一种含G61突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用的制作方法

一种含g61突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种含g61突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用。


背景技术：

2.谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,gs)是植物氮代谢的关键酶，它在谷氨酸合成酶循环中催化谷氨酸(gln)与nh3缩合形成谷氨酰胺(glu)，参与植物含氮化合物的新陈代谢。根据分布及亚细胞定位，可将高等植物gs(属gsii类)同工酶分为两种：一种位于细胞质内称为胞质型gs(gs1)，分子量为38-40kda；另一种位于叶绿体(或质体)内称为质体型gs(gs2)，分子量为44-45kda。
3.草铵膦(glufosinate，glufosinate ammoniμm，商品名称basta)是由安万特公司(现为拜耳公司)开发的谷氨酰胺合成酶(gs1)抑制剂，其有效成分为phosphinothricin(简称ppt)，化学名称为(rs)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵。该产品于1986年上市，销售额逐年上升。草铵膦的靶标酶是gs，在正常情况下，gs可以由atp及glutamate形成λ-glutamyl phosphate。但在ppt处理后，ppt先与atp结合，磷酸化的ppt占据gs分子的8个反应中心，使gs的空间构型发生变化，从而gs的活性受到抑制。ppt能抑制gs所有已知的形式。
4.草铵膦抑制gs的结果，可以导致植物体内氮代谢紊乱，铵的过量积累，叶绿体解体，从而致使植物的光合作用受抑制，严重的情形下可导致植物死亡。
5.目前，培育抗草铵膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草铵膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草铵膦作物新品种。目前农业上应用最广的抗草铵膦基因是来源于菌株streptomyces hygroscopicus的bar基因和菌株s.viridochromogenes的pat基因。bar基因和pat基因具有80％的同源性，都可以编码草铵膦乙酰化酶，而该酶可以使草铵膦乙酰化而失活。抗草铵膦品种具有极大的使用价值，其中抗性油菜、玉米等已大面积商业化种植。
6.bar基因和pat基因编码的草铵膦乙酰化酶可以使草铵膦乙酰化而失活，但是在草铵膦接触gs之前，该酶很难使草铵膦完全失活，因为很多gs分布在细胞膜上，因此草铵膦在转bar基因和pat基因农作物上应用时，会不同程度的干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。在植物中过量表达野生型gs可以降低转基因植物对草铵膦的敏感程度，但其耐性程度不足以商业化应用。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种含g61突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用，为培育耐草铵膦的植物品种提供强有力的技术支持。植物谷氨酰胺合成酶突变体原始来源于植物，通过突变后具有了草铵膦抗性，转化该植物谷氨酰胺合成酶突变体的
植物不仅具有草铵膦抗性，也能够正常生长和发育。
9.术语解释：
[0010]“删除突变”即为缺失突变(del)。如将目标蛋白的氨基酸序列对应于参考序列第61位氨基酸残基进行删除突变，使得对应于参考序列第61位氨基酸残基被删除。
[0011]
本发明中的“草铵膦”又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵。
[0012]
本发明是这样实现的：
[0013]
第一方面，本发明提供了一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法，包括如下步骤：
[0014]
1)以具有seq id no.1所示的参考序列、或以与参考序列相比具有至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白作为目标蛋白；
[0015]
2)将目标蛋白的氨基酸序列与参考序列比对，将目标蛋白的氨基酸序列对应于参考序列第61位氨基酸残基进行突变，突变为脯氨酸或进行删除突变；
[0016]
3)选择草铵膦抗性增强的蛋白。
[0017]
发明人研究发现，将植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列进行比对，将其序列上对应于参考序列第61位的氨基酸位点进行突变，突变为脯氨酸或进行删除突变，能够筛选获得具有草铵膦抗性的蛋白。该蛋白具有良好的生物酶催化活性。
[0018]
第二方面，本发明还提供了一种植物谷氨酰胺合成酶突变体，其具有草铵膦抗性，植物谷氨酰胺合成酶突变体如下(1)或(2)所示：
[0019]
(1)：其由来源于植物的野生型谷氨酰胺合成酶的第n位发生突变得到；第n位的位置通过如下方式确定：野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位对应于参考序列的第61位，其中，参考序列的氨基酸序列如seq id no.1所示；
[0020]
与野生型谷氨酰胺合成酶相比，植物谷氨酰胺合成酶突变体第n位的氨基酸为脯氨酸或删除突变；
[0021]
(2)：其与(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体在第n位的氨基酸相同。
[0022]
