β-羟基丁酸在制备促进肝细胞增殖和肝脏再生产品方面的应用

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及β-羟基丁酸在制备促进肝细胞增殖和肝脏再生产品方面的应用。


背景技术：

2.部分肝切除手术(partial hepatectomy，phx)和肝移植是目前临床上各种终末期肝脏疾病最常用且最有效的治疗手段。部分肝切除术或移植术后恢复过程是肝脏再生的过程，肝脏具强大的再生能力是施行部分肝切除和肝移植的生理基础。但如果剩余肝脏的再生能力延缓或不足，则会引发术后肝衰竭等多种综合病症，最终导致预后不良或死亡。有效提高残余肝组织的再生能力，对于提高肝切除和移植术后治疗效果和预后极为重要。因此，深入探讨肝再生的分子机制、靶点和药物干预策略具有重要的科学意义和临床价值。
3.目前虽有多种可促进肝脏再生的药物的报道，但肝脏再生的机制尚不完全清楚，且不同药物促进肝脏再生的机制也不尽相同。β-羟基丁酸(β-hydroxybutyric acid，bhb)是哺乳动物中含量最丰富的酮体物质，易溶于水，具有两种对映异构体：r/d和s/l，其中r-bhb是人类和小鼠代谢的产物。bhb主要在肝脏中由脂肪酸氧化产生，其它组织如肠道中可能产生较少量的bhb。在体内，当葡萄糖供应太低而无法满足身体的能量需求时，脂肪酸会从脂肪细胞中动员并运输到肝脏，被代谢为乙酰乙酸和bhb作为能量来源，且bhb在调节糖异生和肝脏葡萄糖生成中起关键作用。
4.bhb不仅是维持代谢稳态的能量底物，还可以作为信号分子，调节机体的生理和病理过程。有研究发现，重度酒精性肝炎患者的肝脏中bhb水平显著低于正常组。机制研究发现，bhb可与肝巨噬细胞表面羟基羧酸(hydroxycarboxylic acid receptor 2，hcar2)受体结合，增加肝脏白细胞介素10(interleukin 10，il10)转录和促进肝内巨噬细胞的m2表型，从而发挥抗炎和改善酒精诱导的肝损伤作用。另一项研究发现，小鼠禁食12h对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制研究表明禁食12h可增加肝脏中bhb的水平，bhb通过上调乙酰化组蛋白-3，激活转录因子叉头框蛋白o1(forkhead box o1，foxo1)和血红素加氧酶1(antioxidative enzyme heme oxigenase 1，ho-1)，降低高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1，hmgb1)的表达，使核因子κb(nuclear factor kappa-b，nf-κb)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nod-like receptor thermal protein domain associated protein 3，nlrp3)失活，抑制炎症反应，进而改善肝脏缺血再灌注损伤。但目前还未有关于bhb可用于促进肝细胞增殖和肝再生的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供β-羟基丁酸在制备促进肝细胞增殖和肝脏再生产品方面的应用。
6.本发明的第一个目的是提供β-羟基丁酸在制备促进肝脏再生的产品中的应用。
7.本发明的第二个目的是提供β-羟基丁酸在制备促进肝细胞增殖的产品中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供β-羟基丁酸在制备促进肝功能恢复的产品中的应用。
9.本发明的第四个目的是提供一种促进肝脏再生的药物。
10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
11.本发明发现，β-羟基丁酸可以通过促进部分肝切除术后残余肝脏的肝细胞增殖，进而促进肝脏再生和肝重恢复。同时，本发明还发现，β-羟基丁酸可以促进肝生化指标恢复至正常范围，即β-羟基丁酸可以促进肝功能恢复。因此，本发明请求保护β-羟基丁酸的以下应用：
12.本发明请求保护β-羟基丁酸在制备促进肝脏再生的产品中的应用。
13.具体地，所述β-羟基丁酸通过促进肝细胞增殖促进肝脏再生。
14.具体地，所述β-羟基丁酸通过促进肝细胞增殖和肝生化指标恢复至正常范围促进肝脏再生。
15.更具体地，所述β-羟基丁酸通过上调肝细胞增殖相关蛋白的表达促进肝细胞增殖。
