可以通过化学合成方法制备，工艺流程成熟，周期短、成本低、质量可控性高。
70.实施例1核酸序列对比实验
71.实验步骤：
72.1.细胞铺板：
73.将小鼠胃癌细胞(mfc)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
74.2.给药方案：
75.准备5个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的8个离心管中，孵育10min，得到浓度梯度为25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml的u5样品。
76.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
77.3.细胞活力检测：
78.吸去细胞上清，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
79.结果分析：
80.图1为以下5种rna以及u5对mfc细胞活力的抑制效果，u5表现出最佳的肿瘤细胞活力抑制效果，所以选择u5进行后续研究。
81.rna序列：
82.1：gugcccauucggggggggccgaaugggcac(seq id no.2)；
83.2：gugcccauucggaaaaaaccgaaucagcac(seq id no.3)；
84.3：gugcugauucggggggggccgaaucagcac(seq id no.4)；
85.4：gugcccauucggaaaaaaccgaaugggcac(seq id no.5)；
86.5：gugcugauucggaaaaaaccgaaucagcac(seq id no.6)。
87.通过分析仙台病毒的rna片段，设计得到rna序列，5’和3’两端三个碱基进行甲基化修饰，命名u5，5
’‑
mg-s-mu-s-mg-s-cccauucggggggggccgaaucag-s-mc-s-ma-s-r5mec-3’(seq id no.1)。s代表硫代修饰，m代表2
’‑
o-甲基化，5mec代表5
’‑
甲基胞苷。
88.实施例2mfc细胞活力实验
89.实验步骤：
90.1.细胞铺板：
91.将小鼠胃癌细胞(mfc)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
92.2.给药方案：
93.准备8个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的8个离心管中，孵育10min，得到浓度梯度为25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml的u5样品。
94.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
95.3.细胞活力检测：
96.吸去细胞上清，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
97.结果分析：
98.图2为u5对mfc的细胞活力抑制效果图。可见，u5可以有效抑制mfc的细胞活力，并且展示出浓度依赖性，在12.8μg/ml可以达到约60％的抑制效果。
99.实施例3mb49细胞活力实验
100.实验步骤：
101.1.细胞铺板：
102.将小鼠膀胱癌细胞(mb49)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
103.2.给药方案：
104.准备5个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的5个离心
管中，孵育10min，得到浓度梯度为25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml的u5样品。
105.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
106.3.细胞活力检测：
107.吸去细胞上清液，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
108.结果分析：
109.图3为u5对mb49的细胞活力抑制效果图。可见，u5可以有效抑制mb49的细胞活力，并且展示出浓度依赖性，在12.8μg/ml可以达到约30％的抑制效果。
110.实施例4 4t1细胞活力实验
111.实验步骤：
112.1.细胞铺板：
113.将小鼠乳腺癌细胞(4t1)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
114.2.给药方案：
115.准备5个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的5个离心管中，孵育10min，得到浓度梯度为25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml的u5样品。
116.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
117.3.细胞活力检测：
118.吸去细胞上清液，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
119.结果分析：
120.图4为u5对4t1的细胞活力抑制效果图。可见，u5可以有效抑制4t1的细胞活力，并且展示出浓度依赖性，在12.8μg/ml可以达到约20％的抑制效果。
121.实施例5b16f10细胞活力实验
122.实验步骤：
123.1.细胞铺板：
124.将小鼠黑色素瘤细胞(b16f10)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
125.2.给药方案：
126.准备5个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的5个离心