将植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列进行比对，将其序列上对应于参考序列第61位的氨基酸位点即第n位进行突变，突变为p或删除，所得到的植物谷氨酰胺合成酶突变体具有草铵膦抗性，同时保持自身的生物酶催化活性。转化本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长和发育，该植物谷氨酰胺合成酶突变体不仅用于转基因作物培育，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物或转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、油菜、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。
[0023]
上述参考序列为水稻来源的野生型谷氨酰胺合成酶。
[0024]
序列比对方法可使用blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行protein blast比对；采用本领域熟知的其他序列比对方法或工具也可以得到相同的结果。
[0025]
需要说明的是，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位在其自身序列上可能也是第61位(例如玉米、大豆、油菜等)，但也可能不是第61位，第n位的具体位置根据前述序列比对后确定，只要其通过与参考序列比对后，对应于参考序列第61位的位点即为本发明所述的第n位，也就是突变位点。
[0026]
在本发明应用较佳的实施方式中，植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯。
[0027]
所有植物的野生型谷氨酰胺合成酶都具有同源性，在植物体内具有基本相同的功能和结构域。因此，任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶在第61位作上述突变后所得到的植物谷氨酰胺合成酶突变体都具有草铵膦抗性。因此，由任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶作上述突变后得到的植物谷氨酰胺合成酶突变体均属于本发明的保护范围。
[0028]
此外，本领域技术人员知晓并容易实现，在(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体的非保守区域进行简单的氨基酸替换或删除或增加等操作并维持第n位为上述突变后的氨基酸，并使进一步突变得到的植物谷氨酰胺合成酶突变体与(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的同一性，且其功能包括酶催化活性和草铵膦抗性与(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体相当或略有下降或略有提高或大幅提高等。因此，此类谷氨酰胺合成酶也应属于本发明的保护范围。
[0029]
在本发明应用较佳的实施方式中，牧草选自禾本科牧草或豆科牧草；豆科牧草包括不限于：红三叶、白三叶、紫花苜蓿、箭舌豌豆、绿豌豆、黄花羽扇豆、白花草木樨、黄花草木樨、地三叶、紫云英及胡蝶豆等。
[0030]
在本发明应用较佳的实施方式中，芸薹属蔬菜包括不限于芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。
[0031]
在本发明应用较佳的实施方式中，葫芦科植物包括不限于黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；
[0032]
在本发明应用较佳的实施方式中，豆科植物包括不限于绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆；
[0033]
在本发明应用较佳的实施方式中，植物为水稻、玉米、大豆或油菜。
[0034]
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为水稻时，水稻野生型谷氨酰胺合成酶为seq id no.1：
[0035]
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[0036]
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为玉米时，玉米野生型谷氨酰胺合成酶为seq id no.2：
[0037]
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[0038]
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为大豆时，大豆野生型谷氨酰胺合成酶为seq id no.3：
[0039]
msllsdlinlnlsdttekviaeyiwiggsgmdlrskartlpgpvsdpsklpkwnydgsstgqapgedseviiypqaifrdpfrrgnnilvicdtytpagepiptnkrhdaakvfshpdvvaeetwygieqeytllqkdiqwplgwpvggfpgpqgpyycgvgadkafgrdivdahykaclyaginisgingevmpgqwefqvgpsvgisagdevwaaryileriteiagvvvsfdpkpiqgdwngagahtnystksmrndggyeviktaieklgkrhkehiaaygegnerrltgrhetadintflwgvanrgasvrvgrdtekagkgyfedrrpasnmdpyvvtsmiadttilwkp。
[0040]
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为油菜时，油菜野生型谷氨酰胺合成酶为seq id no.4：
[0041]
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[0042]