16.本发明还请求保护β-羟基丁酸在制备促进肝细胞增殖的产品中的应用。
17.本发明还请求保护β-羟基丁酸在制备促进肝功能恢复的产品中的应用。
18.具体地，所述β-羟基丁酸通过促进肝生化指标恢复至正常范围促进肝功能恢复。
19.具体地，本发明所述肝脏为部分肝切除术后的肝脏。
20.具体地，肝脏切除部分不超过原肝脏体积的2/3。
21.具体地，所述促进肝脏再生、促进肝细胞增殖或促进肝生化指标恢复的产品中包括β-羟基丁酸及其药学上可接受的载体。
22.本发明还提供了一种促进肝脏再生或肝生化指标恢复的药物，所述药物中含有β-羟基丁酸及其药学上可接受的载体。
23.具体地，所述β-羟基丁酸的用量至少为50mg/kg/d。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明发现β-羟基丁酸可以通过促进部分肝切除术后残余肝脏的肝细胞增殖，从而促进肝脏再生和肝重恢复，可将β-羟基丁酸用于制备促进肝脏再生的产品。本发明不仅公开了β-羟基丁酸在促进肝脏再生方面的应用，为开发促进肝再生的产品提供了药物来源，同时也为后续临床上促进肝再生的干预策略提供了理论基础，有助于提高肝脏再生能力，避免部分肝切除或活体肝移植术后肝再生能力不足导致的预后不良及肝衰竭，对提高肝组织再生能力，促进术后肝脏再生具有重要的临床意义。
附图说明
26.图1为给予β-羟基丁酸对于部分肝切除术后肝脏再生的影响结果；图中的a为β-羟基丁酸给药后不同时间点小鼠的肝脏图片；图中的b为β-羟基丁酸给药后不同时间点小鼠的肝重变化情况(n＝6)；图中的c为β-羟基丁酸给药后不同时间点小鼠的肝/体重比变化情况(n＝6)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05。
27.图2为给予β-羟基丁酸对于部分肝切除术后肝脏生化指标的影响结果；图中的a为血清中ast、alt、alp、tbil、tba水平(n＝6)；图中的b为肝组织h&e染色结果(n＝3)；数据表
示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05；比例尺＝50μm。
28.图3为给予β-羟基丁酸对于部分肝切除术后肝细胞增殖的影响结果；图中的a为肝组织ki67染色结果；图中的b为ki67阳性细胞定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05，**p《0.01；比例尺＝50μm。
29.图4为给予β-羟基丁酸对于部分肝切除术后肝细胞增殖相关蛋白表达的影响结果；图中的a为肝组织中ccna1、ccnd1、ccne1和cdk4蛋白的表达检测结果，图中的b为增殖相关蛋白表达的定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05。
具体实施方式
30.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
31.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
32.本发明实施例中所用β-羟基丁酸购自medchemexpress(mce)，产品货号为hy-113378。
33.本发明实施例中所用实验动物为c57bl/6小鼠，雄性，周龄7周，体重20～23g，购于广东药康生物科技有限公司，动物合格证号scxk(粤)2020-0054；检验检疫后饲养于南方医科大学实验动物中心；饲养的标准实验条件：温度22～25℃，湿度55～70％，光照黑暗循环各12h，光照8:00～20:00；黑暗20:00～次日8:00，自由摄取水和食物，用南方医科大学实验动物中心提供的普通饲料适应性喂养1周；所述动物研究方案符合南方医科大学实验动物伦理委员会要求。
34.本发明的实验数据均以平均值
±
标准误差(mean
±
s.d.)进行统计，使用spss 20.0软件对数据进行统计分析；蛋白条带灰度检测使用image j 1.53软件进行处理；采用one-way anova进行多样本均数比较和方差分析，student’s t test进行两组间比较分析；采用graphpad prism 8.0软件进行图表绘制；p《0.05代表两者间具有统计学意义，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
35.实施例1β-羟基丁酸加速部分肝切除术后小鼠肝重恢复