管中，孵育10min，得到浓度梯度为25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml的u5样品。
127.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
128.3.细胞活力检测：
129.吸去细胞上清液，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
130.结果分析：
131.图5为u5对b16f10的细胞活力抑制效果图。可见，u5可以有效抑制b16f10的细胞活力，并在1.6μg/ml-6.4μg/ml之间可以达到约50％的抑制效果。
132.实施例6ct-26细胞活力实验
133.实验步骤：
134.1.细胞铺板：
135.将小鼠结肠癌细胞(ct-26)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
136.2.给药方案：
137.准备4个离心管，通过二倍稀释法加入opti-mem培养基，制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的5个离心管中，孵育10min，得到浓度梯度为25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、1.6μg/ml的u5样品。
138.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、0.8μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
139.3.细胞活力检测：
140.吸去细胞上清液，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
141.结果分析：
142.图6为u5对ct-26的细胞活力抑制效果图。可见，u5可以有效抑制ct-26的细胞活力，并且展示出浓度依赖性，在12.8μg/ml可以达到约40％的抑制效果。
143.实施例7pc3细胞活力实验
144.实验步骤：
145.1.细胞铺板：
146.将人前列腺癌细胞(pc3)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
147.2.给药方案：
148.准备8个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为180μg/ml、140μg/ml、102.4μg/ml、51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的5个离心管中，孵育10min，得到浓度梯度为90μg/ml、70μg/ml、
51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml的u5样品。
149.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为45μg/ml、35μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃培养48h。
150.3.细胞活力检测：
151.吸去细胞上清液，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
152.结果分析：
153.图7为u5对pc3的细胞活力抑制效果图。可见，u5可以有效抑制pc3的细胞活力，并且展示出浓度依赖性，在25.6μg/ml可以达到约60％的抑制效果。
154.实施例8ges-1正常细胞活力实验
155.实验步骤：
156.1.细胞铺板：
157.将人胃粘膜细胞(ges-1)以4000个/孔的浓度接种于96孔板，37℃培养24h后备用。
158.2.给药方案：
159.准备5个离心管，加入opti-mem培养基和u5，通过二倍稀释法制备得到不同浓度的u5储备液，浓度梯度为180μg/ml、140μg/ml、102.4μg/ml、51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、3.2μg/ml。取pei加入opti-mem培养基稀释，得到浓度为0.4μg/ml的pei溶液，等体积加入以上稀释好的5个离心管中，孵育10min，得到浓度梯度为90μg/ml、70μg/ml、51.2μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、1.6μg/ml的u5样品。
160.孔中原100μl培养基保留，将以上稀释好的u5样品取100μl加入至96孔，使孔中药物浓度梯度为45μg/ml、35μg/ml、25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、0.8μg/ml，每个浓度做3个复孔，37℃孵育48h。
161.3.细胞活力检测：
162.吸去细胞上清液，每孔加入100μl的新鲜培养基和100μl化学发光试剂，孵育混匀后转移120μl至白板中，使用多功能酶标仪进行化学发光检测，检测波长560nm。
163.结果分析：
164.图8为u5对ges-1的细胞活力抑制效果图。可见，u5并不会明显影响正常的人胃粘膜细胞的细胞活力，在0.8μg/ml～25.6μg/ml浓度范围内仍展现出较小的细胞毒性。
165.由于pei对核酸的负载能力限制，继续升高浓度也无法更有效抑制细胞，有时细胞活力反而上升。如果同时增加pei浓度，pei会对细胞产生毒性，降低细胞活力(见图6、7)。
166.实施例9人源胃癌(ncl-n87)皮下移植瘤模型药效实验
167.实验步骤：
168.1.动物造模
169.5周龄的雄性babl/c裸鼠40只，饲养于spf级屏障环境内ivc系统中。先将n87细胞用胰酶消化，pbs重悬并计数，将细胞悬液配制成2.5