部分植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶相互间的相似性(similarity)和同一性(identity)如下表所示，其序列比对的部分结果见图8，箭头所示为第61位氨基酸。
[0043][0044]
上述相似性(similarity)和同一性(identity)的比对方法为：将一个物种的氨基酸序列输入到blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行protein blast比对，从比对结果中查找此物种和其他需要比对的物种的相似性(similarity)和同一性(identity)。
[0045]
第三方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的植物谷氨酰胺合成酶突变体。
[0046]
术语“编码上述的植物谷氨酰胺合成酶突变体的核酸分子”可以是包括编码本发
明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0047]
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。
[0048]
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。
[0049]
应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cdna时，可优选使用race法(race-cdna末端快速扩增法)，用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
[0050]
在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述植物谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。例如，可以在编码野生型谷氨酰胺合成酶的核酸序列上作对应的核苷酸突变得到编码上述植物谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。这对本领域技术人员来说是容易实现的。
[0051]
例如，水稻野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为seq id no.5：
[0052]
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[0053]
据此，在序列基础上，在对应于其编码氨基酸序列第61位的密码子进行对应的核苷酸突变，即可得到编码如上所述的水稻植物谷氨酰胺合成酶突变体。
[0054]
玉米野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为seq id no.6：
[0055]
atggcctgcctcaccgacctcgtcaacctcaacctctcggacaacaccgagaagatcatcgcggaatacatatggatcggtggatctggcatggatctcaggagcaaagcaaggaccctctccggcccggtgaccgatcccagcaagctgcccaagtggaactacgacggctccagcacgggccaggcccccggcgaggacagcgaggtcatcctgtacccgcaggccatcttcaaggacccattcaggaggggcaacaacatccttgtgatgtgcgattgctacaccccagccgg
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[0056]
大豆野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为seq id no.7：
[0057]
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[0058]
油菜野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为seq id no.8：
[0059]
atgagtcttcttacagatctcgttaaccttaacctctcagagaccactgacaaaatcattgcggaatacatatgggttggaggttcaggaatggatatgagaagcaaagccaggactcttcctggaccagtgagtgacccttcggagctaccaaagtggaactatgatggctcaagcacaggccaagctcctggtgaagacagtgaagtcatcttataccctcaagccatattcaaagatcctttccgtagaggcaacaacattcttgtcatgtgcgatgcttacactccagcgggcgaaccgatcccaacaaacaaaagacacgctgcggctaaggtctttagccaccccgatgttgtagctgaagtgccatggtatggtattgagcaagagtatactttacttcagaaagatgtgaactggcctcttggttggcctattggcggcttccccggtcctcagggaccatactattgtagtgttggagcagataaatcttttggtagagacatcgttgatgctcactacaaggcctgcttatacgctggcatcaatattagtggcatcaacggagaagtcatgcctggtcagtgggagttccaagttggtccagctgttggtatctcggccggtgatgaaatttgggtcgcacgtttcattttggagaggatcacagagattgctggtgtggtggtatcttttgacccaaaaccgattcccggtgactggaatggtgctggtgctcactgcaactatagtaccaagtcaatgagggaagatggtggttacgagattattaagaaggcaatcgataaactgggactgaga