36.1、实验方法
37.(1)β-羟基丁酸(bhb)溶液配制
38.200mg bhb加入20ml pbs，充分溶解，混匀，制成10mg/ml bhb腹腔注射溶液；分装于1.5ml离心管中，-20℃保存，避免反复冻融。
39.(2)部分肝切除(phx)手术
40.本发明利用部分肝切除手术构建了2/3phx小鼠模型，手术步骤如下所示：
41.1)将所有手术器械和小鼠缝合钉进行高压灭菌消毒；
42.2)小鼠麻醉：采用3.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为350mg/kg；
43.3)开腹：用医用胶布将小鼠四肢固定于手术板上，去掉胸腹部鼠毛，腹部用碘伏消毒，用手术剪沿腹中线剪开至剑突下约1cm的开口；
44.4)切除肝叶：用手轻轻挤压小鼠切口两侧将左前叶、右前叶和左后叶挤出腹部切口，将4-0缝合线置于左前叶底部进行外科打结法结扎，用剪刀小心剪去结扎的肝叶和多余
的缝合线，用棉签吸去腹腔中的血液。右前叶和左后叶同左前叶的切除方法一样；约切除肝脏总体积的2/3；
45.5)缝合：用镊子将开口两边腹膜和皮肤提起，利用9mm缝合钉把开口两边的腹膜和皮肤一起钉住；给小鼠皮下注射1ml生理盐水，将其置于温暖环境中促其苏醒。
46.手术注意事项：
47.1)结扎3叶的根部时一定要扎紧，否则肝脏出血导致小鼠死亡，但注意不要由于用力过大导致肝叶直接勒烂；
48.2)结扎3叶的根部时注意不要结扎到胆囊，否则会导致胆囊破裂影响小鼠肝系统；
49.3)手术操作时注意无菌，防止术后感染导致小鼠死亡；
50.4)肝叶结扎后，尽量剪去多余的肝组织，减小残余肝组织。但要避免剪断结扎线，否则会使小鼠肝脏出血导致死亡。
51.(3)动物实验方案
52.c57bl/6雄性小鼠，随机分为2组；分别为phx给pbs组(vehicle组)和phx给β-羟基丁酸组(bhb组)；实验期间记录小鼠每天的进食量和体重。
53.实验第1～3天，vehicle组小鼠腹腔注射pbs，β-羟基丁酸组小鼠腹腔注射bhb(50mg/kg/d)；注射体积为0.1ml/10g。
54.实验第4天，2组小鼠均进行phx手术，术后继续腹腔注射pbs或bhb(50mg/kg/d)，直到实验结束；注射体积为0.1ml/10g。
55.实验期间记录小鼠每天的进食量和体重。另分别于术后0d、1d、2d和5d每组随机抽取6只小鼠，称量此时间点的小鼠体重并记录，同时收集每只小鼠粪便，液氮速冻后转移置-80℃冰箱保存。摘取眼球取血并颈椎脱臼处死小鼠，剖腹，取出肝脏，去除坏死组织，用生理盐水涮洗肝脏表面血液，滤纸吸干表面水分，称量肝脏重量并记录，摆放好直尺拍摄立体肝脏照片；每一份肝脏样本取同一叶肝脏部位大致分为相同的两块肝组织，一份固定于4％多聚甲醛溶液中，做后续h&e和ki67染色实验，剩余肝脏组织装入ep管中，置于-80℃冰箱保存；取出小肠、盲肠、盲肠内容物及结直肠，装入ep管中，置于-80℃冰箱保存。
56.2、实验结果
57.本发明通过2/3部分肝切除(phx)小鼠模型考察了给予β-羟基丁酸(bhb)对于phx术后肝脏再生的影响，结果如图1所示；图1中的a为bhb给药后不同时间点小鼠肝脏图片；图1中的b为bhb给药后不同时间点小鼠肝重变化情况(n＝6)；图1中的c为bhb给药后不同时间点小鼠肝/体重比变化情况(n＝6)。由图1可知，在phx术后不同时间点，vehicle组和bhb组小鼠肝重分别为：0d(0.38
±
0.02g、0.37
±
0.05g)、1d(0.44
±
0.04g、0.48
±
0.03g)、2d(0.47
±
0.07g、0.56
±
0.07g)和5d(0.63
±
0.05g、0.70
±
0.05g)；肝/体重比分别为：0d(1.8％、1.7％)、1d(2.1％、2.3％)、2d(2.3％、2.9％)和5d(3.1％、3.6％)；可知，两组小鼠的肝体积、肝重和肝/体重比随着phx术后时间延长而增加；在phx术后1d，两组小鼠肝体积，肝重和肝/体重比无显著差异，但在术后2d和5d，相比于vehicle组，bhb组小鼠肝体积、肝重和肝/体重显著增加，表明bhb可加速小鼠phx术后肝重恢复。
58.实施例2β-羟基丁酸加速部分肝切除术后小鼠肝脏生化指标恢复正常
59.1、实验方法
60.(1)血清生化指标检测