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107个/ml，取200μl注射于4只裸鼠右前肢腋下，获得第1代肿瘤。取第1代肿瘤，去除附着的结缔组织部分后，称取肿瘤组织4g切碎，加入4ml pbs混匀后，将肿瘤组织混悬液按200μl/只的剂量注射于小鼠右侧腋下皮下。待肿瘤生长至75～100mm3后，从40只鼠中挑选最符合实验条件的32只鼠，将实验动物随机
分组分成4组，每组8只，保证入组时各组平均瘤体积相接近。
170.2.药物配制
171.2.1配制0.3mg/ml u5的10％海藻糖溶液。
172.2.2配制0.43mg/ml pei的10％海藻糖溶液，用1m的氢氧化钠调节ph＝3.60。
173.2.3将两种工作液分别均分到两个注射器中，保持注射器中的液体量相同，然后连接在混合器中，将注射器固定在注射泵上，启动注射泵，快速混合，获得制剂原液。
174.2.4冻干过夜，获得冻干粉。
175.2.5采用适量无酶无菌水进行复溶冻干粉，得含150μg/ml u5的制剂溶液。
176.2.6分别采用10％海藻糖溶液按照100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的浓度进行稀释。
177.3.给药
178.随后按照每3天进行1次尾静脉注射给药，每次给药体积为100μl/只，分别采用高(100μg/ml)、中(50μg/ml)、低(25μg/ml)三个剂量。将第1次测量给药时间标记为第0天，第16次给药后，观察、测量小鼠肿瘤生长状况，3天后处死鼠进行肿瘤取样，拍照。
179.结果分析：
180.如图9所示为肿瘤体积生长曲线图。可见，各实验组肿瘤体积呈均匀生长趋势。受试药物低、中、高剂量组表现出不同程度的抑瘤作用，并与剂量存在相关性。
181.如图10所示为肿瘤组织离体图，末次给药后第3天取样拍照，观察离体肿瘤体积大小，可见，低剂量组与对照组体积大小相似，中剂量组和高剂量组略小于对照组，这些结果提示u5对n87胃癌肿瘤生长有一定抑制作用，且呈剂量相关性。
182.实施例10小鼠renca肾癌细胞皮下移植瘤模型药效实验
183.实验步骤：
184.1.动物造模
185.取检疫合格的balb/c小鼠，用1ml注射器抽取细胞浓度为2.5
×
107个/ml的细胞悬液0.2ml接种于小鼠右侧中翼皮下，即每只小鼠皮下接种5
×
106个细胞。接种6天后，取肿瘤平均体积生长至100mm3左右的动物随机分为2组，每组动物8只。
186.2.药物配制
187.1)配制0.3mg/ml u5的10％海藻糖溶液。
188.2)配制0.43mg/ml pei的10％海藻糖溶液，用1m的氢氧化钠调节ph＝3.60。
189.3)将两种工作液分别均分到两个注射器中，保持注射器中的液体量相同，然后连接在混合器中，将注射器固定在注射泵上，启动注射泵，快速混合，获得制剂原液。
190.4)冻干过夜，获得冻干粉。
191.5)采用适量无酶无菌水进行复溶冻干粉，配制含300μg/ml u5的制剂溶液。
192.3.给药
193.按照每3天瘤内给药1次，前四次给药剂量为0.3mg/ml(50μl/只)，后四次给药剂量为0.6mg/ml(50μl/只)，共给药8次。实验开始将第1次测量给药时间标记为第1天，每3天测量1次，至第28天，观察、测量小鼠肿瘤生长状况，处死鼠进行肿瘤取样，称量瘤重。
194.结果分析：
195.如图11所示为肿瘤体积生长曲线图。可见，pbs组动物的肿瘤体积保持快速增长的趋势。从增加给药剂量后至第28天，u5组动物平均瘤体积有一定程度降低。
196.如图12所示为肿瘤瘤重结果图，u5组在第28天的瘤重较pbs组有一定程度降低。
197.上述结果表明，u5具有一定的抑制renca肿瘤细胞增长的效果。
198.以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

技术特征：
1.一种rna，其特征在于，所述rna的来源包括溶瘤病毒，或与溶瘤病毒的rna具有同源性。2.如权利要求1所述的rna，其特征在于，所述rna包含seq id no.1～6任意一项所示核苷酸序列或与其具有同源性的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的rna，其特征在于，所述rna中，距离5’端的至少3个核苷酸中，至少一个核苷酸具有化学修饰。4.如权利要求1所述的rna，其特征在于，所述rna中，距离3’端的至少3个核苷酸中，至少一个核苷酸具有化学修饰。5.如权利要求3或4所述的rna，其特征在于，所述化学修饰包括2
’‑
o-核糖修饰；或，所述2
’‑
o-核糖修饰包括2
’‑
o-核糖甲基修饰、2
’‑
o-核糖氟代修饰、2
’‑
o-moe核糖修饰中的至少一种；或，所述rna的3’末端的核苷酸为5
’‑
甲基胞苷。6.如权利要求1所述的rna，其特征在于，所述rna为单链；或，所述rna为双链；或，所述rna包含发夹。7.一种dna，其特征在于，所述dna包含编码如权利要求1～6任意一项所述rna的核苷酸序列。8.负载有如权利要求1～6任意一项所述rna的递送制剂。9.如权利要求1～6任意一项所述的rna，或如权利要求7所述的dna在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述疾病包括癌症；或，所述癌症包括胃癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、肾癌中的至少一种。

技术总结
一种溶瘤病毒来源的RNA及其用途，所述RNA的来源包括溶瘤病毒，或与溶瘤病毒的RNA具有同源性。本发明提供的RNA可有效抑制癌细胞增殖。殖。殖。


技术研发人员：姜孝明 宋庆乐 何裕华 陈宇静 谢天婕 何凡翠 夏鹏昌
受保护的技术使用者：乐土佑嘉（深圳）医药科技有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/9/23