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[0060]
第四方面，本发明还提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。
[0061]
载体包括不限于表达载体、穿梭载体和整合载体。
[0062]
本发明中，术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0063]
在一种可选的实施方式中，表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0064]
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0065]
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0066]
第五方面，本发明还提供了一种重组菌或重组细胞，其含有上述的核酸分子或上述的载体。
[0067]
重组细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
[0068]
在本发明应用较佳的实施方式中，菌株选自农杆菌、大肠杆菌。
[0069]
第六方面，本发明还提供了一种植物谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子、载体或重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物品种中的应用。
[0070]
在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括如下任意一种用途：
[0071]
(1)将载体转化目的植物，载体含有编码植物谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因；
[0072]
(2)通过基因编辑的方法修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码植物谷氨酰胺合成酶突变体；
[0073]
(3)对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变和筛选，使其编码植物谷氨酰胺合成酶突变体。
[0074]
在本发明应用较佳的实施方式中，基因编辑选自crispr/cas9、talen技术或zfn技术。
[0075]
在本发明提供了植物谷氨酰胺合成酶突变体的基础上，本领域技术人员容易想到通过本领域常规的基因编辑技术(如通过锌指核酸内切酶(zfn，zinc-finger nucleases)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(talen，transcription activator-like effector nucleases)技术或crispr/cas9)、诱变育种技术(如化学、辐射诱变等)等对目标植物进行改造，使其具有编码如上所述植物谷氨酰胺合成酶突变体的基因，进而获得草铵膦抗性并能够正常生长和发育，进行得到具有草铵膦抗性的植物新品种。因此，无论采用何种技术，
只要其利用了本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体赋予植物草铵膦抗性，则属于本发明的保护范围。
[0076]
在一种可选的实施方式中，诱变为非致死剂量的理化诱变方式对植物进行诱变以获得植物材料。
[0077]
上述非致死剂量是指将剂量控制在半致死剂量上下浮动20％的范围。
[0078]
理化诱变方式包括以下物理诱变、化学诱变方式中的一种或多种的组合：物理诱变包括紫外线诱变、x射线诱变、γ射线诱变、β射线诱变、α射线诱变、高能粒子诱变、宇宙射线诱变、微重力诱变；化学诱变包括烷化剂诱变、叠氮化物诱变、碱基类似物诱变、氯化锂诱变、抗生素诱变、嵌入染料诱变；烷化剂诱变包括甲基环酸乙酯诱变、硫酸二乙酯诱变、乙烯亚胺诱变。
[0079]
在本发明应用较佳的实施方式中，植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯；
[0080]
在本发明应用较佳的实施方式中，牧草选自禾本科牧草或豆科牧草；
[0081]
在本发明应用较佳的实施方式中，芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜；
[0082]
在本发明应用较佳的实施方式中，葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；
[0083]
在本发明应用较佳的实施方式中，豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆；
[0084]
在本发明应用较佳的实施方式中，植物为水稻、玉米、大豆或油菜。
[0085]
第七方面，本发明还提供了一种产生耐受草铵膦除草剂的植物的方法，包括向目标植物的基因组中引入编码上述的植物谷氨酰胺合成酶突变体的基因。
[0086]
在一种可选的实施方式中，引入的方法选自遗传转化方法、基因组编辑方法或基因突变方法。
[0087]
上述遗传转化方法包括不限于：通过带有草铵膦抗性的植物谷氨酰胺合成酶突变体的基因的亲本植物自交或与其他植物个体杂交产生带有草铵膦抗性的个体。
[0088]
在其他实施方式中，上述转化的方法包括不限于农杆菌介导基因转化法，基因枪转化法、花粉管通道法。
[0089]
在本发明应用较佳的实施方式中，植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯；
[0090]
在本发明应用较佳的实施方式中，牧草选自禾本科牧草或豆科牧草；
[0091]
在本发明应用较佳的实施方式中，芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜；
[0092]