61.将收集的vehicle组和bhb组小鼠血液置于室温下静置40min，于4℃条件下，3000rpm离心10min，吸取上层血清用于生化指标检测；使用全自动血清生化仪检测血清中门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，ast)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，alt)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)、总胆红素(total bilirubin，tbil)和总胆汁酸(total bile acid，tba)含量。
62.(2)肝脏组织h&e染色
63.肝组织于4％多聚甲醛固定24h后送至武汉塞维尔科技有限公司进行石蜡包埋、脱水、切片以及h&e染色。
64.2、实验结果
65.本发明通过2/3部分肝切除(phx)小鼠模型考察了给予β-羟基丁酸(bhb)对于phx术后肝脏肝功能的影响，结果如图2所示；图2中的a为血清中ast、alt、alp、tbil、tba水平(n＝6)，图2中的b为肝组织h&e染色结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05；比例尺＝50μm。血清生化指标检测发现，两组血清样品中ast、alt、alp、tbil、tba含量在phx后1d达到峰值，之后随肝再生逐渐恢复至初始水平，但两组间无显著差异；但与vehicle组相比，给予bhb显著降低术后2d血清中alt水平(480.3
±
82.8u/l对比334.3
±
66.1u/l)和术后1d alp水平(200.3
±
15.6u/l对比165.3
±
17.5u/l)(图2中的a)。肝组织h&e染色结果发现肝细胞和肝窦未发现明显损伤(图2中的b)；以上结果表明给予bhb加速phx术后小鼠肝脏生化指标恢复正常。
66.实施例3β-羟基丁酸促进部分肝切除术后小鼠肝细胞增殖
67.1、实验方法
68.(1)肝脏组织ki67染色
69.ki67蛋白在细胞核表达，其水平能够准确的反映肝细胞增殖水平。肝脏组织ki67染色过程如下所示：
70.1)脱蜡复水：将石蜡切片依次放入二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ5min
→
二甲苯ⅲ5min
→
50％无水乙醇/50％二甲苯1min
→
无水乙醇ⅰ1min
→
无水乙醇ⅱ1min
→
95％酒精2min
→
80％酒精2min
→
70％酒精2min，将切片取出，用蒸馏水洗涤3次，5min/次；
71.2)抗原修复：染缸中加0.01mol/l枸橼酸溶液没过切片，于微波炉中高火加热至沸腾后加盖，转中低火加热11min，结束后取出，室温冷却；
72.3)pbs漂洗：切片冷却至室温后，弃掉抗原修复液，加入pbs缓冲液没过切片，于水平摇床上漂洗3次，80r/min，5min/次；
73.4)内源性过氧化酶阻断：pbs缓冲液漂洗过后，用滤纸吸干多余的pbs,用免疫组化笔画圈标记组织，滴加3％过氧化氢溶液覆盖组织，置于湿盒中，室温避光孵育15min；使用pbs缓冲液于水平摇床上漂洗3次，80r/min，5min/次；
74.5)封闭：在圈内滴加10％山羊血清，室温下湿盒中封闭1h；
75.6)一抗孵育：用滤纸擦去多余的山羊血清，切勿碰到组织，按照一抗说明书稀释抗体，将抗体稀释液滴加在组织上，放入湿盒中4℃孵育过夜；
76.7)二抗孵育：轻轻甩掉玻片上的一抗，放入染缸中，加入pbs缓冲液于摇床上漂洗3次，5min/次；用滤纸吸干玻片上多余的pbs，滴加相应的二抗并于湿盒中室温孵育1h，使用pbs缓冲液于摇床上漂洗3次，5min/次；
77.8)dab显色液配置：玻片漂洗期间按照每1ml b液滴加一滴a液的比例配置dab工作液，现用现配；
78.9)dab显色：将dab工作液滴加到组织上，于显微镜下观察至阳性区域显色，记录显色所需要的时间，结束后将切片放入含有蒸馏水的染缸中终止显色；
79.10)苏木素染细胞核：将切片置于苏木素染液中浸泡1～5s，流水冲洗至不变色，再用盐酸酒精分化1～2s，自来水洗涤，然后用1％氨水浸泡破片3min返蓝，再次自来水洗涤。
80.11)脱水封片：将切片依次放入70％乙醇2min
→
80％乙醇2min
→
95％乙醇2min
→
无水乙醇ⅰ1min
→
无水乙醇ⅱ1min
→
50％无水乙醇/50％二甲苯1min
→
二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ5min
→