在本发明应用较佳的实施方式中，葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；
[0093]
在本发明应用较佳的实施方式中，豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆；
[0094]
在本发明应用较佳的实施方式中，植物为水稻、玉米、大豆或油菜。
[0095]
本发明具有以下有益效果：
[0096]
(1)本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体丰富了植物谷氨酰胺合成酶突变体库，为培育耐草铵膦的植物品种提供强有力的技术支持。
[0097]
(2)植物谷氨酰胺合成酶突变体原始来源于植物，通过突变后具有了草铵膦抗性，转化该植物谷氨酰胺合成酶突变体的植物不仅具有草铵膦抗性，也能够正常生长和发育。
[0098]
(3)植物谷氨酰胺合成酶突变体具有良好的生物酶催化活性。
附图说明
[0099]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0100]
图1为本发明实施例1提供的水稻gs1突变体og61p和og61x和野生型水稻gs1 osgs1_wt的氨基酸序列部分比对结果；
[0101]
图2为本发明实施例2提供的玉米gs1突变体zg61p和zg61x和野生型玉米gs1 zmgs1_wt的氨基酸序列部分比对结果；
[0102]
图3为本发明实施例3提供的大豆gs1突变体gg61p和gg61x和野生型大豆gs1 gmgs1_wt的氨基酸序列部分比对结果；
[0103]
图4为本发明实施例4提供的油菜gs1突变体bg61p和bg61x和野生型油菜gs1 bngs1_wt的氨基酸序列部分比对结果；
[0104]
图5为本发明实验例1提供的padv7载体的结构示意图；
[0105]
图6为本发明实验例1提供的转化实施例1提供的水稻gs1突变体og61p和og61x和野生型水稻gs1 osgs1_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；玉米gs1突变体zg61p和zg61x和野生型玉米gs1 zmgs1_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；大豆gs1突变体gg61p和gg61x和野生型大豆gs1 gmgs1_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；油菜gs1突变体bg61p和bg61x和野生型油菜gs1 bngs1_wt的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果；
[0106]
图7为本发明实验例2提供的水稻gs1突变体og61x、玉米gs1突变体zg61x、大豆gs1突变体gg61x、野生型水稻gs1 osgs1_wt、野生型玉米gs1 zmgs1_wt和野生型大豆gs1 gmgs1_wt的酶动力学参数和草铵膦抗性参数ic
50
；
[0107]
图8为不同植物野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列比对结果；图中：osgs1_wt：水稻野生型谷氨酰胺合成酶体；zmgs1_wt：玉米野生型谷氨酰胺合成酶体；gmgs1_wt：大豆野生型谷氨酰胺合成酶体；bngs1_wt：油菜野生型谷氨酰胺合成酶体。
具体实施方式
[0108]
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每
一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0109]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文试验的实践或测试，但现在描述一些方法和材料，除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
[0110]
除非另外指明，否则实践本发明将采用植物生理学、植物分子遗传学、细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《植物生理学》(苍晶等人，2017)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《植物分子遗传学》(monica a.hughes等人著)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
[0111]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0112]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0113]
实施例1
[0114]
本实施例提供的水稻(oryza sativa)谷氨酰胺合成酶(gs1)突变体，其由野生型水稻谷氨酰胺合成酶自身(命名为osgs1_wt，氨基酸序列如seq id no.1所示，编码核苷酸序列为seq id no.6)的第61位氨基酸残基g突变为p或删除得到，得到的水稻gs1突变体分别命名为og61p和og61x，水稻gs1突变体og61p和og61x和野生型水稻gs1的氨基酸序列比对如图1所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
[0115]
本实施例中，各水稻gs1突变体的编码序列在编码第61位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
[0116]
氨基酸p删除密码子ccg无
[0117]
本实施例提供的水稻gs1突变体og61p和og61x和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
[0118]
实施例2
[0119]
本实施例提供的玉米(zea mays)gs1突变体，其由野生型玉米gs1自身(命名为zmgs1_wt，氨基酸序列如seq id no.2所示，编码核苷酸序列为seq id no.6)的第61位(对
应于参考序列(seq id no.1)的第61位)由氨基酸残基g突变为p或删除得到。得到的玉米gs1突变体分别命名为zg61p和zg61x。
[0120]
玉米gs1突变体zg61p和zg61x和野生型玉米gs1的氨基酸序列比对如图2所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
[0121]
本实施例中，各玉米gs1突变体的编码序列在编码第61位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
[0122]
氨基酸y删除密码子cct无
[0123]
本实施例提供的玉米gs1突变体zg61p和zg61x和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
[0124]
实施例3
[0125]
本实施例提供的大豆(glycine max)gs1突变体，其由野生型大豆gs1自身((命名为gmgs1_wt，氨基酸序列如seq id no.3所示，编码核苷酸序列为seq id no.7)的第61位(对应于参考序列(seq id no.1)的第61位)由氨基酸残基g突变为p或删除得到。得到的水稻大豆gs1突变体分别命名为gg61p和gg61x。
[0126]
大豆gs1突变体gg61p和gg61x和野生型大豆gs1的氨基酸序列比对如图3所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
[0127]
本实施例中，各大豆gs1突变体的编码序列在编码第61位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
[0128]
氨基酸p删除密码子cct无
[0129]
本实施例提供的大豆gs1突变体gg61p和gg61x和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
[0130]
实施例4
[0131]
本实施例提供的油菜(brassica napus)gs1突变体，其由野生型油菜gs1自身(命名为bngs1_wt，氨基酸序列如seq id no.4所示，编码核苷酸序列为seq id no.8)的第61位(对应于参考序列(seq id no.1)的第61位)由氨基酸残基g突变为p或删除得到。得到的油菜gs1突变体分别命名为bg61p和bg61x。
[0132]
油菜gs1突变体bg61p和bg61x和野生型油菜gs1的氨基酸序列比对如图4所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
[0133]
本实施例中，各油菜gs1突变体的编码序列在编码第61位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
[0134][0135][0136]
本实施例提供的油菜gs1突变体bg61p和bg61x和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
[0137]
实验例1
[0138]
本实验例进行草铵膦抗性测试。
[0139]
分别检测实施例1提供的水稻gs1突变体og61p和og61x的草铵膦抗性、实施例2提供的玉米gs1突变体zg61p和zg61x的草铵膦抗性、实施例3提供的大豆gs1突变体gg61p和gg61x的草铵膦抗性、实施例4提供的油菜gs1突变体bg61p和bg61x的草铵膦抗性。具体方法如下：
[0140]
根据实施例1、实施例2、实施例3和实施例4提供的核酸分子的序列，采用化学合成的方法合成编码水稻gs1突变体og61p和og61x、玉米gs1突变体zg61p和zg61x、大豆gs1突变体gg61p和gg61x、油菜gs1突变体bg61p和bg61x的编码基因，两端引入酶切位点(paci和sbfi)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如padv7载体，其结构如图5所示)上，然后分别转化谷氨酰胺合成酶缺陷型大肠杆菌，此缺陷型大肠杆菌为天豫兴禾生物科技有限公司在大肠杆菌dh5α基础上敲除谷氨酰胺合成酶所得。经验证后，挑取阳性克隆，接种至含不同浓度草铵膦的m9培养基上生长，观察缺陷型大肠杆菌生长情况。
[0141]
以野生型水稻gs1突变体作为负对照，检测含有gs1突变体og61p(g61p，水稻gs1的第61位的氨基酸g突变为p)和og61x(g61δ)的草铵膦抗性；以野生型玉米gs1突变体作为负对照，检测含有gs1突变体zg61p(g61p，玉米gs1的第61位的氨基酸g突变为p)和zg61x(g61δ)的草铵膦抗性；以野生型大豆gs1突变体作为负对照，检测含有gs1突变体gg61p(g61p，大豆gs1的第61位的氨基酸g突变为p)和gg61x(g61δ)的草铵膦抗性；以野生型油菜gs1突变体作为负对照，检测含有gs1突变体bg61p(g61p，油菜gs1的第61位的氨基酸g突变为p)和bg61x(g61δ)的草铵膦抗性。
[0142]
结果如图6所示：在含0mm草铵膦(kp0)的培养基上，转化编码野生型水稻gs1(osgs1_wt)及水稻gs1突变体og61p和og61x的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，转化编码野生型玉米gs1(zmgs1_wt)及玉米gs1突变体zg61p和zg61x的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，转化编码野生型大豆gs1(gmgs1_wt)及大豆gs1突变体gg61p和gg61x的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，转化编码野生型油菜gs1(bngs1_wt)及油菜gs1突变体bg61p的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由og61p、og61x、zg61p、zg61x、gg61p、gg61x和bg61p编码的gs1都具有正常gs1酶活力；