二甲苯ⅲ5min中脱水，将切片从二甲苯中拿出，立即在组织上滴加中性树脂，盖上盖玻片，封片时避免产生气泡，晾干切片，于显微镜下拍照。
81.2、实验结果
82.给予β-羟基丁酸(bhb)对于部分肝切除(phx)术后肝细胞增殖的影响结果如图3所示；图3中的a为肝组织ki67染色结果，图3中的b为ki67阳性细胞定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05，**p《0.01；比例尺＝50μm。由图3可知，phx术后1d，vehicle组和bhb组小鼠的肝组织中未观察到ki67表达；术后2d，bhb组ki67阳性细胞数达到峰值(阳性细胞百分比为24.3％)，显著高于vehicle组(阳性细胞百分比为11.5％)；phx术后5d，ki67阳性细胞数明显减少，但bhb组(阳性细胞百分比为10.3％)仍高于vehicle组(阳性细胞百分比为4.2％)；结果表明给予bhb显著增加phx后小鼠肝细胞增殖。
83.实施例4β-羟基丁酸上调部分肝切除术后小鼠肝脏中增殖相关蛋白表达
84.1、实验方法
85.本发明进一步检测了部分肝切除术后vehicle组和p.distasonis组肝组织中细胞周期蛋白a1(cyclin a1，ccna1)、d1(cyclin d1，ccnd1)、e1(cyclin e1，ccne1)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，cdk4)的表达水平。ccna1和ccnd1的表达是肝细胞进入细胞周期s期的主要标志物；ccne1和cdk4调控细胞周期g1期向s期转变。蛋白质免疫印记的主要步骤如下所示：
86.(1)肝脏组织总蛋白提取
87.1)将肝组织从-80℃冰箱中取出，放于冰上解冻；
88.2)标记匀浆管并在匀浆管中放入2粒陶珠；
89.3)称取30mg左右的肝组织，放入匀浆管中，加入500μl蛋白ripa裂解液(用前按1：100比例加入pmsf和磷酸酶抑制剂)，拧紧匀浆管盖；
90.4)将匀浆管放入匀浆器中，匀浆2次；
91.5)匀浆结束后冰上静置20min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中，4℃、16000g离心30min；
92.6)离心结束后，将200μl上清液转移至新的1.5ml离心管中，使用bca试剂盒测定蛋白浓度。
93.(2)bca法蛋白浓度测定
94.1)将浓度为2000μg/ml的牛血清白蛋白标准品用pbs缓冲液分别稀释成1000、500、250、125和62.5μg/ml；
95.2)吸取10μl待测样本原液，加入290μl pbs缓冲液，将待测样本稀释30倍；
96.3)按照+2的检测样品量配置bca工作液，将bca试剂a和试剂b按照50：1的比例混合，然后将bca工作液加入到96孔板中(避免产生气泡)，200μl/孔；
97.4)将25μl稀释的蛋白标准品和样本加入到96孔板对应孔中，轻拍混匀；
98.5)将96孔板放置于37℃隔水式电热恒温培养箱中反应30min；
99.6)使用多功能酶标仪在562nm波长处测量标准品和待测样品的od值；
100.7)根据稀释的蛋白标准品浓度和测得的od值绘制标准曲线，然后根据该曲线计算待测样品的蛋白浓度；
101.8)根据计算得到的样本蛋白浓度，用双蒸水和5
×
loading buffer稀释蛋白浓度至2μg/μl，将配制后的蛋白样品放在100℃的干式恒温器中，加热10min使蛋白变性，冷却至室温后，于-80℃冰箱保存。
102.(3)蛋白质免疫印迹实验
103.1)配置分离胶，用无水乙醇压平液面，等待30min至分离胶凝固；
104.2)弃掉无水乙醇，用滤纸吸干多余的无水乙醇；配置浓缩胶，小心快速的加入到胶板中，尽量避免产生气泡，然后插入15孔梳，等待30min至浓缩胶凝固，将制备好的凝胶浸泡于电泳液中，4℃冰箱保存备用；
105.3)上样：将蛋白样品从-80℃冰箱取出，放在100℃干式恒温器加热2min解冻样品，涡旋混匀，瞬离；将凝胶版装入电泳架中，加入电泳液，轻轻拔出15孔梳；用上样枪头在相应泳道中加入15μl蛋白样品以及3μl蛋白marker，放入电泳槽中准备电泳；
106.4)电泳：完成上样后，盖上转印槽盖子，接通电源(注意正负极：红对红，黑对黑)，恒压70v电泳30min后，再转换电压为120v，继续电泳，待loading buffer蓝色指示带跑到胶板底部时，即可停止电泳；
107.5)电转：将裁剪好的pvdf膜浸泡在甲醇中活化；取出胶板，切下目的蛋白凝胶，电转夹从负极到正极依次放置海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵，注意膜与胶之间产生不要有气泡；接通电源，恒流230a条件下电转；根据蛋白的分子量设置电转时间，70kd以下蛋白电转75min，70kd以上蛋白电转90min，90kd以上蛋白电转120min，120kd以上蛋白电转150min；
108.6)封闭：转膜结束后，取出转膜夹，将pvdf膜置于5％脱脂牛奶中，水平摇床上室温封闭1h；
109.7)一抗孵育：封闭结束后取出pvdf膜，tbst涮洗去除残留牛奶，放于对应的一抗稀释液中，4℃孵育过夜；
110.8)二抗孵育：将膜取出，tbst洗膜3次，10min/次；室温孵育相应二抗1h；再取出膜，用tbst洗膜3次，10min/次；
111.9)显影：打开化学发光仪，使仪器预冷至工作温度；将a、b液等体积混合置成显影液，用滤纸吸干pvdf膜上多余的tbst，完全浸泡在显影液中5～10s，然后放入化学发光仪中显影。
112.2、实验结果
113.给予β-羟基丁酸(bhb)对于部分肝切除(phx)术后肝组织中与肝细胞增殖相关蛋白表达的影响结果如图4所示；图4中的a为肝组织中ccna1、ccnd1、ccne1、cdk4蛋白表达检
测结果，图4中的b为增殖相关蛋白表达的定量结果(n＝3)；数据表示为平均值
±
标准差；与vehicle组相比，*p《0.05，**p《0.01。由图4可知，相比vehicle组，bhb组ccna1蛋白的表达在phx术后2d显著增加，上调了1.7倍，在术后5d下降至初始水平。ccnd1蛋白表达在phx术后1d显著上调，上调了2.0倍；ccne1蛋白表达在phx术后2d和5d均显著增加，分别上调了2.1和1.9倍。但cdk4蛋白表达在术后各个时间点均无显著差异。上述结果表明给予bhb能够上调phx术后肝脏中增殖相关蛋白表达。
114.本发明通过肝脏组织ki67染色和蛋白质免疫印记分析了β-羟基丁酸是否是通过促进肝细胞增殖来促进phx术后肝再生进程。由上述结果可知，β-羟基丁酸可通过上调phx术后肝脏中增殖相关蛋白表达，促进肝细胞增殖，进而促进肝脏再生。
115.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.β-羟基丁酸在制备促进肝脏再生的产品中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述β-羟基丁酸通过促进肝细胞增殖和肝脏生化指标恢复正常，从而促进肝脏再生。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述β-羟基丁酸通过上调肝细胞增殖相关蛋白的表达促进肝细胞增殖。4.β-羟基丁酸在制备促进肝细胞增殖的产品中的应用。5.β-羟基丁酸在制备促进肝功能恢复的产品中的应用。6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肝脏为部分肝切除后的肝脏。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，肝脏切除部分不超过原肝脏体积的2/3。8.根据权利要求1、4或5所述应用，其特征在于，所述产品包括β-羟基丁酸及其药学上可接受的载体。9.一种促进肝脏再生或肝功能修复的药物，其特征在于，所述药物中含有β-羟基丁酸。10.根据权利要求9所述药物，其特征在于，所述药物中还含有β-羟基丁酸药学上可接受的载体。

技术总结
本发明公开了β-羟基丁酸(β-hydroxybutyric acid，BHB)在制备促进肝细胞增殖和肝脏再生产品方面的应用。本发明发现β-羟基丁酸可以通过促进部分肝切除术后残余肝脏的肝细胞增殖，从而促进肝脏再生和肝重恢复，可将β-羟基丁酸用于制备促进肝脏再生的产品。本发明不仅公开了β-羟基丁酸在促进肝脏再生方面的应用，为开发促进肝再生的产品提供了药物来源，同时也为后续临床上促进肝再生的干预策略提供了理论基础，有助于提高肝脏再生能力，避免部分肝切除或活体肝移植术后肝再生能力不足导致的预后不良及肝衰竭。生能力不足导致的预后不良及肝衰竭。生能力不足导致的预后不良及肝衰竭。


技术研发人员：毕惠嫦 郭曼岚 江晓雯 杨潇
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/15