[0143]
在含2mm草铵膦(kp2)的培养基上，转化野生型玉米gs1，野生型大豆gs1，野生型油菜gs1的大肠杆菌不能生长，但转化了玉米突变体zg61p、zg61x，大豆突变体gg61p、gg61x，油菜突变体bg61p、bg61x的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含zg61p、zg61x的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型zmgs1_wt，含gg61p、gg61x的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型gmgs1_wt，含bg61p、bg61x的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型bngs1_wt。
[0144]
在含5mm草铵膦(kp5)的培养基上，转化野生型水稻gs1的大肠杆菌不能生长，但转化了水稻突变体og61p、og61x的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含og61p、og61x的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型osgs1_wt。转化了大豆突变体gg61x的大肠杆菌抗草铵膦的能力明显优于转化了大豆突变体gg61p的大肠杆菌。转化了油菜突变体bg61x的大肠杆菌抗草铵膦的能力明显优于转化了油菜突变体bg61p的大肠杆菌。
[0145]
在含10mm草铵膦(kp10)的培养基上，转化野生型水稻gs1的大肠杆菌不能生长，但
转化了水稻突变体og61p、og61x的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含og61p、og61x的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型osgs1_wt。转化野生型玉米gs1的大肠杆菌不能生长，但转化了玉米突变体zg61p、zg61x的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含zg61p、zg61x的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型zmgs1_wt。
[0146]
这些结果说明og61p、og61x、zg61p、zg61x、gg61p、gg61x、bg61p、bg61x的单突变体都具有抗草铵膦的能力。
[0147]
实验例2
[0148]
检测实施例1提供的og61x、实施例2提供的zg61x、实施例3提供的gg61x突变体的酶动力学参数和在有草铵膦时的酶动力学参数，以野生型水稻gs1 osgs1_wt、野生型玉米gs1 zmgs1_wt、野生型大豆gs1 gmgs1_wt为对照，具体方法如下：
[0149]
1.载体构建：
[0150]
将编码上述突变体的核酸序列克隆到原核表达载体pet32a中，测序验证克隆。
[0151]
2.6his蛋白纯化：
[0152]
通过6his和用标准方法纯化突变体酶蛋白，用bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，蛋白保存在蛋白贮存液中。
[0153]
3.酶活测定：
[0154]
(1)仪器和试剂：酶标仪(德铁：hbs-1096a)，草铵膦，底物l-谷氨酸钠(cas：6106-04-3)。
[0155]
(2)测定原理
[0156]
谷氨酰胺合成酶(gs)是将无机氮转化为有机氮的第一个酶，催化不同来源的氨与谷氨酸结合形成谷氨酰胺，并释放pi，具体反应式下：
[0157][0158]
本发明采用磷钼蓝法测定gs酶活，此法原理为：在适宜的酸性条件下，磷酸(pi)能与钼酸铵作用形成磷钼酸铵，后者又能被还原剂(如维生素c、氯化亚锡等)还原成蓝色的磷钼蓝，其蓝色深浅与磷含量成正比。
[0159]
(2)操作步骤：
[0160]
反应在ph7.5的tris-hcl缓冲系统中进行，反应总体积为30ul。谷氨酰胺合成酶酶活测定反应液组分为：200mm tris-hcl(ph7.5)，1.67mm atp，30mm氯化铵，20mm mgcl2，10mm l-谷氨酸钠。30ul反应液混匀后35℃预热5min后，加入突变体蛋白液开始反应，35℃反应30min后，加入100μl颜色反应d液[d＝2a+b；a液：12％(w/v)抗坏血酸的1mol/l盐酸溶液，b液：2％(w/v)四水钼酸铵的水溶液]产生颜色，静置5min，再加入100μl反应终止f液(2％柠檬酸钠、2％乙酸的水溶液)，静置15min，取200μl在660nm处测定光吸收值。
[0161]
结果如图7所示。根据图7的结果可以看出：
[0162]
相对于野生型对照osgs1_wt、zmgs1_wt、gmgs1_wt，gs1突变体的km值都较之略偏高，说明gs突变体在降低对草铵膦抑制剂的敏感度的同时，略为降低了对正常底物(l-谷氨酸钠)的敏感度。gs1突变体的v
max
均高于野生型对照，说明这些突变体的酶催化能力有所提高。野生型对照对草铵膦很敏感，ic
50
分别为0.006mm、0.006mm、0.005mm，突变体的ic
50
均明显高于野生型对照，og61x、zg61x、gg61x的ic
50
远远高于野生型对照，表明突变体对草铵膦
更不敏感。从突变体ic
50
和野生型ic
50
的倍数关系上也可以看出，og61x、zg61x、gg61x的ic
50
分别是对应野生型gs1 ic
50
的1575倍、2124.167倍、1778倍，这些数值也说明突变体的酶活性远远高于野生型对照。这些数据从酶动力学上说明了突变体的抗草铵膦机制。
[0163]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)以具有seq id no.1所示的参考序列、或以与所述参考序列相比具有至少85％同一性的氨基酸序列的蛋白作为目标蛋白；2)将所述目标蛋白的氨基酸序列与所述参考序列比对，将所述目标蛋白的氨基酸序列对应于所述参考序列第61位氨基酸残基进行突变，突变为脯氨酸或进行删除突变；3)选择草铵膦抗性增强的蛋白。2.一种植物谷氨酰胺合成酶突变体，其具有草铵膦抗性，其特征在于，所述植物谷氨酰胺合成酶突变体如下(1)或(2)所示：(1)：其由来源于植物的野生型谷氨酰胺合成酶的第n位发生突变得到；第n位的位置通过如下方式确定：所述野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，所述野生型谷氨酰胺合成酶的第n位对应于所述参考序列的第61位，其中，所述参考序列的氨基酸序列如seq id no.1所示；与所述野生型谷氨酰胺合成酶相比，所述植物谷氨酰胺合成酶突变体第n位的氨基酸为脯氨酸或删除突变；(2)：其与(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(1)所示的植物谷氨酰胺合成酶突变体在第n位的氨基酸相同。3.根据权利要求1所述的植物谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯；优选地，所述牧草选自禾本科牧草或豆科牧草；优选地，所述芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜；优选地，所述葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；优选地，所述豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆；优选地，所述植物为水稻、玉米、大豆或油菜。4.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求2-3任一项所述的植物谷氨酰胺合成酶突变体。5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子。6.一种重组菌或重组细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体。7.权利要求2-3任一项所述的植物谷氨酰胺合成酶突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体或权利要求6所述的重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物品种中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下任意一种用途：(1)将载体转化目的植物，所述载体含有编码所述植物谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因；(2)通过基因编辑的方法修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码所述植
物谷氨酰胺合成酶突变体；(3)对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变和筛选，使其编码所述植物谷氨酰胺合成酶突变体；优选地，所述基因编辑选自crispr/cas9、talen技术或zfn技术；优选地，所述植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯；优选地，所述牧草选自禾本科牧草或豆科牧草；优选地，所述芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜；优选地，所述葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；优选地，所述豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆；优选地，所述植物为水稻、玉米、大豆或油菜。9.一种产生耐受草铵膦除草剂的植物的方法，其特征在于，包括向目标植物的基因组中引入编码权利要求2-3任一项所述的植物谷氨酰胺合成酶突变体的基因。10.根据权利要求9所述的产生耐受草铵膦除草剂的植物的方法，其特征在于，所述植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯；优选地，所述牧草选自禾本科牧草或豆科牧草；优选地，所述芸薹属蔬菜选自芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜；优选地，所述葫芦科植物选自黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜；优选地，所述豆科植物选自绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆；优选地，所述植物为水稻、玉米、大豆或油菜。

技术总结
本发明公开了一种含G61突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用，涉及基因工程技术领域。谷氨酰胺合成酶突变体原始来源于植物，通过突变后具有草铵膦抗性，还具有良好的生物酶催化活性，转化该谷氨酰胺合成酶突变体的植物不仅具有草铵膦抗性，也能够正常生长和发育。本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体丰富了谷氨酰胺合成酶突变体库，为培育耐草铵膦的植物品种提供了强有力的技术支持。膦的植物品种提供了强有力的技术支持。膦的植物品种提供了强有力的技术支持。


技术研发人员：陈容 邓龙群 侯青江 徐洪健 许立敏 孙顺华 冯阳 胥南飞
受保护的技术使用者：四川天豫兴禾生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/15